本发明涉及包含用于扩增来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22的核酸的正向引物和反向引物的引物对，能够与来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22的核酸序列特异性杂交的核酸，包含所述核酸的承载体，包括在样品中检测来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22的核酸序列的步骤的方法，所述引物对、核酸或承载体用于诊断疾病的用途以及用于诊断疾病的包含所述引物对、核酸和/或承载体的试剂盒。
背景技术：
人致病性皮肤癣菌是感染人皮肤、指甲和毛发的真菌，其属于毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)和表皮癣菌属(Epidermophyton)这三个属。虽然表皮癣菌属仅由单个物种(species)(絮状表皮癣菌(Epidermophyton.Floccosum))代表，但小孢子菌属和毛癣菌属包含几种不同的物种。最近，以前被分配到皮肤分节真菌属(Arthroderma)的几个物种已被重新归类并分配到毛癣菌属中(Hoog等人，2016)，在本专利申请中将遵循此重新分配。
欧洲国家的皮肤癣菌皮肤、毛发和指甲感染的患病率在3％到22％之间。在大多数情况下，局部治疗已足够，但如果感染是由小孢子菌属和毛癣菌属的特定菌株如疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)和须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)引起的，则需要长期并且通常昂贵的全身治疗。
全身性抗真菌剂与各种副作用相关，例如胃肠副作用，其发生在3-5％口服特比萘芬进行治疗的患者中。此外，骨髓抑制和肝脏副作用可能会出现，尽管不太频繁。因此，在设计治疗方案并开始治疗之前，应确认对特定菌株的皮肤、毛发和指甲感染的诊断。
目前对皮肤癣菌的诊断是基于对临床标本中孢子和菌丝的显微鉴定，然后进行真菌的体外培养和形态鉴定。对皮肤、毛发和指甲材料的直接显微检查通常足以用于真菌感染的预先诊断，但不会导致特定物种的诊断。虽然这种技术快速而便宜，但其灵敏度相对较低，并且在所有病例的高达15％中显示出假阴性结果。
在大约95％的病例中，应用培养可以在10-15天内鉴定特定的物种。然而，对于一些生长缓慢或不典型的分离株，诊断时间长达3-6周。因此，需要一种简单快速且特异的诊断皮肤癣菌感染的方法。
已经引入基于PCR的方法来诊断真菌感染。例如，US2010/0311041公开了用于从真菌中提取核酸的方法，用于检测患者样品中的真菌的PCR方法，和用于检测皮肤癣菌和用于诊断由毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属这三个属引起的感染的PCR试剂盒。
然而，现有技术中公开的方法具有缺点。特别是，它们不允许快速和可靠地区分来自毛癣菌属和小孢子菌属的紧密相关的菌株，其包括嗜热性和非嗜热性物种。
因此，本发明的一个技术问题在于提供用于诊断皮肤、毛发和指甲疾病，优选皮肤、毛发和指甲感染，更优选皮肤、毛发和指甲真菌感染的方法和试剂。
本发明的另一个技术问题是提供用于鉴定和区分来自毛癣菌属的紧密相关的病原体物种(特别是Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum))的方法和试剂。
本发明的技术问题通过所附独立和从属权利要求的主题来解决。
在第一方面，本发明的技术问题通过引物对来解决，所述引物对包含能够扩增来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的核酸的正向引物和反向引物，所述核酸包含SEQ ID NO22，优选SEQ ID NO1。
在第二方面，本发明的技术问题通过能够与来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的核酸序列或其互补链或包含所述核酸序列的载体或细胞特异性杂交的核酸来解决，所述核酸序列包含SEQ ID NO22，优选SEQ ID NO1。
在优选的实施方案中，引物对或核酸包含可检测标记，优选选自包含荧光、放射性、胶体金或酶促活性标记的组。
在第三方面，本发明的技术问题通过如下的核酸来解决，所述核酸包含根据本发明的引物对并且在正向引物和反向引物之间包含来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的核酸序列，所述核酸序列在病原体基因组中位于正向引物和反向引物的序列之间，所述核酸优选通过使用根据本发明的引物扩增包含所述病原体的样品而获得。
在第四方面，本发明的技术问题通过包含根据本发明的核酸的承载体来解决。
在优选的实施方案中，承载体是硅烷涂覆的玻璃、塑料或硅材料微阵列板。
在第五方面，本发明的技术问题通过包括以下步骤的方法解决，所述方法包括在样品中检测来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22、优选SEQ ID NO1的核酸序列。更优选地，核酸包含选自包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的组的序列。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法还包括以下步骤：
a)提供来自患者的样品，优选指甲、毛发或皮肤/指甲材料，
b)使用所述引物对扩增存在于所述样品中的包含SEQ ID NO22，优选SEQ ID NO1的任何核酸，从而如果来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22(或SEQ ID NO1)的核酸序列存在于样品中，则产生扩增子。更优选地，核酸包含选自包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的组的序列及其变体。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法还包括以下步骤：
c)检测扩增子。
在优选的实施方案中，通过荧光、放射性、胶体金或化学发光来检测扩增子。
在第六方面，本发明的技术问题通过根据本发明的引物对、核酸或承载体用于诊断疾病，优选与病原体相关的皮肤、毛发和指甲感染的用途来解决。
在第七方面，本发明的技术问题通过包含根据本发明的引物对、核酸和/或承载体的试剂盒来解决，所述试剂盒优选用于诊断疾病，更优选用于诊断与病原体相关的皮肤、毛发和指甲感染。
在第八方面，本发明的技术问题通过根据本发明的引物对、核酸或承载体用于制备试剂盒的用途来解决，所述试剂盒用于诊断疾病，优选与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体，更优选与皮肤、毛发和指甲感染相关的具有包含SEQ ID NO22，优选SEQ ID NO1的核酸的病原体。
在第九方面，本发明的技术问题通过将所述引物对、核酸、承载体、用途或试剂盒用于鉴定真菌来解决，所述真菌优选来自毛癣菌属(Trichophyton)，更优选来自包含以下的组：断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，意瑞奈斯毛癣菌(Trichophyton erinacei)(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌(Trichophyton erinacei)。
在优选的实施方案中，病原体来自包含毛癣菌属的组。
在优选的实施方案中，病原体来自包含以下的组：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现，即与皮肤、毛发和指甲感染相关的各种病原体都具有与共有序列SEQ ID NO22或SEQ ID NO1相关的同源金属蛋白酶，其在相关的菌株之间具有轻微但独特的序列差异，这些差异可用于区分样品(例如来自患有皮肤、毛发和指甲感染的患者的临床样品)中与皮肤、毛发和指甲感染相关的各种紧密相关的病原体菌株，优选来自毛癣菌属，更优选来自包含以下的组：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。
在包含能够扩增来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的核酸的正向引物和反向引物的引物对的优选实施方案中，所述病原体选自包含以下的组：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。
在能够与来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的核酸序列特异性杂交的核酸的优选实施方案中，所述病原体选自包含以下的组：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。
根据本发明，检测来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸。在优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自毛癣菌属的病原体，更优选来自包含以下的组：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。在优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自断发毛癣菌并且由SEQ ID NO2表示。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自马毛癣菌并且由SEQ ID NO3表示。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自指间毛癣菌(嗜人(anthrophilic)+嗜动物(zoophilic))I、II、II、III＊、IV、M并且由SEQ ID NO4表示。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自Trichophyton benhamiae(黄色)并且由SEQ ID NO5表示。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自Trichophyton benhamiae(白色)并且由SEQ ID NO6代表。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自Trichophyton benhamiae(非洲)并且由SEQ ID NO7代表。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自同心性毛癣菌并且由SEQ ID NO8表示。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自意瑞奈斯毛癣菌并且由SEQ ID NO9表示。
本发明设想了各种试剂，例如包含正向引物和反向引物的引物对，用于从病原体中扩增编码所述金属蛋白酶的核酸。如何设计引物以确保特异性杂交并且避免引物二聚化或二级结构形成的方法已描述于现有技术中，例如在Dennis，Y.M.，Chius，R.W.K.，and Allen Chan，K.C.(2006)Clinical applications of PCR，Humana Press中的第18页。在优选的实施方案中，每个引物具有10至40个，更优选12至35个，更优选14至30个核苷酸的长度。在优选的实施方案中，本文所用的术语“正向引物”涉及在病原体基因组中在SEQ ID NO22或1上游杂交的引物，使得引物可以在PCR反应中在5'至3'方向上延伸，从而导致合成包含SEQ ID NO22或1的核酸。
在优选的实施方案中，正向引物是与SEQ ID NO22或1上游的病原体基因组区域特异性杂交的通用正向引物，其在待区分的病原体(优选来自毛癣菌属的物种)中足够保守，使得即使所述物种的SEQ ID NO22或1的可变部分是不同的，其也可用于扩增多于一种物种的SEQ ID NO22或1。在优选的实施方案中，正向引物与断发毛癣菌、马毛癣菌和指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M共有的保守区域杂交，并且包含含有GGGAGGGAGACTAGTTG或其变体的序列。在另一个优选的实施方案中，正向引物与由Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌和意瑞奈斯毛癣菌共有的保守区域结合，并且包含含有GCATTTCCCATGGCT或其变体的序列。
在优选的实施方案中，如本文所用，术语“反向引物”涉及在病原体基因组中特异性杂交于SEQ ID NO22或1下游的引物，使得引物可以在PCR反应中在5’至3’方向上延伸，从而导致合成包含与SEQ ID NO22或1互补的序列的核酸。
在优选的实施方案中，反向引物是与SEQ ID NO22或1下游的病原体基因组区域特异性杂交的通用反向引物，其在待区分的病原体(优选来自毛癣菌属的物种)中足够保守，使得即使所述物种的包含SEQ ID NO22或1的序列及与它们互补的序列不同，其也可用于扩增与多于一种物种的SEQ ID NO22或1互补的序列。在优选的实施方案中，反向引物与断发毛癣菌、马毛癣菌和指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M共有的保守区域杂交，并且包含含有AATTTTTCGCCGCCAAG或其变体的序列。在另一个优选的实施方案中，反向引物与由Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌和意瑞奈斯毛癣菌共有的保守区域结合，并且包含含有TGGCTCTGTTACGTG或其变体的序列。
在另一个优选的实施方案中，引物对可以存在于包含多于一个引物对的组合物中，例如包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、28、32、36、40或48或更多个引物对。在优选的实施方案中，所述组合物包含可用于扩增来自断发毛癣菌、马毛癣菌和指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M的编码SEQ ID NO22或1的核酸的引物对，以及另外的可以用于扩增来自Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌和意瑞奈斯毛癣菌的编码SEQ ID NO22或1的核酸的引物对。在优选的实施方案中，组合物可以包含引物对，其可以用于通过与其特异性杂交来扩增或检测可用于区分与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的一个或多个序列，这样的序列优选选自包含被称作为β微管蛋白(Rezaei-Matehkolaei等人(2014)Nucleotide sequence analysis of beta tubulin gene in a wide range of dermatophytes,Medical Mycology 42,674)、转录延伸因子(Mirhendi等人(2015),Translation elongation factor 1-alpha gene as a potential taxonomic and identification marker in dermatophytes,Medical Mycology 53,215)，内部转录间隔区1和2(等人(2008),The New Species Concept in Dermatophytes–a Polyphasic Approach,Mycopathologia 166,239)和拓扑异构酶的核酸序列或其部分的序列。这样的引物组合物可以根据本发明使用，并使用包含能够与选自被称作为β微管蛋白、转录延伸因子、内部转录间隔区1和2和拓扑异构酶的核酸序列或其部分的序列特异性杂交的一种或多种核酸的承载体进行分析，所述承载体可用于检测任何此类序列的存在。
正向引物的5'-3'方向上的最末碱基对与SEQ ID NO 22或1的5'-3'方向的第一碱基对之间的距离按照越来越优选的顺序为10000，8000，6000，4000，2000，1000，800，600，400，200，100个碱基对或更少。
反向引物的5'-3'方向上的最末碱基对与SEQ ID NO 22或1的5'-3'方向的最末碱基对之间的距离按照越来越优选的顺序为10000，8000，6000，4000，2000，1000，800，600，400，200，100个碱基对或更少。
本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确(例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含提及的确切序列的核酸，也可以使用这些核酸的变体。在优选的实施方案中，核酸的术语“变体”包含与参考或野生型核酸具有至少70，更优选75,80,85,90,95,98,99或99.5％序列同一性的核酸，优选具有特异性杂交到与参照或野生型核酸相同靶标的能力，以及其互补链优选在严格条件下与参考或野生型核酸杂交的核酸。在优选的实施方案中，如本文所用，术语“特异性杂交”是指核酸例如引物或探针在严格条件下与靶核酸杂交。杂交反应的严格性易于由本领域普通技术人员确定，并且通常是取决于引物或探针长度、反应温度和盐浓度的经验计算。一般来说，较长的引物或探针可以承受较高的温度以进行适当的退火，而较短的引物或探针则较不能够承受较高的温度以进行适当的退火。杂交通常取决于单链或双链DNA结合存在于低于其解链温度的环境中的互补链的能力。探针和可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，较高的相对温度会使反应条件更加严格，并提防非特异性结合，而较低的温度则较不严格。关于杂交反应严格性的其他细节和解释，参见Ausubel,F.M.(1995),Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Inc。此外，本领域技术人员可以遵循手册Boehringer Mannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide for Filter Hybridization,Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany和Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W.,and Schleifer,K.H.(1991)International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260中关于如何通过杂交鉴定DNA序列的指导。在优选的实施方案中，严格条件适用于任何杂交，即仅当引物或探针与靶标70％，优选75％，80％，85％，90％，95％或99％或更加相同时才发生杂交序列。与靶序列具有较低同一性程度的核酸可以杂交，但是这样的杂交体是不稳定的并且将在PCR的退火步骤或探针杂交后的洗涤步骤时被去除。在严格条件下探针杂交的洗涤步骤中，例如将盐的浓度降低至2×SSC或任选地和随后降低至0.25×SSC，同时温度按照越来越优选的顺序为约39℃-69℃，约41℃-67℃，约43℃-65℃，约45℃-63℃，约47℃-61℃，约49℃-59℃，约51℃-57℃，约53℃-57℃。在特别优选的实施方案中，温度为约51℃-57℃或约53℃-57℃。在优选的实施方案中，用于PCR反应的引物对包含可检测标记，优选来自包含荧光、放射性、胶体金或酶促活性标记的组。更优选地，标记是优选选自包含cy-3、cy-5、HEX、FAM、ROX和TAMRA的组的荧光标记。在现有技术中已经描述了合适的标记和将它们连接到诸如引物的核酸并检测这些标记的方式。
在优选的实施方案中，本发明的引物对的每种引物和/或探针的核苷酸序列包含能够扩增或杂交至SEQ ID NO22、1所示的序列或其互补序列的序列或由其组成，条件是所述引物对和/或所述探针不能扩增或杂交至SEQ ID NO6、29、30所示的序列和/或其互补序列。因此，在一些实施方案中，本发明的探针包含能够与SEQ ID NO22所示序列或其互补序列杂交的序列或由其组成，其条件是所述探针不能与SEQ ID NO6、29、30所示的序列和/或其互补序列杂交。在可选的实施方案中，本发明的探针包含能够与SEQ ID NO1所示的序列或其互补序列杂交的序列或由其组成，其条件是所述探针不能与SEQ ID NO6、29、30所示的序列和/或其互补序列杂交。上文描述了严格的杂交条件。测量核苷酸杂交的方法在本领域中是公知的。在涉及发明的引物对和/或探针不能与SEQ ID NO6、29、30所示的序列和/或其互补序列杂交的条件的实施方案中，所述序列在其整个长度上与SEQ ID NO6、29、30所示的序列和/或其互补序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。
在优选的实施方案中，本发明的引物对的每种引物和/或探针的核苷酸序列包含能够扩增或杂交至SEQ ID NO22、1所示的序列或其互补序列的序列或由其组成，其中本发明的引物对的每种引物和/或探针的所述核苷酸序列包含作为SEQ ID NO22、1所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO22、1所示的序列或其互补序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。因此，在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO22所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO22所示的序列或其互补序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO22所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO22所示的序列或其互补序列具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO22所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO22所示的序列或其互补序列具有至少98％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO22所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO22所示的序列或其互补序列具有100％的序列同一性。
在优选的实施方案中，本发明的探针具有与可检测的信号分子融合的不超过250，不超过200，不超过150，不超过100，不超过90，不超过80，不超过70，不超过70，不超过65，不超过60，不超过55，不超过50，不超过45，不超过40，不超过35，不超过30，不超过25或不超过20个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO1所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO1所示的序列或其互补序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO1所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO1所示的序列或其互补序列具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO1所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO1所示的序列或其互补序列具有至少98％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的探针的核苷酸序列包含作为SEQ ID NO1所示序列的片段的序列或其互补序列或由其组成，其中所述片段在至少5，至少10，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或至少26个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO1所示的序列或其互补序列具有100％的序列同一性。
在本发明的其它优选实施方案中，组合本发明的引物对的每种引物和/或探针的上述特性，即(1)所述引物对和/或所述探针不能扩增或杂交至SEQ ID NO6、29、30所示的序列和/或其互补序列，(2)本发明的探针具有有限的长度，和(3)本发明的引物对的每种引物和/或探针包含SEQ ID NO22的片段或其互补序列，其中所述片段在至少5个连续核苷酸的长度上与SEQ ID NO22所示的序列或其互补序列具有至少90％的序列同一性。
根据本发明，提供了能够与来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸序列或其互补链特异性杂交的核酸。核酸可以是分离的核酸。该核酸可以用作探针以检测来自病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸，并将其与其他序列区分开，更具体地与来自与此类感染相关的其他病原体的也包含SEQ ID NO22或1的同源序列区分开。因此，该核酸包含能够与包含SEQ ID NO22或1的序列或互补序列特异性杂交的链。优选地，能够与来自这种病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸序列特异性杂交的核酸选自包含SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID No.24至28及其变体的组。
能够与来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸序列特异性杂交的核酸可以优选固定化在承载体上。通过这种方式，当将所述核酸退火至来自病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸时，可更直接地将所述核酸与来自患者的样品中的任何其它核酸或其它物质分离。承载体可以通过用能够与包含SEQ ID NO22或1的核酸或其变体，更优选包含选自包含SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID No.24-28的组的序列的核酸及其变体特异性杂交的核酸包被来制备。在优选的实施方案中，承载体是微阵列板。现有技术中描述了合适的微阵列、如何制备以及如何使用它们，例如在Müller,H.J&T.(2004)DerExperimentator–Microarrays,Elsevier/Spektrum中的第3章和第4章。
根据本发明，提供了一种方法，该方法包括在样品中检测来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸的步骤。在优选实施方案中，如本文所用，术语“检测”意指检测到SEQ ID NO22或1或其变体的存在或不存在。在更优选的实施方案中，该术语意指确定存在的核酸是否包含来自毛癣菌属的一种或多种病原体的SEQ ID NO22或1，所述病原体更优选地是来自包含以下的组：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌，以及任选地确定存在的核酸是这些病原体序列中的哪一种。在最优选的实施方案中，该术语是指确定样品中存在的核酸是否来自Trichophyton benhamiae(黄色)或同心性毛癣菌，从而区分两种生物体。在另一个优选的实施方案中，检测可以是半定量或定量检测。可以用于检测特定序列的方法在现有技术中描述，例如在Lottspeich,F.&Engels,J.W.(2012),Bioanalytik,Springer Spektrum的第3版中。在优选的实施方案中，该方法选自包含微阵列、核酸测序、质谱和PCR的组，更优选实时PCR。在另一个优选的实施方案中，通过鉴定由SEQ ID NO22或1部分编码的多肽来检测与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体。本领域技术人员熟悉合适的方法，优选选自包含免疫测定法和质谱的组。使用本领域现有技术中描述的标准方法(例如Lottspeich,F.&Engels,J.W.(2012),Bioanalytik，第6章)可以产生抗体用于在蛋白质水平上区分包含SEQ ID NO22或1的核酸序列之间的差异。
根据本发明的方法可以任选地包括在样品中检测除了来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的核酸以外的一种或多种另外的核酸序列。这样的序列可以是来自与皮肤、毛发和指甲感染相关的病原体的另一种SEQ ID NO22或1。例如，所述方法可以包括检测来自断发毛癣菌、马毛癣菌和指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M的病原体的包含SEQ ID NO22或1的第一种核酸，和来自Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌和意瑞奈斯毛癣菌的病原体的包含SEQ ID NO22或1的第二种核酸。这样的另外的序列优选与编码来自与皮肤、毛发和指甲病相关的病原体的金属蛋白酶的序列一起同时检测。在优选的实施方案中，进行多重PCR反应以扩增待检测的序列，并且这可以任选地随后进行微阵列分析，优选使用包含编码金属蛋白酶的序列的SEQ ID NO22或1的扩增子和包含另外的序列之一的任何扩增子的荧光检测。
在优选的实施方案中，该方法可以包括步骤a)提供样品，优选来自患者。使用根据本发明的方法或试剂检查的样品可以从怀疑患有皮肤、毛发和指甲感染的患者获得，并且优选是患者身体的一部分的包含角蛋白的样品。在更优选的实施方案中，样品是指甲，毛发或皮肤样品，更优选是分离的样品。患者优选是哺乳动物患者，更优选人。或者，样品可以是环境样品，例如来自潜在受污染区域(例如游泳池或医院)的土壤或地板。在进一步分析之前，可以处理样品，例如通过提取存在的任何核酸。在优选的实施方案中，如本文所用，术语“提取”是指从样品纯化和/或浓缩核酸，例如以除去可能干扰扩增和/或检测的任何污染物。在优选的实施方案中，核酸是DNA或RNA，更优选DNA。用于提取核酸，优选用于检测病原体，更优选真菌病原体的方法和试剂可商购获得。可以直接使用样品或将提取的核酸用于检测，但是优选的是该方法包括步骤b)扩增包含SEQ ID NO22或1的任何核酸和任选的任何另外的一个或多个序列，从而产生一个或多个的扩增子。这种扩增可以通过PCR进行。在现有技术中描述了合适的方法和试剂，例如在Dennis,Y.M.,Chius,R.W.K.,and Allen Chan,K.C.(2006)Clinical applications of PCR,Humana Press第1章中。基本上将提取的样品或核酸与根据本发明的至少一个引物对和任选的另外的引物对接触，随后添加能够在PCR缓冲液中存在任何所需试剂(例如NTP和二价阳离子)的情况下扩增核酸的聚合酶。所得到的反应混合物进行数个扩增循环，每个循环包含变性步骤(所述变性步骤涉及分离核酸的两条互补链)，退火步骤(其使引物与核酸链杂交)和延伸反应(其涉及产生核酸的两条链的互补链)。其结果是，产生包含引物对和来自位于引物对的正向引物和反向引物之间的病原体的基因组核酸的序列的双链扩增子。扩增子以高于样品中核酸浓度的浓度存在，优选地按照增加优选的顺序，其浓度是样品中核酸浓度的超过10,102,103,104或105倍。可以进行用于PCR扩增和产生包含另外的序列的扩增子的几种反应。正向和/或反向引物可被标记，从而产生标记的扩增子。
在优选的实施方案中，用于PCR反应的引物对包含可检测标记，优选来自包含荧光、放射性、胶体金或酶促活性标记的组。更优选地，标记是优选选自包含cy-3，cy-5，HEX，FAM，ROX和TAMRA的组的荧光标记。在现有技术中已经描述了合适的标记和将它们连接到诸如引物的核酸并检测这些标记的方式。
步骤b)之后或伴随步骤b)，可以优选通过荧光、放射性、胶体金或化学发光来标记任何扩增子。在优选的实施方案中，标记可以在进行步骤b)之前与引物连接，例如如果荧光、放射性、酶促活性或化学发光标记与引物对的一个或两个引物连接。在另一个优选的实施方案中，扩增子可以在扩增反应进行时标记，例如通过掺入标记的NTP或平行标记反应。在另一个优选的实施方案中，可以在步骤b)后标记扩增子，例如通过将荧光、放射性、酶促活性或化学发光标记连接至扩增子，或通过向扩增子添加与双链DNA结合的标记，例如荧光嵌入剂如溴化乙锭或溴化丙锭。
步骤b)之后或伴随步骤b)，可以检测扩增子。例如，PCR可以是涉及随着反应进行的连续荧光检测的实时PCR。如果随后检测扩增子，则可以在步骤c)之前从PCR反应混合物中提取扩增子。对于随后的检测，可以在允许特异性杂交的条件下使扩增子(经提取的或未经提取的)与能够与来自病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸特异性杂交的核酸接触，所述核酸优选为包含来自包含SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID No.24-28及其变体的组的序列的核酸。包含SEQ ID NO22或1的核酸优选固定在承载体上。在进行检测之前，可以对其进行洗涤步骤以去除污染物。在这种情况下，优选的是扩增子被标记并且在存在的标记的扩增子与包含SEQ ID NO22或1的核酸特异性杂交的情况下检测标记。
优选地，进行检测以使得来自与皮肤、毛发和指甲疾病相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的扩增子可以与来自皮肤、毛发和指甲疾病相关的另一种病原体的包含SEQ ID NO22或1的扩增子或包含另外的或实际上任何其他序列的扩增子区别开。
根据本发明，可以提供包含引物对、核酸和/或承载体的试剂盒。引物对或核酸可以被标记。本发明的教导提供了一种试剂盒，优选用于诊断疾病。所述试剂盒可以包括详细说明如何使用所述试剂盒的说明书以及用于使能够与来自病原体的SEQ ID NO22或1特异性杂交的核酸与来自受试者优选人受试者的样品在承载体例如微阵列上接触的工具。此外，试剂盒可包含阳性对照，例如一种或多种来自与皮肤、毛发和指甲疾病相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸，和阴性对照，例如缺乏SEQ ID NO22或1的核酸。最后，这样的试剂盒可以包含标准溶液，其包含一种或多种来自与皮肤、毛发和指甲疾病相关的病原体的包含SEQ ID NO22或1的核酸，以用于制备校准曲线。在优选的实施方案中，SEQ ID NO22或1来自小孢子菌属和毛癣菌属的病原体，更优选来自包含以下的组的病原体：断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。
根据本发明，引物对、承载体、核酸、细胞、载体或试剂盒可用于诊断疾病或用于制造用于诊断疾病的试剂盒，所述疾病优选是皮肤、毛发和指甲疾病，更优选皮肤、毛发和指甲感染，更优选皮肤、毛发和指甲真菌感染，最优选皮肤癣菌病。优选地，所述疾病是与来自毛癣菌属的病原体相关的感染，所述病原体更优选来自断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)，Trichophyton benhamiae(黄色)，同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌(非洲)和意瑞奈斯毛癣菌。
在优选的实施方案中，本文所用的术语“诊断”是指旨在获得支持评估患者在过去、在诊断时或未来时是否患有或可能或比平均患者或比较患者(优选具有相似的症状)更可能患有某种疾病或病症的信息的任何类型的程序，以了解疾病如何在将来进展或可能进展或评估患者关于某种治疗(例如合适的药物，例如用于过敏患者脱敏的药物的施用)的反应性。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。
因此，术语“诊断”优选不意味着根据本发明的诊断方法或试剂将是确定性的并且足以基于单一测试(更不用说参数)来完成诊断，而是可以指对所谓的“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑一系列可能病情的可能性的系统诊断程序)的贡献。这可能包括间接诊断，即阴性结果意味着可排除一种疾病，但反过来，另一种疾病更可能存在。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换句话说，该方法或试剂可涉及选择受试者的治疗方案。术语“诊断”还可以指鉴定疾病的致病病原体或区分两种密切相关的病原体，优选Trichophyton benhamiae(黄色)或同心性毛癣菌。
本发明通过以下非限制性附图、序列和实施例进一步说明，从其中可以获得本发明的进一步的特征、实施方案、方面和优点。
图1显示了包含具有共同的核酸序列基序和衍生的共有序列的与金属蛋白酶相关的各种序列的序列比对。
图2显示了具有来自指间毛癣菌(嗜人)(A)、指间毛癣菌(嗜动物)(B)、断发毛癣菌(C)和马毛癣菌(D)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。用于断发毛癣菌的特异性探针由白色圆圈突出显示，虚线包围的点是软件设置网格所需的对照。只有来自断发毛癣菌模板(C)的PCR产物与特异性探针(6a，6b)杂交并显示荧光信号。
图3显示了具有来自Trichophyton benhamiae(黄色)(A)、Trichophyton benhamiae(白色)(B)、Trichophyton benhamiae(非洲)(C)和同心毛癣菌(D)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。用于Trichophyton benhamiae(黄色)和同心毛癣菌的特异性探针用白色圆圈突出显示，虚线包围的点是软件设置网格所需的对照。只有来自Trichophyton benhamiae(黄色)(A)和同心毛癣菌(D)模板的PCR产物与特异性探针杂交并显示荧光信号。
图4显示了具有来自Trichophyton benhamiae(白色)(A)、Trichophyton benhamiae(黄色)(B)和Trichophyton benhamiae(非洲)(C)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。Trichophyton benhamiae(黄色)和Trichophyton benhamiae(白色/非洲)的特异性探针用白色圆圈突出显示，虚线包围的点是软件设置网格所需的对照。来自Trichophyton benhamiae(白色)(A)、Trichophyton benhamiae(黄色)(B)和Trichophyton benhamiae(非洲)(C)模板的PCR产物与特异性探针杂交并显示荧光信号。
图5显示了具有来自意瑞奈斯毛癣菌(A)、Trichophyton benhamiae(白色)(B)和Trichophyton benhamiae(非洲)(C)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。用于意瑞奈斯毛癣菌的特定探针由白色圆圈突出显示，虚线包围的点是软件设置网格所需的对照。只有来自意瑞奈斯毛癣菌(A)模板的PCR产物与特异性探针杂交并显示荧光信号。
图6显示具有来自Trichophyton benhamiae(白色)(A)，Trichophyton benhamiae(黄色)(B)和同心毛癣菌(C)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。用于Trichophyton benhamiae(白色/非洲)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心圆毛癣菌的特异性探针用白色圆圈突出，虚线圈出的点是软件设置网格所需的对照。只有来自Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心圆毛癣菌模板的PCR产物与特异性探针杂交并显示荧光信号。
本发明涉及以下核酸序列(以5'-3'方向呈现)：
SEQ ID NO1：
待扩增的金属蛋白酶相关核酸的共有序列
CACNNNNNTAACCNTACCCnnnnTCCnnGnnGnnnGGnnnnnnAnCnnnTGGATTATGGnnTnnTTCGTGGAnTAnGGTnnnnAnnCGATCnTGnnnATGGCACTnnTnGGTnnnnTGnGnCAnnTnCCAAAAGnnGnnGCAGGGnnnnACCnnnTTnnnnnnTGGnAnGGTGTAGGCAATnnTTnTGnGnCnnCATCGnnGAnGnnnATCGnnGnAGnA
SEQ ID NO2：
来自断发毛癣菌的与金属蛋白酶相关的靶序列
CACGCTTATAACCGTACCCGAGATCCTTGGCGTACGGATGCATAACGGCTGGATTATGGGCTCCTTCGTGGATTATGGTCGAGACGCGATCTTGATGATGGCACTTATCGGTGAGATGAGGCAGTTGCCAAAAGATGTTGCAGGGGAAGACCGAATTCATGGCTGGGAGGGTGTAGGCAATAGTTCTGGGACGGCATCGTCGATGTTTATCGTAGCAGAACCACTGAACAGGGCCACCCTCTGAAACGGATGCTTTGGAAATCGAGTAGAGATGCATGGAAACCTCCTTCCTGGTTGCAGAATC
SEQ ID NO3：
来自马毛癣菌的与金属蛋白酶相关的靶序列
CACGCTCATAACCGTACCCGAGATCCCTGGCGTGCGGACGCATAACGGCTGGATTATGGGCTCCTTCGTGGATTATGGTCGAGACGCGATCTTGATGATGGCACTTATCGGTGAGATGAGGCAGTTGCCAAAAGATGTAGCAGGGGAAGACCGAATTCATGGCTGGGAGGGTGTAGGCAATAGTTCTGGGACGGCATCGTCGATGTTTATCGTAGCAGAACCACTGAACAGGGCCACCCTCTGGAACGGATGCTTTGGAAATCGAGTAGAGATGCATGGAAACCTCCTTCCTGGTTGCAGAATC
SEQ ID NO4:
来自指间毛癣菌(嗜人+嗜动物(zoophilic))I、II、II、III＊、IV、M的与金属蛋白酶相关的靶序列
CACGGTAATAACCGTACCCGAGGTCCCCGGCGTGCGGACTCATAACGGCTGGATTATGGGCTCCTTCGTGGATTATGGTCGAGACGCGATCTTGACCATGGCACTTCTTGGTGAGATGGGGCAGTTGCCAAAAGATGTCGCAGGGAAAGACCGAATTCATGGCTGGGAGGGTGTAGGCAATAGTTCTGCGACGGCATCGTCGATGTTTATCGTGGCAGAACCACTTAACAGGGCCACCCTCTGAAACGGATGCTTTGGAAATCGAGTTGAGATGCGCGGAAACCTCCTTCCTGGTTGCAGGATC
SEQ ID NO5:
来自Trichophyton benhamiae(黄色)的与金属蛋白酶相关的靶序列
CTCCGGTGAGAGAGTGCAATTGCACGATCGTAACCGTACCCCAAGTCCTTGCAGAACGGTGTAACAACCCTTGGATTATGGAGTAATTCGTGGATTATGGTGTCGACACGATCCTGGCCATGGCACTTATTGGTTTGGTGGGGCAGTTGCCAAAAGATGGAGCAGGGGAAGACCGAGTTCTCGCCTGGAAGGGTGTAGGCAATGATTTTGGGCCTACATCGGTGACGTGCATCGGAGCAGTAC
SEQ ID NO6:
来自Trichophyton benhamiae(白色)的与金属蛋白酶相关的靶序列
CTCTGGTGAGAGAGTGCAGTTGCACGATTGTAACCATACCCATGGTCCTTGCAGTGCGGTGTGACAGCATTTGGATTATGGGCTCCTTCGTGGATTACGGTCCCGACACGATCCTGACGATGGCACTCATTGGTGCGGTGGGGCAGTTGCCAAAAGAGGGAGCAGGGGTGAACCTCATTCCTAGCTGGAAAGGTGTAGGCAATGGTTCTGGGACTGCATCGGCGAGGACCATCGGAGCAGAAC
SEQ ID NO7:
来自Trichophyton benhamiae(非洲)的与金属蛋白酶相关的靶序列
CTCTTGTGAGAGAGTGCAGTTGCACGCTGATAACCGTACCCATGGTCCTTGCAGTGCGGCTTGACAACACTTGGATTATGGGCTCCTTCGTGGACTACGGTCCCGATACGATCCTGACGATGGCACTTATTGGTGCGGTGGGGCAGTTGCCAAAAGATGTCGCAGGGGTGAACCTCATTCCTAGATGGAAAGGTGTAGGCAATGGTTCTGGGACCGCATCGGCGAGGACCATCGGAGCAGAAC
SEQ ID NO8:
来自同心性毛癣菌的与金属蛋白酶相关的靶序列
CTCCGGTGAGAGAGTGCAGTTGCACGATTGTAACCGTACCCCAAGTCCTTGCAGAACGGTGTAACAACACTTGGATTATGGAGTAATTCGTGGATTATGGTGTCGACACGATCCTGGCCATGGCACTTATTGGTTTGGTGGGGCAGTTGCCAAAAGTTGGGGCAGGGGAAGACCGAGTTCTCGCCTGGAAGGGTGTAGGCAATGGTTCTGGGCCTACATCGGTGACGTGCATCGGAGTAGTAC
SEQ ID NO9:
来自意瑞奈斯毛癣菌的与金属蛋白酶相关的靶序列
CTCCCGTGAGAGAGTGCAGTTGCACTACTGTAACCGTACCCATGGTCCTTGCAGTGTGGGTTAGCAACATTTGGATTATGGAGTGCTTCGTGGATTACGGTCCCAACACGATCCTGACCATGGCACTTCTTGGTTTTGTGCGCCATATTCCAAAAGATGGGGCAGGGGTGAACCTCATTGTTAGATGGAAGGGTGTAGGCAATGGTTCTGGGACCGCATCGGCGAGGACCATCGGAGCAGTA
SEQ ID NO10:
通用正向引物(断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M)：
GGGAGGGAGACTAGTTG
SEQ ID NO11:
通用正向引物(Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌)
GCATTTCCCATGGCT
SEQ ID NO12:
通用反向引物(断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M)：
AATTTTTCGCCGCCAAG
SEQ ID NO13:
通用反向引物(Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌)
TGGCTCTGTTACGTG
SEQ ID NO14:
断发毛癣菌探针
GATCCTTGGCGTACGGATGCATA
SEQ ID NO15:
马毛癣菌探针
AGATCCCTGGCGTGCG
SEQ ID NO16:
指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III＊、IV、M探针
GAGATGCGCGGAAACCTC
SEQ ID NO17:
Trichophyton benhamiae(黄色)探针
GTGTAGGCAATGATTTTGGGCCTACAT
SEQ ID NO18:
Trichophyton benhamiae(白色)探针
TGCAGTGCGGTGTGACAGCATTTGG
SEQ ID NO19:
Trichophyton benhamiae(非洲)探针
CAGTGCGGCTTGACAACAC
SEQ ID NO20:
同心性毛癣菌探针
AAAGTTGGGGCAGGGGAAGA
SEQ ID NO21:
意瑞奈斯毛癣菌探针
TTGCAGTGTGGGTTAGCAACATTTG
SEQ ID NO22:
共有序列
cacnnnnntaaccntacccnnnntccnngnngnnnggnnnnnnancnnntggattatggnntnnttcgtggantanggtnnnnanncgatcntgnnnatggcactnntnggtnnnntgnnncanntnccaaaagnngnngcagggnnnnaccnnnttnnnnnntggnanggtgtaggcaatnnttntgnnncnncatcgnngangnnnatcgnngnagna
SEQ ID NO23:
引物
ctggccatggcacttattgg
SEQ ID NO24:
探针
gatgtaggcccaaaatcattgcctacac
SEQ ID NO25:
探针
ctgccccaacttttggcaactg
SEQ ID NO26:
探针
taggcaatgattttgggccta
SEQ ID NO27:
探针
catcggcgaggaccatcgga
SEQ ID NO28:
探针
gcaatggttctgggcctacatc
SEQ ID NO29:
来自红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的序列
cttttgtgagagagtccagttgcacgcctgtaaccgtacccgaagtccttgcagtacggtttggccacatttggattatggagtgcttcgtggactatagtggtgacacgatcctgaccatggcacttattggtccagtggggtagttgccaaaaggggccgcaggggaagaccgcattctgaattggaagagtgtaggcaatggttctgggcctacatcggtgatgcatatcggagcagtgc
SEQ ID NO30:
来自疣状毛癣菌的序列
ctattgggagggagtccagttgcactcctgtaaccgtacccatggtccttggcgtgcggggacataacatttggattatgggctccttcgtggattacggtcccaacacgatcctgacgatggcactccttgttgacgtggggcagttgccaaaagggggggcaggggaagaccgaattcatagatggaagggtgtaggcaatggttctgggactgcatcggcgatatttatcggagcagaac
实施例：以下实施例证实使用根据本发明的教导可区分不同的病原体菌株。
实施例1
引物和探针的设计
为了鉴定样品中的断发毛癣菌，选择金属蛋白酶基因作为有用的靶区域。基于寡核苷酸序列的比较，设计一组引物(正向引物5'cy3-GGGAGGGAGACTAGTTG 3'，反向引物5'cy3-AATTTTTCGCCGCCAAG 3')和用于检测断发毛癣菌的物种特异性探针(5'C6-氨基-接头-GATCCTTGGCGTACGGATGCATA 3')。对设计的探针检查内部重复序列、二级结构、解链温度和GC含量。
DNA微阵列
使用sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG，Germany)将设计的断发毛癣菌探针和一些对照点样在固体承载体材料上，作为位于限定位置的显微小点。
从皮肤癣菌培养物中提取DNA
在皮肤癣菌测试培养基琼脂(SIFIN，Germany，TN 2102)上进行培养。根据制造商的说明使用用于真菌的用于真菌的OmniPrepTM试剂盒(G-Biosciences,USA,no.786-399)提取来自培养的断发毛癣菌(CBS 483.76)、嗜人/嗜动物指间毛癣菌(2235，Pelo1)和马毛癣菌(CBS127.97)的DNA并通过内部转录间隔子(ITS)测序在物种水平上对其进行鉴定。
PCR
通过添加来自断发毛癣菌、指间毛癣菌(嗜人)、指间毛癣菌(嗜动物)或马毛癣菌的5μl DNA提取物(5ng/μl)以20μl体积进行每个PCR反应。每个反应物包含1x Green Flexi缓冲液(Promega，USA，X9801)，2.5mM MgCl2(Promega，USA，X9801)，0.4mM各dNTP(各25mM)(Bioline，Germany，BIO-39029)，0.75U Flexi DNA聚合酶(5U/μl)(Promega，USA，M830)，0.5μM正向引物和0.5μM反向引物(Metabion，Germany)。在ABI 2720热循环仪(Applied Biosystems，USA，no.4359659)中进行扩增，扩增由以下步骤组成：在96℃下进行预解链步骤3分钟，并且进行96℃15秒(解链)、52℃15秒(退火)、72℃40秒(延伸)的35个循环，并在在72℃保持1分钟以结束扩增。
杂交
PCR反应产生的扩增子包含与正向和/或反向引物的5'末端连接的荧光染料，其使得如果PCR产物结合至微阵列上的互补探针，可以通过微阵列扫描仪(EUROIMMUN AG，EUROArrayScanner，YG 0602-0101)检测扩增子。对于杂交步骤，将25μl PCR产物与65μl杂交缓冲液A(EUROIMMUN AG，杂交缓冲液A，ZM0101-0108)混合。使用EUROIMMUN滴定平板技术(EUROIMMUN AG，滴定平板+杂交平台，ZM 9999-0105+YG 0615-0101)将65μl该混合物与微阵列杂交。在55℃孵育1小时后，根据制造商的方案，用专用缓冲液洗涤EUROArray载玻片以去除非特异性结合序列(EUROIMMUN AG，洗涤剂1+2，ZM 0121-0050+ZM0122-0012)。洗涤后，载玻片用压缩空气干燥，并且只有强力配对的链保持杂交。与标记的PCR产物的杂交产生了通过微阵列扫描仪检测的信号。
读出和评估
使用EUROArrayScanner和EUROArrayScan软件(EUROIMMUN AG，EUROArrayScan软件，YG 0901-0101)完成最终数据读出及其评估。图2显示了具有来自断发毛癣菌、指间毛癣菌(嗜人)、指间毛癣菌(嗜动物)和马毛癣菌模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。
用于断发毛癣菌的特异性探针由白色圆圈突出显示，虚线包围的点是软件设置网格所需的对照。只有来自断发毛癣菌模板(C)的PCR产物与特异性探针(6a，6b)杂交并显示荧光信号，当使用来自任何其他菌株的DNA时，荧光信号不存在。
这证明本发明的方法可以用于区分与皮肤、毛发和指甲疾病相关的毛癣菌属菌株。
实施例2
材料与方法
DNA微阵列由DNA分子(探针)组成，它们的DNA序列彼此不同。当生物体的DNA含有与微阵列上这些确定的探针相匹配的片段时，互补DNA区域结合在一起(杂交)。由于在聚合酶链式反应(PCR)中使用荧光标记的引物，探针和扩增的靶序列之间的阳性杂交可通过微阵列扫描仪检测。评估的阳性信号意味着可以检测到靶序列。在这个实施例中，将显示通过DNA微阵列检测皮肤癣菌Trichophyton benhamiae(黄色)和同心毛癣菌。为了验证探针特异性，分析中还包括最密切相关的物种Trichophyton benhamiae(白色)和Trichophyton benhamiae(非洲)。使用的方法基于EUROIMMUN DNA微阵列平台。
引物和探针的设计
为了鉴定样品中的Trichophyton benhamiae(黄色)和同心毛癣菌，选择金属蛋白酶基因作为有用的靶区域。基于寡核苷酸序列的比较，设计一组引物(正向引物5'cy3-CTGGCCATGGCACTTATTGG 3'，反向引物5'cy3-TGGCTCTGTTACGTG 3')和用于检测Trichophyton benhamiae(黄色)(5'C6-氨基-接头-GATGTAGGCCCAAAATCATTGCCTACAC 3')和同心毛癣菌(5'C6-氨基-接头-CTGCCCCAACTTTTGGCAACTG 3')的物种特异性探针。对设计的探针检查内部重复序列，二级结构，解链温度(Tm)和GC含量。
DNA微阵列
使用sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG，Germany)将设计的用于Trichophyton benhamiae(黄色)、同心毛癣菌的探针和一些对照点样在固体承载体材料上，作为位于限定位置处的显微小点。
从皮肤癣菌培养物中提取DNA
在皮肤癣菌试验培养基琼脂(SIFIN，Germany，TN 2102)上进行培养。根据制造商的说明使用用于真菌的OmniPrepTM试剂盒(G-Biosciences,USA,no.786-399)提取来自培养的Trichophyton benhamiae(黄色)(CBS 623.66),Trichophyton benhamiae(白色)(CBS 280.83),Trichophyton benhamiae(非洲)(CBS 808.72)和同心毛癣菌(CBS 563.83)的DNA并通过内部转录间隔子(ITS)测序在物种水平上对其进行鉴定。
PCR
通过添加来自Trichophyton benhamiae(黄色)、Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(非洲)和同心毛癣菌的5μl DNA提取物(5ng/μl)以20μl体积进行每个PCR反应。每个反应物包含1x Green Flexi缓冲液(Promega，USA，X9801)，2.5mM MgCl2(Promega，USA，X9801)，0.4mM各dNTP(各25mM)(Bioline，Germany，BIO-39029)，0.75U Flexi DNA聚合酶(5U/μl)(Promega，USA，M830)，0.8μM正向引物和0.4μM反向引物(Metabion，Germany)。在ABI 2720热循环仪(Applied Biosystems，USA，no.4359659)中进行扩增，扩增由以下步骤组成：在96℃下进行预解链步骤3分钟，并且进行96℃15秒(解链)、52℃15秒(退火)、72℃40秒(延伸)的35个循环，并在在72℃保持1分钟以结束扩增。
杂交
所得到的PCR产物用荧光染料标记，其使得如果PCR产物结合至微阵列上的互补探针，可以通过微阵列扫描仪(EUROIMMUN AG，EUROArrayScanner，YG 0602-0101)检测PCR产物。对于杂交步骤，将25μl PCR产物与65μl杂交缓冲液A(EUROIMMUN AG，杂交缓冲液A，ZM0101-0108)混合。使用EUROIMMUN滴定平板技术(EUROIMMUN AG，滴定平板+杂交平台，ZM 9999-0105+YG 0615-0101)将65μl该混合物与微阵列杂交。在55℃孵育1小时后，根据制造商的方案，用专用缓冲液洗涤EUROArray载玻片以去除非特异性结合序列(EUROIMMUN AG，洗涤剂1+2，ZM 0121-0050+ZM0122-0012)。洗涤后，载玻片用压缩空气干燥，并且只有强力配对的链保持杂交。与标记的PCR产物的杂交产生了通过微阵列扫描仪检测的信号。
读出和评估
使用EUROArrayScanner和EUROArrayScan软件(EUROIMMUN AG，EUROArrayScan软件，YG 0901-0101)完成最终数据读出及其评估。图3显示了具有来自Trichophyton benhamiae(黄色)、Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(非洲)和同心毛癣菌模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。特异性探针(图3中的白色圆圈)与cy3标记的PCR产物杂交时，菌株被鉴定为Trichophyton benhamiae(黄色)或同心毛癣菌，微阵列中的对照也显示荧光信号，这是由于杂交缓冲液中标记的寡核苷酸与阵列角落的探针序列之间的杂交。
实施例3
材料与方法
DNA微阵列由DNA分子(探针)组成，它们的DNA序列彼此不同。当生物体的DNA含有与微阵列上这些确定的探针相匹配的片段时，互补DNA区域结合在一起(杂交)。由于在聚合酶链式反应(PCR)中使用荧光标记的引物，探针和扩增的靶序列之间的阳性杂交可通过微阵列扫描仪检测。评估的阳性信号意味着可以检测到靶序列。在这个实施例中，将显示通过DNA微阵列检测皮肤癣菌Trichophyton benhamiae(黄色)和Trichophyton benhamiae(白色/非洲)。使用的方法基于EUROIMMUN DNA微阵列平台。
引物和探针的设计
为了鉴定样品中的Trichophyton benhamiae(黄色)或Trichophyton benhamiae(白色/非洲)，选择金属蛋白酶基因作为有用的靶区域。基于寡核苷酸序列的比较，设计一组引物(正向引物5'cy3-CTGGCCATGGCACTTATTGG 3'，反向引物5'cy3-TGGCTCTGTTACGTG 3')和用于检测Trichophyton benhamiae(黄色)(5'C6-氨基-接头-TAGGCAATGATTTTGGGCCTA 3')和Trichophyton benhamiae(白色/非洲)(5'C6-氨基-接头-CATCGGCGAGGACCATCGGA 3')的物种特异性探针。对设计的探针检查内部重复序列，二级结构，解链温度(Tm)和GC含量。
DNA微阵列
使用sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG，Germany)将设计的用于Trichophyton benhamiae(黄色)、Trichophyton benhamiae(白色/非洲)的探针和一些对照点样在固体承载体材料上，作为位于限定位置处的显微小点。
从皮肤癣菌培养物中提取DNA
在皮肤癣菌试验培养基琼脂(SIFIN，Germany，TN 2102)上进行培养。根据制造商的说明使用用于真菌的OmniPrepTM试剂盒(G-Biosciences,USA,no.786-399)提取来自培养的Trichophyton benhamiae(黄色)(CBS 623.66),Trichophyton benhamiae(白色)(CBS 280.83)和Trichophyton benhamiae(非洲)(CBS 808.72)的DNA并通过内部转录间隔子(ITS)测序在物种水平上对其进行鉴定。
PCR
通过添加来自Trichophyton benhamiae(黄色)、Trichophyton benhamiae(白色)和Trichophyton benhamiae(非洲)的5μl DNA提取物(5ng/μl)以20μl体积进行每个PCR反应。每个反应物包含1x Green Flexi缓冲液(Promega，USA，X9801)，2.5mM MgCl2(Promega，USA，X9801)，0.4mM各dNTP(各25mM)(Bioline，Germany，BIO-39029)，0.75U Flexi DNA聚合酶(5U/μl)(Promega，USA，M830)，0.4μM正向引物和1.64μM反向引物(Metabion，Germany)。在ABI 2720热循环仪(Applied Biosystems，USA，no.4359659)中进行扩增，扩增由以下步骤组成：在96℃下进行预解链步骤3分钟，并且进行96℃15秒(解链)、52℃15秒(退火)、72℃40秒(延伸)的35个循环，并在在72℃保持1分钟以结束扩增。
杂交
所得到的PCR产物用荧光染料标记，其使得如果PCR产物结合至微阵列上的互补探针，可以通过微阵列扫描仪(EUROIMMUN AG，EUROArrayScanner，YG 0602-0101)检测PCR产物。对于杂交步骤，将25μl PCR产物与65μl杂交缓冲液A(EUROIMMUN AG，杂交缓冲液A，ZM0101-0108)混合。使用EUROIMMUN滴定平板技术(EUROIMMUN AG，滴定平板+杂交平台，ZM 9999-0105+YG 0615-0101)将65μl该混合物与微阵列杂交。在55℃孵育1小时后，根据制造商的方案，用专用缓冲液洗涤EUROArray载玻片以去除非特异性结合序列(EUROIMMUN AG，洗涤剂1+2，ZM 0121-0050+ZM0122-0012)。洗涤后，载玻片用压缩空气干燥，并且只有强力配对的链保持杂交。与标记的PCR产物的杂交产生了通过微阵列扫描仪检测的信号。
读出和评估
使用EUROArrayScanner和EUROArrayScan软件(EUROIMMUN AG，EUROArrayScan软件，YG 0901-0101)完成最终数据读出及其评估。图4显示了具有来自Trichophyton benhamiae(黄色)、Trichophyton benhamiae(白色)和Trichophyton benhamiae(非洲)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。特异性探针(图4中的白色圆圈)与cy3标记的PCR产物杂交时，菌株被鉴定为Trichophyton benhamiae(黄色)或Trichophyton benhamiae(白色/非洲)，微阵列中的对照也显示荧光信号，这是由于杂交缓冲液中标记的寡核苷酸与阵列角落的探针序列之间的杂交。
实施例4
材料与方法
DNA微阵列由DNA分子(探针)组成，它们的DNA序列彼此不同。当生物体的DNA含有与微阵列上这些确定的探针相匹配的片段时，互补DNA区域结合在一起(杂交)。由于在聚合酶链式反应(PCR)中使用荧光标记的引物，探针和扩增的靶序列之间的阳性杂交可通过微阵列扫描仪检测。评估的阳性信号意味着可以检测到靶序列。在这个实施例中，将显示通过DNA微阵列检测意瑞奈斯毛癣菌。为了验证探针特异性，分析中还包括最密切相关的物种Trichophyton benhamiae(白色)和Trichophyton benhamiae(非洲)。使用的方法基于EUROIMMUN DNA微阵列平台。
引物和探针的设计
为了鉴定样品中的意瑞奈斯毛癣菌，选择金属蛋白酶基因作为有用的靶区域。基于寡核苷酸序列的比较，设计一组引物(正向引物5’cy3-CTGGCCATGGCACTTATTGG 3’，5’cy3-TGGCTCTGTTACGTG 3’)和用于检测意瑞奈斯毛癣菌(5’C6-氨基-接头-GATGTAGGCCCAAAATCATTGCCTACAC 3’)的物种特异性探针。对设计的探针检查内部重复序列，二级结构，解链温度(Tm)和GC含量。
DNA微阵列
使用sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG，Germany)将设计的用于意瑞奈斯毛癣菌的探针和一些对照点样在固体承载体材料上，作为位于限定位置处的显微小点。
从皮肤癣菌培养物中提取DNA
在皮肤癣菌试验培养基琼脂(SIFIN，Germany，TN 2102)上进行培养。根据制造商的说明使用用于真菌的OmniPrepTM试剂盒(G-Biosciences,USA,no.786-399)提取来自培养的意瑞奈斯毛癣菌(CBS 677.86),Trichophyton benhamiae(白色)(CBS 280.83)和Trichophyton benhamiae(非洲)(CBS 808.72)的DNA并通过内部转录间隔子(ITS)测序在物种水平上对其进行鉴定。
PCR
通过添加来自意瑞奈斯毛癣菌、Trichophyton benhamiae(白色)和Trichophyton benhamiae(非洲)的5μl DNA提取物(5ng/μl)以20μl体积进行每个PCR反应。每个反应物包含1x Green Flexi缓冲液(Promega，USA，X9801)，2.5mM MgCl2(Promega，USA，X9801)，0.4mM各dNTP(各25mM)(Bioline，Germany，BIO-39029)，0.75U Flexi DNA聚合酶(5U/μl)(Promega，USA，M830)，0.5μM正向引物和0.5μM反向引物(Metabion，Germany)。在ABI 2720热循环仪(Applied Biosystems，USA，no.4359659)中进行扩增，扩增由以下步骤组成：在96℃下进行预解链步骤3分钟，并且进行96℃15秒(解链)、52℃15秒(退火)、72℃40秒(延伸)的35个循环，并在在72℃保持1分钟以结束扩增。
杂交
所得到的PCR产物用荧光染料标记，其使得如果PCR产物结合至微阵列上的互补探针，可以通过微阵列扫描仪(EUROIMMUN AG，EUROArrayScanner，YG 0602-0101)检测PCR产物。对于杂交步骤，将25μl PCR产物与65μl杂交缓冲液A(EUROIMMUN AG，杂交缓冲液A，ZM0101-0108)混合。使用EUROIMMUN滴定平板技术(EUROIMMUN AG，滴定平板+杂交平台，ZM 9999-0105+YG 0615-0101)将65μl该混合物与微阵列杂交。在55℃孵育1小时后，根据制造商的方案，用专用缓冲液洗涤EUROArray载玻片以去除非特异性结合序列(EUROIMMUN AG，洗涤剂1+2，ZM 0121-0050+ZM0122-0012)。洗涤后，载玻片用压缩空气干燥，并且只有强力配对的链保持杂交。与标记的PCR产物的杂交产生了通过微阵列扫描仪检测的信号。
读出和评估
使用EUROArrayScanner和EUROArrayScan软件(EUROIMMUN AG，EUROArrayScan软件，YG 0901-0101)完成最终数据读出及其评估。图5显示了具有来自意瑞奈斯毛癣菌、Trichophyton benhamiae(白色)和Trichophyton benhamiae(非洲)模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。特异性探针(图5中的白色圆圈)与cy3标记的PCR产物杂交时，菌株被鉴定为意瑞奈斯毛癣菌，微阵列中的对照也显示荧光信号，这是由于杂交缓冲液中标记的寡核苷酸与阵列角落的探针序列之间的杂交。
实施例5
材料与方法
DNA微阵列由DNA分子(探针)组成，它们的DNA序列彼此不同。当生物体的DNA含有与微阵列上这些确定的探针相匹配的片段时，互补DNA区域结合在一起(杂交)。由于在聚合酶链式反应(PCR)中使用荧光标记的引物，探针和扩增的靶序列之间的阳性杂交可通过微阵列扫描仪检测。评估的阳性信号意味着可以检测到靶序列。在这个实施例中，将显示通过DNA微阵列检测皮肤癣菌Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌。使用的方法基于EUROIMMUN DNA微阵列平台。
引物和探针的设计
为了鉴定样品中的Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌，选择金属蛋白酶基因作为有用的靶区域。基于寡核苷酸序列的比较，设计一组引物(正向引物5’cy3-GCATTTCCCATGGCT 3’,反向引物5’cy3-TGGCTCTGTTACGTG 3’)和用于检测Trichophyton benhamiae(白色/非洲)(5’C6-氨基-接头-CATCGGCGAGGACCATCGGA 3’)、Trichophyton benhamiae(黄色)(5’C6-氨基-接头-TAGGCAATGATTTTGGGCCTA 3’)和同心性毛癣菌(5’C6-氨基-接头-GCAATGGTTCTGGGCCTACATC 3’)的物种特异性探针。对设计的探针检查内部重复序列，二级结构，解链温度(Tm)和GC含量。
DNA微阵列
使用sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG，Germany)将设计的用于Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌的探针和一些对照点样在固体承载体材料上，作为位于限定位置处的显微小点。
从皮肤癣菌培养物中提取DNA
在皮肤癣菌试验培养基琼脂(SIFIN，Germany，TN 2102)上进行培养。根据制造商的说明使用用于真菌的OmniPrepTM试剂盒(G-Biosciences,USA,no.786-399)提取来自培养的Trichophyton benhamiae(非洲)(CBS 808.72)、Trichophyton benhamiae(黄色)(CBS 623.66)和同心性毛癣菌的DNA并通过内部转录间隔子(ITS)测序在物种水平上对其进行鉴定。
PCR
通过添加来自Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌的5μl DNA提取物(5ng/μl)以20μl体积进行每个PCR反应。每个反应物包含1x Green Flexi缓冲液(Promega，USA，X9801)，2.5mM MgCl2(Promega，USA，X9801)，0.4mM各dNTP(各25mM)(Bioline，Germany，BIO-39029)，0.75U Flexi DNA聚合酶(5U/μl)(Promega，USA，M830)，1.0μM正向引物和1.0μM反向引物(Metabion，Germany)。在ABI 2720热循环仪(Applied Biosystems，USA，no.4359659)中进行扩增，扩增由以下步骤组成：在96℃下进行预解链步骤3分钟，并且进行96℃15秒(解链)、52℃15秒(退火)、72℃40秒(延伸)的35个循环，并在在72℃保持1分钟以结束扩增。
杂交
所得到的PCR产物用荧光染料标记，其使得如果PCR产物结合至微阵列上的互补探针，可以通过微阵列扫描仪(EUROIMMUN AG，EUROArrayScanner，YG 0602-0101)检测PCR产物。对于杂交步骤，将25μl PCR产物与65μl杂交缓冲液A(EUROIMMUN AG，杂交缓冲液A，ZM0101-0108)混合。使用EUROIMMUN滴定平板技术(EUROIMMUN AG，滴定平板+杂交平台，ZM 9999-0105+YG 0615-0101)将65μl该混合物与微阵列杂交。在55℃孵育1小时后，根据制造商的方案，用专用缓冲液洗涤EUROArray载玻片以去除非特异性结合序列(EUROIMMUN AG，洗涤剂1+2，ZM 0121-0050+ZM0122-0012)。洗涤后，载玻片用压缩空气干燥，并且只有强力配对的链保持杂交。与标记的PCR产物的杂交产生了通过微阵列扫描仪检测的信号。
读出和评估
使用EUROArrayScanner和EUROArrayScan软件(EUROIMMUN AG，EUROArrayScan软件，YG 0901-0101)完成最终数据读出及其评估。图6显示了具有来自Trichophyton benhamiae(白色)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌模板的杂交PCR产物的捕获的微阵列。特异性探针(图6中的白色圆圈)与cy3标记的PCR产物杂交时，菌株被鉴定为Trichophyton benhamiae(白色/非洲)、Trichophyton benhamiae(黄色)和同心性毛癣菌，微阵列中的对照也显示荧光信号，这是由于杂交缓冲液中标记的寡核苷酸与阵列角落的探针序列之间的杂交。
序列表
<110> 欧蒙医学诊断技术有限公司
<120> 用于诊断皮肤癣菌病的测定法
<130> 14PP038EP
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 待扩增的核酸的共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(23)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
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<222> (33)..(35)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
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<222> (38)..(43)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(61)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(76)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(83)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(86)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(97)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(107)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(116)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (121)..(121)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(125)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (127)..(127)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (135)..(136)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (138)..(139)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (146)..(149)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (153)..(155)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (158)..(163)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (167)..(167)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (169)..(169)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(183)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (186)..(186)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (189)..(189)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (191)..(191)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (193)..(194)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (200)..(201)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (206)..(208)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (213)..(214)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (216)..(216)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (219)..(219)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 1
cacnnnnnta accntacccn nnntccnngn ngnnnggnnn nnnancnnnt ggattatggn 60
ntnnttcgtg gantanggtn nnnanncgat cntgnnnatg gcactnntng gtnnnntgng 120
ncanntncca aaagnngnng cagggnnnna ccnnnttnnn nnntggnang gtgtaggcaa 180
tnnttntgng ncnncatcgn ngangnnnat cgnngnagna 220
<210> 2
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自断发毛癣菌的靶序列
<400> 2
cacgcttata accgtacccg agatccttgg cgtacggatg cataacggct ggattatggg 60
ctccttcgtg gattatggtc gagacgcgat cttgatgatg gcacttatcg gtgagatgag 120
gcagttgcca aaagatgttg caggggaaga ccgaattcat ggctgggagg gtgtaggcaa 180
tagttctggg acggcatcgt cgatgtttat cgtagcagaa ccactgaaca gggccaccct 240
ctgaaacgga tgctttggaa atcgagtaga gatgcatgga aacctccttc ctggttgcag 300
aatc 304
<210> 3
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自马毛癣菌的靶序列
<400> 3
cacgctcata accgtacccg agatccctgg cgtgcggacg cataacggct ggattatggg 60
ctccttcgtg gattatggtc gagacgcgat cttgatgatg gcacttatcg gtgagatgag 120
gcagttgcca aaagatgtag caggggaaga ccgaattcat ggctgggagg gtgtaggcaa 180
tagttctggg acggcatcgt cgatgtttat cgtagcagaa ccactgaaca gggccaccct 240
ctggaacgga tgctttggaa atcgagtaga gatgcatgga aacctccttc ctggttgcag 300
aatc 304
<210> 4
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自指间毛癣菌(嗜人(anthrophilic)+嗜动物(zoophilic))、I、II、II、III*、IV、M的靶序列
<400> 4
cacggtaata accgtacccg aggtccccgg cgtgcggact cataacggct ggattatggg 60
ctccttcgtg gattatggtc gagacgcgat cttgaccatg gcacttcttg gtgagatggg 120
gcagttgcca aaagatgtcg cagggaaaga ccgaattcat ggctgggagg gtgtaggcaa 180
tagttctgcg acggcatcgt cgatgtttat cgtggcagaa ccacttaaca gggccaccct 240
ctgaaacgga tgctttggaa atcgagttga gatgcgcgga aacctccttc ctggttgcag 300
gatc 304
<210> 5
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自T. benhamiae (黄色)的靶序列
<400> 5
ctccggtgag agagtgcaat tgcacgatcg taaccgtacc ccaagtcctt gcagaacggt 60
gtaacaaccc ttggattatg gagtaattcg tggattatgg tgtcgacacg atcctggcca 120
tggcacttat tggtttggtg gggcagttgc caaaagatgg agcaggggaa gaccgagttc 180
tcgcctggaa gggtgtaggc aatgattttg ggcctacatc ggtgacgtgc atcggagcag 240
tac 243
<210> 6
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自T. benhamiae (白色)的靶序列
<400> 6
ctctggtgag agagtgcagt tgcacgattg taaccatacc catggtcctt gcagtgcggt 60
gtgacagcat ttggattatg ggctccttcg tggattacgg tcccgacacg atcctgacga 120
tggcactcat tggtgcggtg gggcagttgc caaaagaggg agcaggggtg aacctcattc 180
ctagctggaa aggtgtaggc aatggttctg ggactgcatc ggcgaggacc atcggagcag 240
aac 243
<210> 7
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T. benhamiae (非洲)
<400> 7
ctcttgtgag agagtgcagt tgcacgctga taaccgtacc catggtcctt gcagtgcggc 60
ttgacaacac ttggattatg ggctccttcg tggactacgg tcccgatacg atcctgacga 120
tggcacttat tggtgcggtg gggcagttgc caaaagatgt cgcaggggtg aacctcattc 180
ctagatggaa aggtgtaggc aatggttctg ggaccgcatc ggcgaggacc atcggagcag 240
aac 243
<210> 8
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自同心性毛癣菌的靶序列
<400> 8
ctccggtgag agagtgcagt tgcacgattg taaccgtacc ccaagtcctt gcagaacggt 60
gtaacaacac ttggattatg gagtaattcg tggattatgg tgtcgacacg atcctggcca 120
tggcacttat tggtttggtg gggcagttgc caaaagttgg ggcaggggaa gaccgagttc 180
tcgcctggaa gggtgtaggc aatggttctg ggcctacatc ggtgacgtgc atcggagtag 240
tac 243
<210> 9
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自意瑞奈斯毛癣菌的靶序列
<400> 9
ctcccgtgag agagtgcagt tgcactactg taaccgtacc catggtcctt gcagtgtggg 60
ttagcaacat ttggattatg gagtgcttcg tggattacgg tcccaacacg atcctgacca 120
tggcacttct tggttttgtg cgccatattc caaaagatgg ggcaggggtg aacctcattg 180
ttagatggaa gggtgtaggc aatggttctg ggaccgcatc ggcgaggacc atcggagcag 240
ta 242
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用正向引物(断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III*、IV、M)
<400> 10
gggagggaga ctagttg 17
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用正向引物(Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌)
<400> 11
gcatttccca tggct 15
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用反向引物(断发毛癣菌，马毛癣菌，指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III*、IV、M)
<400> 12
aatttttcgc cgccaag 17
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用反向引物(Trichophyton benhamiae(黄色)，Trichophyton benhamiae(白色)，Trichophyton benhamiae(非洲)、同心性毛癣菌，意瑞奈斯毛癣菌)
<400> 13
tggctctgtt acgtg 15
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 断发毛癣菌探针
<400> 14
gatccttggc gtacggatgc ata 23
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 马毛癣菌探针
<400> 15
agatccctgg cgtgcg 16
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 指间毛癣菌(嗜人+嗜动物)I、II、II、III*、IV、M探针
<400> 16
gagatgcgcg gaaacctc 18
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Trichophyton benhamiae(黄色)探针
<400> 17
gtgtaggcaa tgattttggg cctacat 27
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Trichophyton benhamiae(白色)探针
<400> 18
tgcagtgcgg tgtgacagca tttgg 25
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Trichophyton benhamiae(非洲)探针
<400> 19
cagtgcggct tgacaacac 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 同心性毛癣菌探针
<400> 20
aaagttgggg caggggaaga 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 意瑞奈斯毛癣菌探针
<400> 21
ttgcagtgtg ggttagcaac atttg 25
<210> 22
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(23)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(35)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(43)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(61)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(76)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(83)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(86)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(97)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(107)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(116)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(121)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(125)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (127)..(127)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (135)..(136)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (138)..(139)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (146)..(149)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (153)..(155)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (158)..(163)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (167)..(167)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (169)..(169)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(183)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (186)..(186)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (189)..(191)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (193)..(194)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (200)..(201)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (206)..(208)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (213)..(214)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (216)..(216)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (219)..(219)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 22
cacnnnnnta accntacccn nnntccnngn ngnnnggnnn nnnancnnnt ggattatggn 60
ntnnttcgtg gantanggtn nnnanncgat cntgnnnatg gcactnntng gtnnnntgnn 120
ncanntncca aaagnngnng cagggnnnna ccnnnttnnn nnntggnang gtgtaggcaa 180
tnnttntgnn ncnncatcgn ngangnnnat cgnngnagna 220
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ctggccatgg cacttattgg 20
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 24
gatgtaggcc caaaatcatt gcctacac 28
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 25
ctgccccaac ttttggcaac tg 22
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 26
taggcaatga ttttgggcct a 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 27
catcggcgag gaccatcgga 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 28
gcaatggttc tgggcctaca tc 22
<210> 29
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自红色毛癣菌的序列
<400> 29
cttttgtgag agagtccagt tgcacgcctg taaccgtacc cgaagtcctt gcagtacggt 60
ttggccacat ttggattatg gagtgcttcg tggactatag tggtgacacg atcctgacca 120
tggcacttat tggtccagtg gggtagttgc caaaaggggc cgcaggggaa gaccgcattc 180
tgaattggaa gagtgtaggc aatggttctg ggcctacatc ggtgatgcat atcggagcag 240
tgc 243
<210> 30
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自疣状毛癣菌的序列
<400> 30
ctattgggag ggagtccagt tgcactcctg taaccgtacc catggtcctt ggcgtgcggg 60
gacataacat ttggattatg ggctccttcg tggattacgg tcccaacacg atcctgacga 120
tggcactcct tgttgacgtg gggcagttgc caaaaggggg ggcaggggaa gaccgaattc 180
atagatggaa gggtgtaggc aatggttctg ggactgcatc ggcgatattt atcggagcag 240
aac 243