本发明涉及一种固定化小球藻处理养殖废水的方法，属于水体净化领域。
背景技术：
随着经济的发展，人们对水产品的需求日益增加，在捕捞量不能满足市场需求的情况下，水产养殖业得到了迅猛的发展。然而，粗放型经营、资源依赖型水产养殖方式导致的生态失衡、环境恶化、资源萎缩的状况在国内外己十分严重。原有的粗放型养殖方式对养殖废水不加以处理直接排放，加剧了养殖区邻近水域的水体富营养化程度和水质污染，并引发一系列有害的生态环境问题。
水产养殖废水中的主要污染物有氨氮、亚硝酸盐、有机物、磷及污损生物。传统的物理处理技术和化学处理技术前期投资大、能耗高、运行及维护费用高等缺点。而生物修复(在废水处理中使用植物，动物和其他微生物等)技术以其低成本和高生态效益的优势已经取得了国际世界越来越多的关注。但微生物处理，如活性污泥，通常是复杂和昂贵的，其在发展中国家的水产养殖废水处理应用方面是有限的。而微藻具有光合作用效率高、生长周期短、不需占用农业用地、环境适应能力强等特点。
微藻在生长过程中会吸收大量氮磷，在废水处理，尤其是氮磷的去除方面具有很大潜力。迄今已筛选出了许多可高效净化水质的藻种，尤以绿藻居多。但是用微藻处理废水同时也存在一些缺点：占地面积大、难以分离、细胞流失严重等问题。而固定化方法可以很好的解决藻水难以分离以及细胞流失等问题。现有的微藻固定化方法有利用海绵、卵石、砾石等材料进行生物吸附固定，此方法固定化效果差；有采用聚乙烯醇作为固定化材料，但聚乙烯醇具有一定的生物毒性；用壳聚糖固定化微藻虽具有一定的效果，但用壳聚糖做成的固定化小球机械强度差，球体易被生物降解。
固定化技术具有较高微生物浓度、易于固液分离、不易受毒物影响、剩余污泥量少等优点而在污水处理领域得到比较广泛应用。关于采取载体的选择，其对于固定化藻类的发展起到极为重要的作用，令人满意的固定化载体能够达到以下的标准：(1)无毒，不影响藻细胞活性；(2)具有良好的透光性；(3)具有良好的传质性能；(4)性质稳定，不易被分解；(5)机械强度高，使用寿命长；(6)成本较低。现有的微藻固定化方法有利用海绵、卵石、砾石等材料进行生物吸附固定，此方法固定化效果差；有采用聚乙烯醇作为固定化材料，但聚乙烯醇具有一定的生物毒性；用壳聚糖固定化微藻虽具有一定的效果，但用壳聚糖做成的固定化小球机械强度差，球体易被生物降解。而海藻酸钠作为一种食品添加剂对生物无毒，与cacl2溶液交联形成海藻酸钙具有较好的机械强度和孔隙率。因此，急需提供一种固定化效果好，机械强度好，经济适用，具有广泛的应用前景的固定化小球藻。
技术实现要素：
本发明的目的是将小球藻固定化后用于去除水产养殖废水中的氮磷，将小球藻用海藻酸钠包埋固定，投入水产养殖废水，用作废水脱氮除磷研究，控制光照、温度、光暗时间比。
本发明的第一个目的是提供一种固定小球微藻的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)离心收集小球藻，洗涤后，再用养殖废水配制成悬浮液，取一定体积悬浮液加入到与实验模拟废水中，使小球藻的od值在0.28-0.30之间。
(2)配置一定浓度的固定化溶液；
(3)将小球藻悬浮溶液和固定化溶液混合，摇匀后注入酸式滴定管中，将混合液滴入cacl2溶液中得到胶球；
(4)胶球在cacl2溶液中固定一定时间，取出后用废水冲洗得到固定化小球藻。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的小球藻悬浮液的od值在0.28-0.30之间。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的养殖废水性质为：95-110mg/l的tn、13-15mg/l的tp、60-80mg/l的nh4+-n、0.5-0.7mg/l的no3--n和1000-1300mg/l的cod。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的制备固定化溶液的固定化材料为琼脂、海藻酸钠、pva。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的制备固定化溶液的固定化材料为海藻酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的固定化溶液的浓度为质量分数的1-4％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的固定化溶液的浓度为质量分数的2-4％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的固定化溶液的浓度为质量分数的2-3％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中小球藻悬浮溶液和固定化溶液的混合体积比例为：1:10-100。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中cacl2溶液的浓度为质量分数2.0-2.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中胶球在cacl2溶液中固定化时间为1.5-2.5h。
本发明的第二个目的是提供一种固定小球微藻在污水处理方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述固定小球微藻在污水处理的方法为：将固定化小球藻投入废水中，利用固定化小球存在的孔隙，进行物质的交换，小球藻光合作用吸收二氧化碳释放氧气，污水中的氮以及一部分的磷通过孔隙被小球藻吸收利用，用于生物量的增长，一部分磷被固定化小球表面吸附以此来达到污水脱氮除磷的效果。
在本发明的一种实施方式中，所述为固定化小球藻投加量为220～880个/100ml。
本发明的有益效果：
本发明对固定化小球藻的固定化材料、固定化材料浓度及固定化小球藻投加量做了优化，使得固定化小球藻在处理水产养殖废水脱氮除磷过程中达到最佳效果。在最优条件下对废水中的氨氮、硝氮、总氮、总磷的去除率分别达到99.08％、77.55％、97.61％、92.83％。
传统的活性污泥法设备成本和运营成高，本发明利用海藻酸钠固定小球藻，用于水产养殖废水脱氮除磷，降低了水产养殖废水处理的成本。
本发明采用海藻酸钠包埋小球藻的方法来固定化小球藻在处理高氨氮浓度的水产养殖废水时避免高氨氮对小球藻的毒害作用，固定化小球藻较游离小球藻对高氨氮水产养殖废水具有较好的脱氮除磷效果。
附图说明
图1为海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的nh4+-n去除情况；
图2为海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的no3--n去除情况；
图3为海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的no2--n去除情况；
图4为海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的tn去除情况；
图5为海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的tp去除情况；
图6为固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的nh4+-n去除情况；
图7为固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的no3--n去除情况；
图8为固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的tn去除情况；
图9为固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的tp去除情况；
图10为不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的nh4+-n去除情况；
图11为不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的no3--n去除情况；
图12为不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的tn去除情况；
图13为不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的tp去除情况；
图14为不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的nh4+-n去除情况；
图15为不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的no3--n去除情况；
图16为不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的tn去除情况；
图17为不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的tp去除情况；
具体实施方式
材料：小球藻、海藻酸钠、琼脂、pva、水产养殖废水、光照培养箱、离心机、酸式滴定管、分光光度计、滤纸、电子天平、500ml烧杯、1000ml锥形瓶。
1.水产养殖废水性质
2.固定化步骤(以海藻酸钠为例)
取一个500ml锥形瓶，加入适当去离子水，称取适当的海藻酸钠在100℃恒温水浴锅内边加热边搅拌将其溶解，配置成适当浓度的海藻酸钠溶液。
取对数生长期的小球藻在4000g条件下离心5min，用自来水洗涤三次，再用养殖废水配成悬浮液，使其od值在0.28-0.30之间，记录体积v0ml。
取配制好的海藻酸钠溶液v1ml与小球藻悬浮液v0ml混合，摇匀。将其注入酸式滴定管中，然后滴入2.5％cacl2溶液中。胶球的直径在3-4mm，胶球在cacl2溶液中固定2h，取出用废水冲洗2-3次，洗掉胶球上残留的cacl2溶液。
实施例1：海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水脱氮除磷的情况
海藻酸钠(alginate)、琼脂(agar)和pva三种固定化材料包埋小球藻，方法如2所示。将等体积的浓度为2％的海藻酸钠、琼脂和pva藻液混合液做成的固定化小球藻分别投入500ml的水产养殖废水，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中。培养条件为25℃，光照4000lux，光暗比为12h:12h。每日摇晃锥形瓶5次，定时取样。
测定水样中的nh4+-n、no3--n、no2--n、tn和tp。图1，海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的nh4+-n去除情况。三种固定化小球藻对废水中的氨氮均有一定的去除效果，去除率分别为：95.65％、44.38％、29.27％，其中海藻酸钠作为包埋剂的固定化小球藻在处理废水中的氨氮效果最好，在第五天基本利用完。对比琼脂和pva作为包埋剂的固定化小球藻可以发现对废水中的氨氮的去除具有明显的优势，且后期不会增加水体中氨氮的浓度。
图2，海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的no3--n去除情况。可以看出，三种固定化材料对废水中的硝氮浓度均有一定的去除效果，去除率分别为：47.22％、80.56％、55.56％，从硝氮的去除率来看，琼脂作为固定化材料的效果最好。海藻酸钠和pva作为固定化材料的固定化小球藻对废水中的硝氮的去除效果相近，均只达到一半。
图3，海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的no2--n去除情况。图中显示废水中的亚硝氮的初始浓度很低，只有0.016mg/l；亚硝氮浓度在实验过程中有一定的波动，其中pva组在第3天开始检测发现亚硝氮含量超过0.02mg/l(水体中亚硝氮的含量超过0.02mg/l时对水生动物具有一定的毒性)；海藻酸钠和琼脂虽也有一定的波动，但检测数值均在0.02mg/l之下。
图4，海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的tn去除情况。从图中可以看出三种固定化材料作为包埋剂包埋小球藻形成的固定化小球对废水中的总氮均有一定的去除效果，海藻酸钠、琼脂和pva去除率分别为97.61％、63.72％、44.02％，其中海藻酸钠作为包埋剂的固定化小球藻对废水中总氮的去除效果最好。
图5，海藻酸钠、琼脂和pva三种固定化材料对水产养殖废水的tp去除情况。从图中显示三种固定化材料作为包埋剂包埋小球藻形成的固定化小球对废水中的总磷均有一定的去除效果，海藻酸钠、琼脂和pva去除率分别为92.83％、46.81％、35.72％。琼脂和pva在第三天后水样中的总磷浓度开始有所增加，考虑是固定化小球达到吸附饱和并且不能被包埋在小球内部的细胞很好的利用，吸附过饱和的磷重新释放到水体中。
实施例2：固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水脱氮除磷的情况
将培养至对数期的小球藻液4000r/min离心5分钟，去离子水洗三次后离心，取适当体积微藻液加入到500ml水产养殖废水中，调节藻密度(od)为0.3左右，再取等体积藻液用上述2固定化方法，用2％的海藻酸钠包埋小球藻制成固定化小球藻。另外再设置空白水样组和空白固定化小球组。将锥形瓶置于恒温光照培养箱中。培养条件为25℃，光照4000lux，光暗比为12h:12h。每日摇晃锥形瓶5次，定时取样。
测定水样中的nh4+-n、no3--n、tn和tp。图6，固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水(wastewater)的nh4+-n去除情况。从图中可以看出固定化小球藻对氨氮的去除效果相比于游离小球藻的去除效果要好很多，游离小球藻和固定化小球藻对氨氮的去除率分别为29.67％、92.14％，分析是高的氨氮对小球藻具有毒害作用，而用海藻酸钠包埋小球藻，保护了小球藻避免高氨氮的毒害作用；在第一天时发现游离小球藻(freechlorella)、空白小球(只有海藻酸钠，不含小球藻)(blankball)和固定化小球藻(immobilizedchlorella)对水中的氨氮均有明显的去除效果，考虑主要是吸附作用。
图7，固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的no3--n去除情况。从图中可以看出游离小球藻和固定化小球藻均能有效去除硝态氮，去除率分别为75.51％、77.55％。在前两天游离小球藻对硝态氮的利用效果比固定化小球藻要好；其后几天游离小球藻和固定化小球藻对硝态氮的利用趋于平稳，皆有很好的去除效果。
图8，固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的tn去除情况。从图中可以看出游离小球藻和固定化小球藻对总氮均有一定的去除效果，去除率分别达到53.39％、93.05％。小球藻可以利用氨态氮、硝态氮和亚硝态氮形式的氮。游离小球藻对氮的去除效果不及固定化小球藻，分析原因主要是由于氨氮的浓度较高，有可能抑制了小球藻的活性从而影响了小球藻对氮的去除。
图9，固定化小球藻和游离小球藻对水产养殖废水的tp去除情况。图中显示第一天游离小球藻、固定化小球藻和空白小球藻对总磷的去除率分别为：24.82％、28.06％、34.15％，均有一定的去除效果。游离小球藻在第一天后继续去除废水中的磷，主要是小球藻将磷酸盐吸收进入藻细胞进行生殖代谢合成自身所需的营养物质，从而将磷从废水中去除。第五天时游离小球藻和固定化小球藻对总磷的去除率分别为：42.16％、73.44％，固定化小球藻对磷的去除效果好于游离小球藻，分析原因海藻酸钙能有效吸附磷，并保护小球藻不受高氨氮的毒害，从而能更好的生长去除磷。
实施例3：不同海藻酸钠含量对水产养殖废水脱氮除磷的情况
将培养至对数期的小球藻液4000r/min离心5分钟，去离子水洗三次后离心，分别用浓度为1％、2％、3％、4％的海藻酸钠溶液根据2中的方法做成固定化小球。不同海藻酸钠浓度的固定化小球藻分别投入500ml的水产养殖废水(标记1％、2％、3％、4％)，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中。培养条件为25℃，光照4000lux，光暗比为12h:12h。每日摇晃锥形瓶5次，定时取样。
测定水样中的nh4+-n、no3--n、tn和tp。图10，不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的nh4+-n去除情况。图中显示不同海藻酸钠含量的固定化小球藻对废水中的氨氮均有良好去除效果。海藻酸钠含量分别为1％、2％、3％、4％的固定化小球藻在第三天时氨氮去除率分别达到65.83％、70.44％、94.50％、79.83％，其中含量为3％的固定化小球藻对氨氮的去除效果最好。在第五天时四个实验组的去除率达到了99.08％。
图11，不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的no3--n去除情况。图中显示不同海藻酸钠含量的固定化小球藻废水中的硝氮浓度均呈现先上升后下降的趋势。海藻酸钠含量为1％固定化小球藻，在第3天时硝氮的浓度达到最高，随后随着时间的增加，硝氮浓度下降。海藻酸钠含量分别为2％、3％、4％的固定化小球藻在第4天时硝氮的浓度达到最高，随后随着时间的增加，硝氮浓度下降。
图12，不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的tn去除情况。图中显示不同海藻酸钠含量的固定化小球藻废水中的总氮浓度均随着时间逐渐降低。显示不同海藻酸钠含量的固定化小球藻对废水中的总氮均有良好去除效果。海藻酸钠含量分别为1％、2％、3％、4％的固定化小球藻在实验第六天时对总氮的去除率分别为95.55％、95.70％、97.57％、94.31％，总氮浓度降为4.45mg/l、4.30mg/l、2.43mg/l、5.70mg/l。
图13，不同海藻酸钠含量对水产养殖废水的tp去除情况。图中显示不同海藻酸钠含量的固定化小球藻废水中的总磷浓度均随着时间的增加逐渐降低。显示不同海藻酸钠含量的固定化小球藻对废水中的均有良好去除效果。海藻酸钠含量分别为1％、2％、3％、4％的固定化小球藻在实验第六天时对总磷的去除率分别为71.10％、71.75％、79.97％、66.95％，总磷浓度分别为4.04mg/l、3.95mg/l、2.80mg/l、4.62mg/l。
实施例4：不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水脱氮除磷的情况
将培养至对数期的小球藻液4000r/min离心5分钟，自来水洗三次后离心，用浓度为3％的海藻酸钠溶液根据2中的方法做成固定化小球。固定化小球藻的投加量分别为200个/100ml、400个/100ml、600个/100ml、800个/100ml分别投入500ml的水产养殖废水(标记200个/100ml、400个/100ml、600个/100ml、800个/100ml)，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中。培养条件为25℃，光照4000lux，光暗比为12h:12h。每日摇晃锥形瓶5次，定时取样。
测定水样中的nh4+-n、no3--n、tn和tp。图14，不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的nh4+-n去除情况。图中显示不同固定化小球藻投加量对废水中的氨氮均有一定去除效果。随着微藻的生长，氨氮的浓度都有不同程度的降低。投加量为600个/100ml培养至第5天废水中的氨氮降到最低，为3.89mg/l，去除率为93.6％；投加量400个/100ml的水样在第6天中氨氮浓度降到最低，为3.02mg/l，去除率为95％；从氨氮的去除率以及药剂的成本考虑，400个/100ml的投加量比较合适。
图15，不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的no3--n去除情况。图中显示不同固定化小球藻投加量水样中的硝氮浓度均呈现先上升后下降的趋势。固定化小球藻投加量为600个/100ml水样中硝氮浓度在第3天时达到最大，随后随着时间硝氮浓度下降。固定化小球藻投加量为200个/100ml、400个/100ml、800个/100ml水样中硝氮浓度在第2天时达到最大，随后逐渐减小。
图16，不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水tn去除情况。图中显示不同固定化小球藻投加量对废水中的总氮均有良好的去除效果。水样中tn的初始浓度是103.10mg/l，投加量为400个/100ml、600个/100ml、800个/100ml三组的tn浓度均有明显降低，分别降为9.72mg/l、6.68mg/l和10.93mg/l，去除率分别为90.57％、93.52％和89.4％。
图17，不同固定化小球藻投加量对水产养殖废水的tp去除情况。图中显示不同固定化小球藻投加量对废水中的总磷均有一定的去除效果。投加量为200个/100ml、400个/100ml、600个/100ml、800个/100ml对tp的去除率分别为52.02％、69.80％、82.35％和73.64％。其中固定化小球藻投加量为600个/100ml对tp的去除效果最好，总磷浓度降为2.80mg/l。从总体趋势来看固定化小球的投加量越多对tp的去除效果越好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。