本发明属于表位抗体的制备技术领域，具体涉及一种能够识别鸡新城疫病毒的表位抗体的制备方法。
背景技术：
新城疫(Newcastle Disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高触性禽类传染病，其发病率与死亡率都很高，严重危害着我国养禽业的发展。新城疫病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属，单股负链RNA病毒，有囊膜，其基因组全长为15186bp，编码6个结构蛋白，包括磷蛋白(P)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)以及血凝素-神经氨酸蛋白(HN) 六种蛋白。血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)具有血凝素活性(HA)及神经酸氨酶活性(NA) 并能协同F蛋白发挥作用，在病毒感染过程中，HN蛋白特异性地识别宿主细胞表面唾液酸受体，这是病毒感染宿主细胞所必需的，并且能够诱导机体产生保护性免疫抗体。
目前，常用的检测方法有血凝素反应(hemagglutinin，HA)、血凝抑制反应(hemagglutinin inhibition，HI)、酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和实时定量PCR等检测方法，然而这些方法都比较耗时费力，需要实验室特殊的设备才能检测，并且不能及时地对鸡新城疫病毒的流行传播做出诊断。现有的NDV免疫胶体金检测方法是通过小鼠骨髓瘤细胞制备NDV单克隆抗体，然后标记胶体金制备NDV快速检测试纸条，此方法需要制备纯化的抗原，免疫小鼠，饲养动物细胞等繁琐的过程。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一种能够识别鸡新城疫病毒的表位抗体的制备方法，该方法是根据筛选到的NDV病毒一条能够识别NDV抗体的多肽P25，再根据该多肽P25 筛选出针对多肽P25的表位抗体，该多肽P25表位抗体能够与新城疫病毒发生特异性反应，缩短了制备NDV多肽P25表位抗体的过程。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种能够识别鸡新城疫病毒的表位抗体的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)新城疫病毒高免血清的制备，将新城疫病毒接种于鸡成纤维细胞，72h后收获病毒，用蔗糖梯度离心的方法纯化新城疫病毒，以1mg/mL的浓度肌肉注射给2周龄的小鸡，当出现临床症状时采集血清，用多肽P25通过ELISA方法检测抗体滴度，将收集到的血清于56℃灭活30min，-70℃保存备用，其中多肽P25的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1 所示；
(2)多肽P25表位抗体的制备，根据Immobilization Kit试剂盒，将多肽 P25稀释到500ug/mL，标记免疫亲和层析柱，将制备的新城疫病毒高免血清通过免疫亲和层析柱，最后用洗脱液洗脱多肽P25表位抗体，重复2～3次，将收集到的多肽P25单克隆抗体于-20℃保存备用。
本发明具有以下有益效果：本发明获得的多肽P25单克隆抗体与鸡新城疫病毒反应，显示出高灵敏性和特异性。与其它家禽疾病如IBDV和AIV无交叉反应性，与血细胞凝集试验高度一致。与HA试验相比，该多肽P25单克隆抗体可以检测5U NDV。此外，该方法制备NDV多肽P25单克隆抗体的方法大大缩短了常规方法制备NDV多肽P25表位抗体的时过程。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
1.材料与方法
1.1病毒株和血清
NDV分离自河南省某鸡场临床感染组织，禽流感病毒(AIV)、鸡法氏囊病毒(IBDV) 本实验室保存；新城疫病毒mAb本实验室制备，rabbit anti-chicken IgG购自SIGMA公司。 1.2方法
1.2.1新城疫病毒高免血清的制备
将新城疫病毒接种于鸡成纤维细胞，72h后收获病毒，用蔗糖梯度离心的方法纯化新城疫病毒，以1mg/mL的浓度肌肉注射给2周龄的小鸡，当出现临床症状时采集血清，用多肽P25通过ELISA方法检测抗体滴度，将收集到的血清于56℃灭活30min，-70℃保存备用，其中多肽P25的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
1.2.2多肽P25抗体的制备
根据Immobilization Kit试剂盒，将多肽P25稀释到500ug/mL，标记免疫亲和层析柱，将制备的新城疫病毒高免血清通过免疫亲和层析柱，最后用洗脱液洗脱多肽 P25表位抗体，重复2～3次，将收集到的多肽P25表位抗体于-20℃保存备用。
1.2.3血凝试验检测NDV病毒
根据所有新城疫病毒株都可以凝集鸡红细胞，并且是肉眼可见的，血细胞凝集试验检测NDV病毒颗粒是新城疫检测的金标准。首先分别在V形底微孔板中加入25μL PBS，然后将25μL的测试样品置于第一孔中，依次将NDV稀释至2-1-2-9。向每个孔中加入25μL 的1％红细胞，然后在室温下轻轻敲打板的侧面15min，读取并记录每个孔中的结果。
1.2.4多肽P25表位抗体的灵敏性和特异性检测
用血细胞凝集试验(HA)测定NDV毒株的样品的病毒滴度，然后用多肽P25表位抗体检测含有NDV病毒1～50U的连续稀释度。血细胞凝集素检测的病毒滴度中的1U指的是可以引起红细胞完全凝集的最小量的病毒。同时，感传染性法氏囊病毒(IBDV)和禽流感病毒(AIV)用作阴性对照。检测方法如下：
将NDV病毒按照50～1U稀释包被ELISA反应板，每个稀释度重复3次，4℃过夜； PBST清洗6次，加入5％的脱脂奶封闭，37℃1h；PBST清洗6次，加入多肽P25表位抗体，1:800稀释，每孔50uL，37℃1h；PBST清洗6次，加入兔抗鸡IgG-HRP，1:1000稀释，每孔50uL，37℃1h；PBST清洗6次，加入显色液反应3～5min，终止反应，观察结果。
1.2.5临床样品检测
收集不同地区疑是感染NDV病毒病鸡组织86份，包括气管，盲肠扁桃体，口腔拭子，肠等，分别取少许组织样品，加入1mL PBS研磨，反复冻融3次后，12000rpm离心1min。分别用HA和多肽P25表位抗体检测新城疫病毒。
2.结果
2.1血凝抑制检测NDV
室温15min后，红细胞完全凝集。结果表明2-8稀释的病毒液可以完全凝集鸡红细胞。因此，NDV毒株的HA效价是2-8，即NDV毒株的血细胞凝集中病毒滴度的1U是2-8。
2.2灵敏性与特异性检测
多肽P25表位抗体检测NDV病毒的灵敏度，与血凝集相比，NDV抗原快速检测试纸条能够检测到5U NDV。通过对2个阳性NDV样品进行检测，IBDV毒株和AIV毒株用作阴性对照。结果表明，2个NDV样品结果呈阳性，而IBDV毒株和AIV毒株结果呈阴性。
2.3临床样品检测结果
将河南各地市鸡场采集的86份鸡各器官组织样品，研磨后PBS稀释1:100，用NDV 多肽P25表位抗体对其进行检测，同时用商品化ELISA试剂盒检测，检测结果见表1，结果表明多肽P25表位抗体与ELISA有较高的符合率，为97.22％(35/36)。
表1 NDV临床检测结果
收集不同地区疑是感染NDV病毒病鸡组织86份，包括气管，盲肠扁桃体，口腔拭子，肠等，分别取少许组织样品，加入1mL PBS研磨，反复冻融3次后，12000rpm离心1min，分别用HA和多肽P25表位抗体检测。结果显示：多肽P25表位抗体检测结果与HA检测结果高度一致，其准确率达到98.8％(85/86)。
表2 NDV临床检测结果
3.讨论
新城疫(Newcastaldisease，ND)是危害我国养禽业最严重的疫病之一，与高致病性禽流感并列为世界公认的最重要的2个禽类疫病。该病为OIE规定的必须报告的疾病，也是我国规定的一类动物疫病，世界各国对新城疫的防制和研究一直十分重视。HN蛋白是NDV 病毒一种重要的多功能表面糖蛋白，由细胞质结构域，跨膜区，茎区和球状头组成，其中存在受体结合表位、神经氨酸酶活性位点和抗原表位。前期试验表明，新城疫病毒HN蛋白的多肽P25(TCPDEQDYQLRMA)可以与NDV超免疫血清反应。
通过筛选到的多肽P25表位抗体与鸡新城疫病毒以及禽流感病毒(AIV)、鸡法氏囊病毒(IBDV)进行ELISA检测，显示出高灵敏度和特异性。与其他家禽疾病如IBDV和AIV 血清无交叉反应性，与HA检测结果高度一致，达到98.8％。因此，筛选到的该多肽P25 表位抗体能够用于鸡新城疫病毒的特异性检测。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110> 新乡学院
<120> 一种能够识别鸡新城疫病毒的表位抗体的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Leu Arg Met Ala
1 5 10