本发明属于CRISPR/Cas9基因编辑技术领域，具体是指针对人源ADRB2基因设计的四条sgRNA。
背景技术：
基因编辑技术，是近年来发展起来的一项可以对基因进行精准修饰的技术。在科学研究领域，基因编辑技术可用于模式生物的快速构建；在农业领域，该技术可用于植物品种改造；而在健康医疗领域，该技术还有可能通过改造人类自身基因，达到治疗疾病的目的。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。
目前，基因编辑技术主要有锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复技术(CRISPR/Cas9)。技术原理上，三种基因编辑技术都是通过特异序列的靶向识别和切割，造成基因组断裂，在细胞通过非同源末端连接修复(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(HR)的过程中达到对基因精确修饰的目的。
锌指核酸酶作为第一代基因编辑技术，首次实现了对基因的靶向性操作。原理如下：锌指核糖核酸酶由一个DNA识别域和一个核酸内切酶构成。DNA识别域又是由一系列锌指蛋白模块串联组成，每个锌指蛋白模块识别并结合一个特异的三联体碱基，从而实现核酸内切酶对基因组特定位点的靶向性切割。尽管有文献报道锌指核酸酶的基因打靶效率能达到30％，但其发展仍存在较大局限性。一方面，锌指核酸酶的识别结构域中存在上下文序列依赖性，增加了设计、筛选难度；另一方面，锌指核酸酶的脱靶切割会导致细胞毒性，制约了其在基因治疗领域的应用。
转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)是第二代基因编辑技术，TALEN在设计上比ZFN更加简单，使用上更加灵活。TALEN的作用原理与ZFN相似，但其特异性识别DNA序列的是TALEN蛋白。TALEN蛋白利用其重复单元中第12/13位氨基酸残基于A、G、C、T形成的保守且恒定的对应关系，进而实现对基因组上任意特定位点的识别、切割。
CRISPR/Cas9是新近发展起来的第三代基因编辑技术，它来源于细菌和古细菌的适应性性免疫系统。前两代基因编辑技术不同，CRISPR/Cas9系统是RNA介导的Cas9核酸内切酶对特定DNA序列进行识别、切割，进而实现对基因组的精确编辑。其中，起向导作用的RNA被称为sgRNA(single-guide RNA)。它由两部分构成，一部分是crRNA(CRISPR RNA)，其通过碱基互补配对原则与靶序列结合，起精准定位的作用，另一部分是tracrRNA(trans-acting CRISPR RNA)，其协助crRNA/Cas9蛋白形成稳定的复合物，实现Cas9在基因组上的精准定位，进而剪切DNA双链，形成DSB(Double Stranded Breaks)缺口，激活细胞自身的DNA损伤修复机制，在修复的过程中造成移码突变，最终实现靶基因的敲除。
CRISPR/Cas9系统一经出现便在基础研究领域及研发领域得到广泛应用，主要是它有着前两代基因编辑技术无可比拟的优势。首先，其构建过程简单，可操作性强，成本低。其次，可以实现单基因多位点或多基因的同时敲除，大大提高了基因编辑的效率。再次，质粒载体体量小，减少了转染过程中的细胞毒性。最后，可供编辑的位点在基因组上出现频率高，容易选择合适的位点进行高效基因编辑操作。除此以外，与目前基因沉默领域应用最为广泛的基因干扰技术(RNAi)相比，CRISPR/Cas9同样优势显著：
技术实现要素：
本发明根据sgRNA的设计原则，在人源β2-AR(ADRB2)基因CDS区(蛋白质编码区)的近5’端采用头对头排列的形式设计了四条sgRNA，分别构建了单sgRNA重组质粒及将这4条sgRNA有序串联构建的多重sgRNA重组质粒。通过T7EN1酶切和TA克隆测序证实，无论单sgRNA还是4条sgRNA串联后获得的多重sgRNA均可实现对ADRB2基因的有效切割，但尤以多重sgRNA的切割活性最高，可达到100％编辑效率。
本发明的技术方案如下：登录UCSC Genome Browser Home网站检索人源ADRB2基因的CDS序列。根据sgRNA的设计原则，在CDS区(蛋白质编码区)的近5’端采用头对头排列的形式设计了四条sgRNA。分别命名为sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3和sgRNA4，具体序列如下：
sgRNA1：5’-CCTGCGTGACGTCGTGGTC-3’，
sgRNA2：5’-GTCATGTCTCTCATCGTCC-3’，
sgRNA3：5'-ATCCACTGCGATCACGCAC-3'，
sgRNA4：5'-AGCCTGCTGACCAAGAATA-3'，
将合成后的4条sgRNA分别于pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体连接，构建了4个靶向ADRB2基因的单sgRNA重组质粒。通过T7EN1酶切鉴定，4条sgRNA均可实现对ADRB2基因特异性切割。
进一步将这4条sgRNA有序串联，与真核表达载体pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro连接，构成靶向ADRB2基因的多重sgRNA重组质粒。T7EN1酶切的检测结果显示，多重sgRNA于单sgRNA相比可以获得更高的切割活性。TA克隆测序结果也证实，多重sgRNA针对ADRB2基因特定靶位点的编辑效率高达100％。
本发明取得的有益效果如下：本发明中针对人源ADRB2基因5’端CDS区设计的4条sgRNA，单独或有序串联后均可获得较高的切割活性，从而激活细胞的DNA修复机制，导致碱基的缺失或插入，最终引发移码突变，实现对ADRB2基因的高效敲除。而且，以头对头的方式将4条sgRNA有序串联构建的多重sgRNA可以更准确、高效的引导Cas9蛋白切割DNA双链，进一步降低脱靶效应，最终将ADRB2基因在细胞中成功敲除。
附图说明
图1为本发明设计的四条sgRNA在人源ADRB2基因CDS区的位置；
图2为四个单sgRNA表达质粒T7EN1酶切检测结果；
图3多重sgRNA重组质粒T7EN1酶切检测结果；
图4为1#TA克隆测序结果示意图；
图5为2#TA克隆测序结果示意图；
图6为3#TA克隆测序结果示意图；
图7为4#TA克隆测序结果示意图；
图8为5#TA克隆测序结果示意图；
图9为6#TA克隆测序结果示意图；
图10为7#TA克隆测序结果示意图；
图11为8#TA克隆测序结果示意图；
图12为9#TA克隆测序结果示意图；
图13为10#TA克隆测序结果示意图。
具体实施方式
下面对本专利的技术方案作进一步详细说明，本发明所述的技术特征没有进行详细描述的部分均采用现有的成熟技术。
以下结合附图，对本发明做进一步详细说明。
本发明针对人源ADRB2基因设计的四条sgRNA。首先，需要登录UCSC Genome Browser Home网站检索人源ADRB2基因的CDS序列。继而，根据sgRNA的设计原则，在其CDS区近5’端采用头对头的设计方式，选择了4个靶位点，设计了四条sgRNA(如图1)。通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体连接，构建了靶向ADRB2基因的单sgRNA表达载体，经T7EN1酶切鉴定证实4条sgRNA均可有效引导Cas9核酸内切酶对靶基因的特定位点进行切割(如图2)。最后，我们将4条sgRNA有序串联与pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro连接，构建了多重sgRNA重组质粒并将其转染HEK 293T细胞。T7EN1酶切结果发现，多重sgRNA重组质粒具有比单sgRNA质粒更高的切割活性(如图3)。TA克隆测序证实多重sgRNA对靶基因的敲除效率高达100％，且出现了多种基因突变类型，包括碱基的缺失、插入，大片段的缺失、重排(如图4-13)。由此证实，我们设计的4条靶向ADRB2基因的sgRNA单独或组合应用均可实现对靶基因的高效敲除。
所设计的4条sgRNA分别命名为：sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3和sgRNA4。具体序列如下：
sgRNA1：5’-CCTGCGTGACGTCGTGGTC-3’，
sgRNA2：5’-GTCATGTCTCTCATCGTCC-3’，
sgRNA3：5'-ATCCACTGCGATCACGCAC-3'，
sgRNA4：5'-AGCCTGCTGACCAAGAATA-3'，
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的方案并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方案方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。