本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种内皮祖细胞的制备方法。本申请要求2018年1月23日提交的中国专利(专利申请号为201810064126.3)的权益，在此将上述申请的全部内容引用并入本文。
背景技术：
内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，epcs)不仅存在于胚胎发育阶段，也存在于成体。内皮祖细胞的来源有外周血、骨髓、脐血，其中脐血中内皮组组细胞含量比外周血高，并且脐血获取内皮组祖细胞具有无损伤性，是较理想的内皮组祖细胞来源。内皮祖细胞在维持血管壁的完整性、调节微血管通透性和血液的流动性等方面具有重要作用。内皮祖细胞分化功能丧失，可能引起血栓形成、动脉粥样硬化及脏器、组织水肿。建立血管内皮组祖细胞系能够为体外研究血管形成提供重要的研究载体。内皮祖细胞在体内受机体调控，迅速形成新的血管，极大的提高移植脂肪的存活率，是体外美容整形兴起的生物材料。目前获取内皮祖细胞的主要方法为ficoll分离法，但是该分离方法获取的细胞种类多，不能有效的获得纯度较高的细胞。此外，获得的细胞在原代培养时，细胞增殖速度较慢，培养周期长，细胞在体外培养过程中，容易出现分化现象。技术实现要素：本发明提供一种内皮祖细胞的制备方法，用于解决现有制备方法获得的内皮祖细胞纯度低、活力低、易出现分化的问题。本发明的技术方案如下：一种内皮祖细胞的制备方法，包括：a)将脐血进行分离，得到单个核细胞；b)将所述单个核细胞进行细胞培养，得到扩增细胞；c)将所述扩增细胞进行分选，得到内皮祖细胞，在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。优选的，步骤a)所述分离为ficoll密度梯度离心法分离；所述ficoll密度梯度离心法分离的离心力为200～500g；所述ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为15～30min。优选的，步骤a)所述脐血的离体时间为5～7h。优选的，步骤c)所述分选为磁珠分选；所述磁珠分选中，磁珠与所述扩增细胞的比例为每107～8个细胞加入20～50μl磁珠。优选的，所述磁珠分选具体为磁珠分选cd34+cd133+细胞。优选的，步骤b)所述单个核细胞的细胞密度为3～6×106cells/ml。进一步的，步骤b)将所述单个核细胞进行细胞培养之后，得到扩增细胞之前，还包括：筛选贴壁细胞。进一步的，步骤c)之后还包括：进行流式检测。优选的，步骤c)所述培养体系包括：无血清培养基、无血清替代物、5～20ng/mlsdf-1、10ng/mlegf和5～20ng/mligf。本发明还提供上述技术方案所述培养体系在制备内皮祖细胞中的应用。综上所述，本发明提供了一种内皮祖细胞的制备方法，包括：a)将脐血进行分离，得到单个核细胞；b)将所述单个核细胞进行细胞培养，得到扩增细胞；c)将所述扩增细胞进行分选，得到内皮祖细胞，在培养体系中将所述内皮祖细胞进行扩增。实验结果表明，本发明制备方法能够在短时间内获得数量充足的内皮祖细胞，获得的内皮祖细胞纯度高、活力好、不容易出现分化。具体实施方式本发明提供了一种内皮祖细胞的制备方法，用于解决现有制备方法获得的内皮祖细胞纯度低、活力低、易出现分化的问题。下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一种内皮祖细胞的制备方法，包括：a)将脐血进行分离，得到单个核细胞；b)将单个核细胞进行细胞培养，得到扩增细胞；c)将扩增细胞进行分选，得到内皮祖细胞，在培养体系中将内皮祖细胞进行扩增。现有技术体外培养内皮祖细胞，内皮祖细胞容易出现分化，不利于回输后血管的形成。本发明制备方法获得的内皮祖细胞不容易出现分化，并且本发明制备方法能够在短时间内获得数量充足的内皮祖细胞，获得的内皮祖细胞纯度高、活力好。本发明中，步骤a)分离为ficoll密度梯度离心法分离；所述ficoll密度梯度离心法分离的离心力为200～500g；所述ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为15～30min。本发明中，步骤a)脐血的离体时间为5～7h。脐血离体时间的长短和数量直接影响内皮祖细胞的获取率，步骤a)脐血的离体时间为5～7h。本发明中，步骤c)分选为磁珠分选；所述磁珠分选中，磁珠与所述扩增细胞的比例为每107～8个细胞加入20～50μl磁珠。本发明中，磁珠分选具体为磁珠分选cd34+cd133+细胞。本发明制备方法增加了磁珠分选再进行内皮祖细胞的扩增，能够获得纯度一致的细胞群。本发明中，步骤b)单个核细胞的细胞密度为3～6×106cells/ml。进一步的，步骤b)将单个核细胞进行细胞培养之后，得到扩增细胞之前，还包括：筛选贴壁细胞。进一步的，步骤c)之后还包括：进行流式检测。培养条件是获得内皮祖细胞至关重要的因素。现有技术中，通过酶解脐静脉内皮细胞，获得的细胞活率受酶解液影响，往往活率较低，而且细胞种类较多。本发明采用ficoll密度梯度离心法对脐血进行单个核细胞的分离，然后进行细胞培养，得到扩增细胞，再将扩增细胞进行磁珠分选，获得目标细胞后，进行内皮祖细胞大规模扩增。本发明所获得的细胞污染率极低，操作简单，能够显著提高分离效率，优化了提取条件分离的条件，获得数量大、纯度一致的内皮祖细胞。与现有技术相比，本发明采用了先扩增后筛选的实验步骤，该方法操作步骤简单，目标细胞获取率高，细胞起始数量足够、有利于后期细胞大规模扩增。此外，本发明优化了培养体系，大大缩短了培养周期。本发明脐血离体后采用低温保存，离体时间为3h，保证提取出活性高的细胞。本发明先进行单个核细胞的贴壁细胞和悬浮细胞的分离，对贴壁细胞进行扩增培养，提高目标细胞的含量，使得分选后，目标细胞数量增多，极大的利于扩增培养。本发明实验操作时间短，细胞获取量大。本发明中，步骤c)培养体系包括：无血清培养基、无血清替代物、5～20ng/mlsdf-1、10ng/mlegf和5～20ng/mligf。现有培养体系为dmem高糖基础培养基和10％fbs及适量的抗生素，但使用现有培养体系培养内皮祖细胞，内皮祖细胞容易出现分化不增殖。本发明培养体系能够避免内皮祖细胞分化并使内皮祖细胞增殖速度加快。本发明还提供上述技术方案培养体系在制备内皮祖细胞中的应用。实施例1在医院内获取50～70ml人脐血，在3h内使用ficoll梯度离心法对脐血进行分离，得到单个核细胞。ficoll梯度离心法分离的离心力为300g；ficoll密度梯度离心法分离的离心时间为20min。使用dmem高糖培养基+10％fbs重悬单个核细胞，调整细胞密度为3×106cells/ml，接种于10cm平皿，细胞悬液10ml/皿。于48h后，去掉上清，筛选得到贴壁细胞。用pbs清洗贴壁细胞1～2遍后，加入dmem高糖培养基+10％fbs，继续培养已贴壁的细胞，得到扩增细胞。待扩增细胞融合率达70％左右，加入0.25％胰酶-0.02％edta消化细胞，制备形成细胞悬液。通过磁珠筛选出cd34+cd133+的细胞，每107个细胞加入25μl磁珠，筛选得到内皮祖细胞。实施例2将实施例1分选后的内皮祖细胞在包括无血清培养基(lonza，ultraculturemedium12-725f)、无血清替代物(pall，ultroserg)、5～20ng/mlsdf-1、10ng/mlegf、5～20ng/mligf的培养体系中进行扩增培养。实施例3对三组实施例1(本发明)磁珠分选后的内皮祖细胞进行数量及活力检测。按细胞悬液与0.4％台盼蓝的体积比1:1于细胞计数板中，进行细胞计算，活细胞拒染，死细胞被染成蓝色。检测结果如表1所示，50～70ml的脐血中内皮祖细胞的数量为1×106个，细胞活率均在90％以上，说明本发明对单个核细胞进行细胞培养的培养体系适于细胞的增殖。表1初次培养所获得的内皮祖细胞数量组别活细胞数总细胞数细胞活率第一组1.00×106cells1.09×106cells92.03％第二组1.22×106cells1.27×106ells96.47％第三组1.07×106cells1.19×106cells90.82％实施例4对三组实施例1分选后实施例2扩增的内皮祖细胞(本发明)和三组干细胞扩增培养基扩增后转移到内皮祖细胞培养基培养的内皮祖细胞进行流式检测。本发明和对比例分离及扩增培养或扩增及转移培养的时间均为20天。实验结果如表2和表3所示，本发明所获得的内皮祖细胞的数量比对比例少，但本发明所获得的内皮祖细胞的细胞活率比对比例高。纯度检测表明本发明的细胞纯度达到98.0％以上，远高于对比例的80％以上，说明了本方法能有效的维持内皮祖细胞的干性，培养的细胞未出现分化，而对比例的细胞已经出现了分化，实际的细胞群为：内皮祖细胞和已分化的细胞。表2两方法扩增培养所获得的内皮祖细胞数量和活率活细胞数总细胞数细胞活率本发明①1.00×108cells1.02×108cells98.15％*#本发明②1.15×108cells1.18×108cells97.29％*#本发明③1.05×108cells1.07×108cells98.07％*#对比例①1.28×108cells1.38×108cells92.70％对比例②1.48×108cells1.54×108cells96.42％对比例③1.27×108cells1.31×108cells97.28％表3两种方法扩增培养所获得的内皮祖细胞的纯度cd34+cd133+本发明①99.5％*#◆本发明②98.1％*#◆本发明③97.7％*#◆对比例①86.4％对比例②80.2％对比例③83.6％*表示本发明与对比例①相比，具有极显著差异，p<0.05；#表示本发明与对比例②相比，具有极显著差异，p<0.05；◆表示本发明与对比例③相比，具有极显著差异，p<0.05。实施例5将实施例1分选后的内皮祖细胞在本发明培养体系，即包括无血清培养基(lonza，ultraculturemedium12-725f)、无血清替代物(pall，ultroserg)、5～20ng/mlsdf-1、10ng/mlegf、5～20ng/mligf的培养体系(本发明④、本发明⑤和本发明⑥)和现有培养体系dmem高糖基础培养基+10％fbs(对比例④)、dmem/f12基础培养基+10％fbs(对比例⑤)、1640基础培养基+10％fbs(对比例⑥)中进行扩增培养。待内皮祖细胞长至融合度达80％～85％时，取1～3×106cell进行流式检测。具体步骤为：取内皮祖细胞悬液用含10％fbs的pbs清洗两遍；分成两管细胞，用10％fbs的pbs重悬，其中一管(样品组)加入2.5μlcd34、cd133的抗体，充分混匀，另一管(对照组)不添加抗体，同时闭光孵育30min，用10％fbs的pbs洗两遍后，用1640培养基重悬，上流式仪检测cd34+cd133+细胞的含量。纯度检测表明，与对比例④相比，本发明④～⑥的纯度高于对比例④，且均具有极显著差异，说明本发明获得的细胞纯度远远高于对比例④；与对比例⑤相比，本发明④～⑥的纯度高于对比例⑤，且均具有极显著差异，说明本发明获得的细胞纯度远远高于对比例⑤；与对比例⑥相比，本发明④～⑥的纯度高于对比例⑥，且均具有极显著差异，说明本发明获得的细胞纯度远远高于对比例⑥；本发明④～⑥所获得的细胞纯度均高于对比例④～⑥，且具有极显著差异。本发明培养体系的细胞纯度达到98.0％以上，远高于对比例，说明了本发明培养体系能有效的维持内皮祖细胞的干性，培养的细胞未出现分化，而对比例的细胞已经出现了分化，实际的细胞群为：内皮祖细胞和已分化的细胞。表4两种培养体系扩增培养所获得的内皮祖细胞的纯度cd34+cd133+本发明④95.7％本发明⑤98.1％本发明⑥97.3％对比例④64.8％对比例⑤70.4％对比例⑥69.6％*表示本发明与对比例④相比，具有极显著差异，p<0.001；#表示本发明与对比例⑤相比，具有极显著差异，p<0.001；◆表示本发明与对比例⑥相比，具有极显著差异，p<0.001。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12