本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及了一种黄热病毒重组抗原的制备及其试剂盒制作方法。
背景技术：
：黄热病毒(YellowFeverVirus，YFV)属于黄病毒科的黄病毒属，病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，有几个不同基因型，但是仅有一个血清型，抗原性保守。黄热病毒颗粒含有三种结构蛋白，大表面糖蛋白G，核外壳蛋白C，及表面蛋白M。黄热病是一种区域性疾病，在南美洲热带地区、撒哈拉以南的非洲发病率较高，主要通过埃及伊蚊(Aedesaegypti)的叮咬在灵长类动物或人之间传播。黄热病毒感染的检测主要依靠核酸及血清学方法。血清学方法主要检测黄热病毒的特异性抗体，不仅可用于病原监测，还可用于监测机体的免疫反应过程，以及评价疫苗的接种效果。目前所用的黄热病毒感染的血清学检测方法，主要还是利用全病毒作为检测抗原的免疫荧光法，将体外培养的黄热病毒固定在玻片上，与样本血清共同孵育后，加入荧光素标记抗体，通过显微镜下观察荧光强弱进行阴阳性判断。该方法以天然病毒作为检测抗原，结果较为准确，但抗原片制备过程复杂，在抗原制备过程中还存在操作者被感染的风险。而且，由于不同虫媒病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种虫媒病毒流行的区域，患者因为混合感染导致体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。同时，由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染也十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。因此，随着分子生物学技术的不断发展，获得纯度高、特异性强的基因工程重组抗原是重要的方向。此外采用Western-blot方法制成的试剂盒，一般常规实验室均可完成，不需要特殊设备，判读也简单明了。而现市售的Western-blot试剂均为进口试剂，价格昂贵。技术实现要素：本发明针对现有技术中制备程序繁琐、试剂昂贵的缺点，提供了一种黄热病毒重组抗原的制备及其试剂盒制作方法。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：一种黄热病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：步骤一，选取抗原片段根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，并在正向引物和反向引物5’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点，正向引物：5’-TAGGAATTCTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCC-3’，反向引物：5'-GACAAGCTTCTATTACTTTCCTATTGAGCTTCCCT-3’；步骤二，黄热病毒RNA的提取黄热病毒17D株经BHK-21细胞培养3d后，收集培养物的上清液，4℃条件下，10000g离心10min，收集沉淀物，加入5-10倍体积Trizol液，混匀后，4℃条件下静置5min，然后加入氯仿，摇荡15s，取第一上层水相加入水饱和酚，摇荡20s，取第二上层水相加入异丙醇，4℃条件下放置10min，4℃条件下，12000g离心10min后，取第一次沉淀，加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，再取第二次沉淀加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，得到黄热病毒RNA，室温下干燥6min后，将黄热病毒RNA溶于水中；步骤三，PCR扩增黄热病毒RNA反转录得到cDNA，然后进行PCR扩增：取cDNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，正向引物、反向引物各2μL、dNTP8μL、LATaq2U，补水至总体积50μL进行PCR扩增，扩增片段经纯化、回收后，-20℃保存备用；步骤四，原核表达载体的构建通过BamHI和HindIII对pET28a载体和回收后的扩增片段进行限制性酶切和连接，得到重组质粒；步骤五，重组质粒的诱导表达设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a-17D的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳分析。作为优选，步骤二中，氯仿的添加量为Trizol液体积的1/5，水饱和酚的添加量为Trizol液体积的1/3，异丙醇的添加量为Trizol液体积的1/2，75％乙醇的第一次添加量为Trizol液体积的1.5倍，75％乙醇的第二次添加量为Trizol液体积的1.2倍。作为优选，步骤三中PCR的反应参数为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸90s，共32次循环，最后一次循环后72℃延伸7min。作为优选，步骤四中还包括对重组质粒的鉴定：重组质粒转化大肠杆菌L1-Blue感受态细胞，涂布于含有100mg/mL氨苄西林的琼脂平板上，在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG的琼脂平板上筛选重组质粒和非重组质粒。一种黄热病毒重组抗原试剂盒的制作方法，黄热病毒重组抗原试剂盒包括PVC板、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被黄热病毒重组抗原，对照线上包被IgM抗体，以及辣根过氧化物酶标记的抗人μ链抗体和底物，包括以下步骤：步骤1，黄热病毒重组抗原的制备(11)、选取抗原片段根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，并在正向引物和反向引物5’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点，正向引物：5’-TAGGAATTCTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCC-3’，反向引物：5'-GACAAGCTTCTATTACTTTCCTATTGAGCTTCCCT-3’；(12)、黄热病毒RNA的提取黄热病毒17D株经BHK-21细胞培养3d后，收集培养物的上清液，4℃条件下，10000g离心10min，收集沉淀物，加入5-10倍体积Trizol液，混匀后，4℃条件下静置5min，然后加入氯仿，摇荡15s，取第一上层水相加入水饱和酚，摇荡20s，取第二上层水相加入异丙醇，4℃条件下放置10min，4℃条件下，12000g离心10min后，取第一次沉淀，加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，再取第二次沉淀加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，得到黄热病毒RNA，室温下干燥6min后，将黄热病毒RNA溶于水中；(13)、PCR扩增黄热病毒RNA反转录得到cDNA，然后进行PCR扩增：取cDNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，正向引物、反向引物各2μL、dNTP8μL、LATaq2U，补水至总体积50μL进行PCR扩增，扩增片段经纯化、回收后，-20℃保存备用；(14)、原核表达载体的构建通过BamHI和HindIII对pET28a载体和回收后的扩增片段进行限制性酶切和连接，得到重组质粒；(15)、重组质粒的诱导表达设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a-17D的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mMIPTG进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS-PAGE电泳分析；步骤2，对步骤1得到的蛋白质进行纯化：pET28a-17D的大肠杆菌菌株Top10F培养液接种在含有卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至OD450＝0.6，加入IPTG在37℃下振荡培养5h，12000g离心取细菌沉淀物，细菌沉淀物经PBS洗涤后，利用亲和层析柱纯化，得到黄热病毒重组抗原蛋白；步骤3，在湿度为45～65％下，用pH值为8.2、浓度为10mM的PBS溶液配制1mg/mL羊抗鼠多克隆抗体溶液及1mg/mL黄热病毒重组抗原蛋白溶液，将喷膜仪中分别装入已配制好的10mL黄热病毒重组抗原蛋白溶液和10mL人IgM溶液，开始喷膜，喷后的硝酸纤维素膜移入37℃恒温干燥箱中干燥10h后取出，得到膜孔径为3μm的硝酸纤维素膜；步骤4，制备质量分数为1％的异戊醇水溶液，在湿度为75％下，将步骤3所制备的硝酸纤维素膜浸泡于100mL异戊醇水溶液和丙酮的混合溶液中，异戊醇水溶液和丙酮的体积比为5:1，缓慢加热至40℃，保持6min，之后将温度提升至65℃，保持5min，取出硝酸纤维素膜后用去离子水至少洗涤3遍，然后在60mL质量分数为5％的聚乙烯醇水溶液中浸泡15min，室温干燥后保存；保持在一定的湿度下，硝酸纤维素膜通过吸收水蒸气和丙酮蒸发诱导相反转，丙酮诱导时间保持在6min，孔隙结构会趋于规则，然后采用去离子水除去剩余的丙酮和异戊醇，巩固硝酸纤维素膜结构。步骤5，将硝酸纤维素膜粘贴在PVC板上表面，得到检测膜板，硝酸纤维素膜上依次设有检测线和对照线，在检测线处包被黄热病毒重组抗原，在对照线处包被人IgM抗体，用切条机将检测膜板切成条状的检测膜条，与辣根过氧化物酶标记的抗人μ链单克隆抗体及其底物共同组装成黄热病毒重组抗原试剂盒。作为优选，步骤(12)中，氯仿的添加量为Trizol液体积的1/5，水饱和酚的添加量为Trizol液体积的1/3，异丙醇的添加量为Trizol液体积的1/2，75％乙醇的第一次添加量为Trizol液体积的1.5倍，75％乙醇的第二次添加量为Trizol液体积的1.2倍。作为优选，步骤(13)中PCR的反应参数为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸90s，共32次循环，最后一次循环后72℃延伸7min。作为优选，以质量/体积百分比计，步骤5中辣根过氧化物酶的底物由0.03％的过氧化氢和0.07％的二氨基联苯胺组成。作为优选，黄热病毒重组抗原检测盒还包括PVC板，步骤5之前还包括将PVC板放入处理液中浸泡20min，浸泡后放入37℃恒温干燥箱、10h后干燥取出，处理液是由浓度为1％的牛血清蛋白、浓度为0.3％的硬脂酸钠、浓度为1％的Tritonx-1000、浓度为0.1％的十二烷基二甲基甜菜碱、混匀过滤后所得的滤液。本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：喷膜时需保持一定的湿度，湿度过低，硝酸纤维素膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试时出现疏水斑；湿度过高，硝酸纤维素膜上毛细作用加强，点膜容易引起T线、C线变宽甚至扩散；对制得的硝酸纤维素膜进行后处理，首先异戊醇能够减少溶液的表面张力和降低静电斥力，可以显著的提高膜的浸润性和稳定性，之后将硝酸纤维素膜浸入到聚乙烯醇中，能降低蛋白在溶液中的稳定性，由于添加量较少，不会导致蛋白质的变性或沉淀，可以促进蛋白质在硝酸纤维素膜上的被吸附；对样品垫进行浸渍处理，处理液渗入到样品垫中，然后干燥，可避免使用复杂辨识剂或追迹缓冲液的麻烦，从而减少样品差异，提高灵敏度。本发明的制备方法得到的黄热病毒重组抗原的特异性强，亲和力高，不会与其它虫媒传播病毒发生血清交叉学反应。附图说明图1是黄热病毒重组质粒在大肠杆菌中的表达使用12％SDS-PAGE电泳谱图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1一种黄热病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：步骤一，选取抗原片段根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，并在正向引物和反向引物5’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点，正向引物：5’-TAGGAATTCTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCC-3’，反向引物：5'-GACAAGCTTCTATTACTTTCCTATTGAGCTTCCCT-3’。步骤二，黄热病毒RNA的提取黄热病毒17D株经BHK-21细胞培养3d后，收集培养物的上清液，4℃条件下，10000g离心10min，收集沉淀物，加入5-10倍体积Trizol液，混匀后，4℃条件下静置5min，然后加入氯仿，摇荡15s，取第一上层水相加入水饱和酚，摇荡20s，取第二上层水相加入异丙醇，4℃条件下放置10min，4℃条件下，12000g离心10min后，取第一次沉淀，加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，再取第二次沉淀加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，得到黄热病毒RNA，室温下干燥6min后，将黄热病毒RNA溶于水中；步骤二中，氯仿的添加量为Trizol液体积的1/5，水饱和酚的添加量为Trizol液体积的1/3，异丙醇的添加量为Trizol液体积的1/2，75％乙醇的第一次添加量为Trizol液体积的1.5倍，75％乙醇的第二次添加量为Trizol液体积的1.2倍。步骤三，PCR扩增黄热病毒RNA反转录得到cDNA，反转录步骤为：RNA2μg，10mmol/LdNTP1μL和500ng/μLOligodT1μL在70℃水浴锅中加热5min后，冰浴3min，然后加入10×Buffer2μL，RNase抑制剂1μL和反转录酶(50unit/μL)1μL，混匀后在42℃条件下反应60min，再在80℃条件下反应5min，得到cDNA；然后进行PCR扩增：取cDNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，正向引物、反向引物各2μL、dNTP8μL、LATaq2U，补水至总体积50μL进行PCR扩增，扩增片段经纯化、回收后，-20℃保存备用；步骤三中PCR的反应参数为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸90s，共32次循环，最后一次循环后72℃延伸7min。步骤四，原核表达载体的构建通过BamHI和HindIII对pET28a载体和回收后的扩增片段进行限制性酶切和连接，得到重组质粒；步骤四中还包括对重组质粒的鉴定：重组质粒转化大肠杆菌L1-Blue感受态细胞，涂布于含有100mg/mL氨苄西林的琼脂平板上，在含有X-gal和IPTG的琼脂平板上筛选重组质粒和非重组质粒。步骤五，重组质粒的诱导表达设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a-17D的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mMIPTG进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS-PAGE电泳分析，结果如图1。黄热病毒重组抗原检测盒还包括PVC板，步骤5之前还包括将PVC板放入处理液中浸泡20min，浸泡后放入37℃恒温干燥箱、10h后干燥取出，处理液是由浓度为1％的牛血清蛋白、浓度为0.3％的硬脂酸钠、浓度为1％的Tritonx-1000、浓度为0.1％的十二烷基二甲基甜菜碱、混匀过滤后所得的滤液。实施例2一种黄热病毒重组抗原试剂盒的制作方法，黄热病毒重组抗原试剂盒包括PVC板、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被黄热病毒重组抗原，对照线上包被IgM抗体，以及辣根过氧化物酶标记的抗人μ链抗体和底物，包括以下步骤：步骤1，黄热病毒重组抗原的制备(11)、选取抗原片段根据抗原性预测得分较高的病毒抗原表位片段设计引物，并在正向引物和反向引物5’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点，正向引物：5’-TAGGAATTCTCAGCTTTGACACTCAAGGGGACATCC-3’，反向引物：5'-GACAAGCTTCTATTACTTTCCTATTGAGCTTCCCT-3’；(12)、黄热病毒RNA的提取黄热病毒17D株经BHK-21细胞培养3d后，收集培养物的上清液，4℃条件下，10000g离心10min，收集沉淀物，加入5-10倍体积Trizol液，混匀后，4℃条件下静置5min，然后加入氯仿，摇荡15s，取第一上层水相加入水饱和酚，摇荡20s，取第二上层水相加入异丙醇，4℃条件下放置10min，4℃条件下，12000g离心10min后，取第一次沉淀，加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，再取第二次沉淀加入75％乙醇，4℃条件下，8000g离心5min，得到黄热病毒RNA，室温下干燥6min后，将黄热病毒RNA溶于水中。步骤(12)中，氯仿的添加量为Trizol液体积的1/5，水饱和酚的添加量为Trizol液体积的1/3，异丙醇的添加量为Trizol液体积的1/2，75％乙醇的第一次添加量为Trizol液体积的1.5倍，75％乙醇的第二次添加量为Trizol液体积的1.2倍。(13)、PCR扩增用常规方法对黄热病毒RNA进行反转录，得到cDNA，然后进行PCR扩增：取cDNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，正向引物、反向引物各2μL、dNTP8μL、LATaq2U，补水至总体积50μL进行PCR扩增，扩增片段经纯化、回收后，-20℃保存备用；步骤(13)中PCR的反应参数为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸90s，共32次循环，最后一次循环后72℃延伸7min。(14)、原核表达载体的构建通过BamHI和HindIII对pET28a载体和回收后的扩增片段进行限制性酶切和连接，得到重组质粒。(15)、重组质粒的诱导表达设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a-17D的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mMIPTG进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS-PAGE电泳分析。步骤2，对步骤1得到的蛋白质进行纯化：pET28a-17D的大肠杆菌菌株Top10F培养液接种在含有卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至OD450＝0.6，加入IPTG在37℃下振荡培养5h，12000g离心取细菌沉淀物，细菌沉淀物经PBS洗涤后，利用亲和层析柱纯化，得到黄热病毒重组抗原蛋白；步骤3，在湿度为45～65％下，用pH值为8.2、浓度为10mM的PBS溶液配制1mg/mL羊抗鼠多克隆抗体溶液及1mg/mL黄热病毒重组抗原蛋白溶液，将喷膜仪中分别装入已配制好的10mL黄热病毒重组抗原蛋白溶液和10mL人IgM溶液，开始喷膜，喷后的硝酸纤维素膜移入37℃恒温干燥箱中干燥10h后取出，得到膜孔径为3μm的硝酸纤维素膜；步骤4，制备质量分数为1％的异戊醇水溶液，在湿度为75％下，将步骤3所制备的硝酸纤维素膜浸泡于100mL异戊醇水溶液和丙酮的混合溶液中，异戊醇水溶液和丙酮的体积比为5:1，缓慢加热至40℃，保持6min，之后将温度提升至65℃，保持5min，取出硝酸纤维素膜后用去离子水至少洗涤3遍，然后在60mL质量分数为5％的聚乙烯醇水溶液中浸泡15min，室温干燥后保存；保持在一定的湿度下，硝酸纤维素膜通过吸收水蒸气和丙酮蒸发诱导相反转，丙酮诱导时间保持在6min，孔隙结构会趋于规则，然后采用去离子水除去剩余的丙酮和异戊醇，巩固硝酸纤维素膜结构。步骤5，将硝酸纤维素膜粘贴在PVC板上表面，得到检测膜板，硝酸纤维素膜上依次设有检测线和对照线，在检测线处包被黄热病毒重组抗原，在对照线处包被人IgM抗体，用切条机将检测膜板切成条状的检测膜条，与辣根过氧化物酶标记的抗人μ链单克隆抗体及其底物共同组装成黄热病毒重组抗原试剂盒。以质量/体积百分比计，步骤5中辣根过氧化物酶的底物由0.03％的过氧化氢和0.07％的二氨基联苯胺组成。喷膜时需保持一定的湿度，湿度过低，硝酸纤维素膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试时出现疏水斑；湿度过高，硝酸纤维素膜上毛细作用加强，点膜容易引起质控线、检测线变宽甚至扩散；对制得的硝酸纤维素膜进行后处理，首先异戊醇能够减少溶液的表面张力和降低静电斥力，可以显著的提高膜的浸润性和稳定性，之后将硝酸纤维素膜浸入到聚乙烯醇中，能降低蛋白在溶液中的稳定性，由于添加量较少，不会导致蛋白质的变性或沉淀，可以促进蛋白质在硝酸纤维素膜上的被吸附；对样品垫进行浸渍处理，处理液渗入到样品垫中，然后干燥，可避免使用复杂辨识剂或追迹缓冲液的麻烦，从而减少样品差异，提高灵敏度。对本实施例制备得到的试剂盒进行ELISA反应，评价该试剂盒的灵敏度及黄热病毒重组抗原的结合特异性，反应条件如下：1)样本采用0.01mol/LPBS(pH7.2)-0.5％Tween-20进行1:50稀释；2)封闭，采用5％脱脂牛奶(0.01mol/LPBS缓冲液配制)作为封闭液，于37℃温育45min；3)血清温育：取出所需的检测膜条，放入温育槽内，编号。在温育槽中分别加入1.5mL已稀释样本，于37℃在摇床上温育20min；4)清洗：吸去槽内液体，在摇床上用1.5mL0.01mol/LPBS(pH7.2)-0.5％Tween-20清洗检测膜条3次，每次6min；洗过后100μL用0.01mol/LPBS(pH7.2)-5％牛奶(稀释，1:50)加入3h，37℃，洗后，100μL辣根过氧化物酶标记的抗牛IgM抗体稀释1:1500在0.01mol/LPBS(pH7.2)-5％牛奶被加入1h，37℃；5)加酶结合物：在温育槽中加入1.5mL已稀释的酶结合物(采用辣根过氧化物酶标记的抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体为检测抗体)，于37℃在摇床上温育20min。6)清洗：吸去槽内液体，在摇床上用1.5mL0.01mol/LPBS缓冲液清洗检测膜条3次，每次6min。7)底物温育：在温育槽中分别加入1.5mL底物液，于37℃摇床上温育10min。8)终止：吸去槽内液体，用蒸馏水清洗检测膜条3次，每次3min。结果判断：将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。任何蛋白靶标出现的特异性条带，均可判断为阳性，可辅助诊断黄热病。选择含有辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、登革1～2型和流行性乙型脑炎血清、黄热抗体兔血清、正常兔血清以及正常鼠血清作为参考样品，黄热病毒重组抗原用pH值为8.2、浓度为10mmol/L的PBS溶液稀释不同倍数。如表1所示，本发明的黄热病毒重组抗原的试剂盒及其采用的黄热病毒重组抗原蛋白具有良好的特异性，与上述参考样品均无交叉反应；如表2所示，本发明得到的试剂盒的检出范围为稀释倍数的100～12800。表1稀释200倍的黄热病毒重组抗原的特异性检测结果表2灵敏度的检测结果稀释倍数检测结果稀释倍数检测结果100阳性3200阳性200阳性6400阳性400阳性12800阴性800阳性25600阴性1600阳性51200阴性因此，本发明的制备方法得到的黄热病毒重组抗原的特异性强，亲和力高，不会与其它虫媒传播病毒发生血清交叉学反应，本发明制备得到的试剂盒灵敏度高。总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。当前第1页1 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