本发明属于食品加工领域，具体涉及一种葡萄籽油及其制备方法，尤其是一种活性成分尤其是多酚含量高的葡萄籽油及其制备方法。
背景技术：
：随着社会生活水平的不断提高，人们的饮食习惯也发生了变化，暴饮暴食造成很多人都患有“三高症”，即高血糖、高血压和高血脂。其中，高血糖患者最为常见，需严格控制饮食，低糖低盐，严重者还需服用降血糖药。这也使得很多高血糖患者在饮食方面都选择少放油甚至不放油。葡萄籽油是由酿造葡萄酒或果汁压榨的副产物葡萄籽进一步加工获得的高级食用油。葡萄籽油营养丰富，不饱和脂肪酸高达90％以上，主要为亚油酸(70％以上)、油酸、棕榈酸和硬脂酸。亚油酸为人体必须脂肪酸，是构成人体细胞膜和皮肤的重要组成之一，可维持成年人的血脂平衡、降低胆固醇、改善心血管疾病。葡萄籽油中还含有酚类化合物，如没食子酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素等，近年来的研究已报道了这些酚类化合物具有广泛的生物活性：抗氧化、抗癌、自由基清除作用、抗炎症、抗病毒、降血糖等效果。此外，葡萄籽油中还含有植物甾醇、角鲨烯、多种脂溶性维生素(a、e、d、k、p)和多种微量元素(ca、fe、zn、mn、cu)。马玲等对葡萄籽油对小鼠脏器的抗氧化作用进行了研究，测定小鼠组织过氧化脂质含量、谷胱肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活力。结果表明，葡萄籽油实验组小白鼠的肝、肾脏器谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物酶的活性高于对照组，各脏器的丙二醛的含量明显低于对照组，证明葡萄籽油具有一定抗氧化作用。lutterodt等人，研究了冷榨霞多丽，马斯卡丹，红宝石，和康克德葡萄籽油的自由基清除能力，以trolox当量表示籽油对dpph自由基的清除力，结果表明籽油的dpph自由基清除率范围从0.07到2.22mmol/g。葡萄籽油营养价值和医疗作用均得到国内外医学界及营养学家的充分肯定。目前，市面上的葡萄籽油多采用冷榨和溶剂萃取技术。压榨法出油率不高，溶剂浸出法存在溶剂残留问题。水酶法是一种环保型油脂提取技术，通过粉碎和酶解来降解植物细胞壁，释放油料细胞中的油脂。水酶法相对传统工艺，具有以下优点：避免高温对物料活性成分的影响，游离油得率较高，色泽浅，蛋白质变性程度小，且有利于环境保护和油脂工业的可持续发展。近年来，大量文献针对提高水酶法葡萄籽油提取率不断进行工艺优化。李丹丹(2017)采用复合酶(纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶)酶解9h，冻融法破乳，出油率为9.947％，酸值0.52(koh)/(mg/g)。高璐等(2009)采用酶解以及有机溶剂萃取所得葡萄籽油提取率达到88.9％，酸值0.43(koh)/(mg/g)；胡滨等(2015)先采用纤维素酶酶解2h，后采用中性蛋白酶酶解1.5h，葡萄籽油提取率为77.48％；在此基础上超声预处理15min，提取率达87.65％；而后采用微波破乳，提取率可达93.83％，酸值2.16(koh)/(mg/g)。吕姗姗采用蒸汽预处理结和纤维素酶/蛋白酶水解8h，出油率为13.26％，酸值1.24(koh)/(mg/g)。但是有关于酶解工艺制得葡萄籽油的活性成分研究相对较少，而葡萄籽油中的酚类物质是其主要的抗氧化物质，在酶解过程中最容易发生氧化、降解。因此，急需一种能提高葡萄籽油中活性成分尤其是多酚含量，同时兼顾葡萄籽油提取率的葡萄籽油的制备方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种活性成分尤其是多酚含量高的葡萄籽油及其制备方法。本发明的一个目的是提供一种葡萄籽油，其总酚含量≥30mg/kg。进一步的，所述葡萄籽油其不饱和脂肪酸≥86.63％、总生育酚≥253.6mg/kg、总甾醇≥2.588mg/g、酸值为0.168(koh)/(mg/g)。本发明的另一个目的提供一种制备葡萄籽油的方法，包括如下步骤：(1)葡萄籽粉碎，过筛得到葡萄籽粉；(2)步骤(1)得到的葡萄籽粉加水混匀制得浆液，调浆液ph至酸性，加入混合酶，经酶解反应后得到第一混合液；(3)将步骤(2)的第一混合液的ph调至酸性，加入酸性蛋白酶酶解得到酸解液；(4)将步骤(3)的酸解液加入碱液调ph至碱性，反应得到第二混合液；(5)对步骤(4)的第二混合液灭酶，离心分离，取上层游离油，得到葡萄籽油。本发明步骤(1)先对葡萄籽进行预处理得到葡萄籽粉，所述预处理具有为粉碎、过筛。在一些实施方案中，所述步骤(1)中的过筛是过20-60目筛。在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中的葡萄籽粉其水分及挥发物含量为7.0％-9.0％，含油率为14-20％，粗蛋白含量为8-10％，纤维含量为26-30％。本发明步骤(2)对葡萄籽粉进行混合酶酶解。首先葡萄籽粉加水混合制得浆液，调浆液ph至酸性，加入混合酶，进行混合酶酶解，经酶解反应后得到第一混合液。在一些实施方案中，所述步骤(2)中的浆液是由水与葡萄籽粉按体积质量比3-6(ml)：1(g)混匀制备。在一些具体实施例中，所述步骤(2)中的浆液是由水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制备。在一些具体实施例中，所述步骤(2)中的浆液是由水与葡萄籽粉按体积质量比6(ml)：1(g)混匀制备。在一些实施方案中，所述步骤(2)中调浆液ph至2-6。在一些具体实施例中，所述步骤(2)中调浆液ph至5。在一些实施方案中，所述步骤(2)中所述混合酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和木聚糖酶按(0.6-0.7)：(0.1-0.15)：(0.1-0.2)：(0.1-0.15)的质量比混合。在一些具体实施例中，所述步骤(2)中所述混合酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和木聚糖酶按0.6：0.1：0.2：0.1的质量比混合。在一些实施方案中，所述步骤(2)中混合酶添加量为浆液的1wt％-2wt％。在一些具体实施例中，所述步骤(2)中混合酶添加量为浆液的2wt％。在一些实施方案中，所述酶解反应是在40-60℃，反应1-3h。本发明步骤(3)对第一混合液进行酸性蛋白酶酶解。首先将步骤(2)中的第一混合液的ph调至酸性，然后加入酸性蛋白酶酶解得到酸解液。在一些实施方案中，所述步骤(3)中调ph至2-6。在一些具体实施例中，所述步骤(3)中调ph至2。在一些实施方案中，所述步骤(3)中酸性蛋白酶添加量为1wt％-2wt％。在一些具体实施例中，所述步骤(3)中酸性蛋白酶添加量为1wt％。在一些实施方案中，所述步骤(3)中所述酶解反应是在40-60℃，反应1-3h。在一些具体实施例中，所述步骤(3)中所述酶解反应是在50℃，反应3h。本发明步骤(4)对得到的酸解液进行碱提取。将步骤(3)中的酸解液加入碱液调ph至碱性，反应得到第二混合液。在一些实施方案中，所述步骤(4)中的调ph至8-10。在一些具体实施例中，所述步骤(4)中的调ph至8。本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的碱液为氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20-40(g)：1(l)配置。在一些实施方案中，所述步骤(4)中所述反应是在40-60℃下反应20-40min。在一些具体实施例中，所述步骤(4)中所述反应是在50℃下反应30min。本发明步骤(5)从第二混合液提取葡萄籽油。对步骤(4)中第二混合液灭酶，离心分离，取上层游离油，得到葡萄籽油。在一些实施方案中，所述步骤(5)中灭酶为将浆液升温至80-90℃灭酶10-20min，冷却。在一些具体实施例中，所述步骤(5)中灭酶为将浆液升温至85℃灭酶15min，冷却。在一些实施方案中，所述步骤(5)中所述离心转速为3000-4000r/min，离心10-20min。在一些具体实施例中，所述步骤(5)中所述离心转速为3500r/min，离心15min。本发明还提供了上述的方法得到的葡萄籽油。在一个具体实施方案中，考察了本发明制取的葡萄籽油降血糖的功效，结果显示本发明制取的葡萄籽油可以有效地改善小鼠糖耐量，显著地降低小鼠胆固醇、甘油三酯、胰岛素和hba1c的含量，且效果比玉米油好。本发明制取的葡萄籽油(gso)组白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、c反应蛋白含量均有降低。结果表明本发明制得葡萄籽油具有明显的辅助降血糖效果。因此本发明还提供了所述的葡萄籽油在保健食品中的应用。本发明采用复合植物水解酶和酸性蛋白酶分步水解法提取葡萄籽油，极大的保留了葡萄籽油中的活性成分尤其是多酚的含量，同时兼顾葡萄籽油提取率。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果之一：(1)相比于压榨或浸出制备葡萄籽油，本发明极大的保留了葡萄籽油中的活性成分，如不饱和脂肪酸(86.63％)、总酚(37.46mg/kg)、总生育酚(253.6mg/kg)、总甾醇(2.588mg/g)，明显高于现有的水酶法制得的葡萄籽油的活性成分含量。且制得的葡萄籽油澄清透明可作为高端保健用油。(2)本发明所述制备方法，用时短，可有效破坏葡萄籽仁细胞的细胞壁，使得细胞中的油脂更易萃取出，有效提高葡萄籽油的提取率。(3)通过采用碱提法破乳，与其他水酶法采用有机溶剂萃取油脂相比，避免了溶剂残留，同时能有效降低葡萄籽毛油的酸值0.168(koh)/(mg/g)，无需后期碱炼过程。(3)该方法操作简单，成本低，适于工业化生产。具体实施方式本发明公开了一种葡萄籽油及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所用原料或辅料(酶制剂)均可由市场购得。以下实施例中，玉米油、猪油均为市售。葡萄籽含油率测定：按照gb/t5009.6-2003采用索氏抽提法测定。葡萄籽油酸值的测定：按照gb/t5530-2005《动植物油脂酸价和酸度测定》采用冷溶剂法测定。出油率测定方法：葡萄籽油提取率(％)＝(游离油质量/葡萄籽仁质量)×100。提取率测定方法：葡萄籽油提取率(％)＝游离油质量/(葡萄籽粉质量×葡萄籽含油率)×100。葡萄籽油总酚含量测定：按照gb/t8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》采用福林酚法分光光度计测定。总生育酚测定方法：样品前处理：称取1.5g(精确到0.001g)油样，置于棕色容量瓶中，加入适量正己烷溶解，超声5min后定容至10ml，过0.22um微孔滤膜后进行液相色谱hplc分析。hplc条件：色谱柱为silica(4.6mm×250mm，5μm)；紫外检测波长295nm，流动相为正己烷：异丙醇＝98.5:1.5；流速1.0ml/min；柱温25℃；进样量10.0μl。总甾醇测定方法：样品前处理：称取0.2±0.01g葡萄籽油，添加0.1mg/ml5α-胆甾烷醇标准液作内标物，再加入3ml2mol/lkoh-ch3ch2oh溶液，超声波处理5min，85℃水浴皂化30min，冷却后加入2ml水和5ml正己烷，振荡，4000r/min离心5min，取上清液，下层用5ml正己烷再提取两次，合并有机层，水洗至中性，n2吹干，加入200μl衍生化试剂bstfa+tmcs(99:1)，75℃水浴30min，过0.22μm微孔滤膜后进行gc-ms分析。气相色谱条件：色谱柱：thermotr-5ms(30m×0.25mm，0.25μm)，进样量1.0μl，进样口温度280℃，氦气he，流速1.2ml/min。程序升温：初温200℃，以10℃/min升温至250℃，保持1min，以5℃/min升温至300℃，保持20min。质谱条件:接口温度250℃，电离方式ei，电子能量70ev，离子源温度250℃，质量扫描范围m/z50～550amu。不饱和脂肪酸测定方法：样品前处理：称取油样0.03±0.001g葡萄籽油，加入0.5mol/l的naoh-ch3oh溶液2ml，振荡均匀，65℃水浴加热至油珠完全溶解，静置冷却，加入25％的bf3-ch3oh溶液2ml，65℃水浴条件下酯化20min，静置冷却，加入2ml正己烷，充分振摇后加入2ml饱和nacl溶液，离心15min，取上层有机相于干燥样品瓶中，加入少量无水na2so4除去微量的水。气相色谱条件：peg-20m毛细管柱(30m×0.32mm，0.25μm)；载气：纯度为99.999％的n2；吹扫流量：3ml/min；进样量：1μl；分流比80:1；进样口温度250℃；检测器温度250℃；fid检测器。升温程序：初始温度150℃，以5℃/min升至190℃，保持2min，再以5℃/min升至240℃，保持10min。色泽的测定方法：使用测色仪测定葡萄籽油的色泽。测量中使用ciel*a*b*表色空间。颜色参数及定义：l*为明度(黑-白，0-100)、a*为红绿色相(绿-红，-a*-+a*)、b*为黄蓝色相(蓝-黄，-b*-+b*)。实验动物：c57bl/6j小鼠，spf级，体重(18±2)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。主要仪器：血糖仪，roche；酶标仪，美国biotekcytation公司；超低温冷冻冰箱，美国thermofisherscientific；7200型分光光度计，上海谱元仪器有限公司；试剂盒，南京建成生物工程研究所。实施例1、混合酶种类及添加量对提取葡萄籽油的影响(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并加入混合酶酶解，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h，混合酶的添加方案如表1所示；(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，将ph调至4.5，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为0.1％，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h。(4)碱液提取：氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20～40(g)：1(l)配置，在浆液加入配置的氢氧化钠溶液，将ph调至8，碱提反应温度为50℃，碱提反应时间为30min。(5)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。表1混合酶种类及添加量对葡萄籽油提取率和总酚含量的影响由表1可见，采用复合酶可以提高葡萄籽油多酚含量，采用单一酶制剂提取的葡萄籽油出油率和多酚含量均不高。复合酶中含有纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和木聚糖酶，随着复合酶含量的增加，浆液的粘度变大，乳化层增多，葡萄籽油提取率和总酚含量呈降低趋势。复合酶添加量在1％效果最佳，总酚含量高达37.46mg/kg。实施例2蛋白酶种类及添加量对提取葡萄籽油的影响(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h；(3)蛋白酶酶解：加入蛋白酶酶解，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h，蛋白酶添加量、ph如表2所示。(4)碱液提取：氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20-40(g)：1(l)配置，在浆液加入配置的氢氧化钠溶液，将ph调至8，碱提反应温度为50℃，碱提反应时间为30min。(5)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。表2蛋白酶种类及含量对葡萄籽油提取率和总酚含量的影响由表2可见，相同添加量条件下，酸性蛋白酶与中性蛋白酶、碱性蛋白酶比较，可以提高葡萄籽油中的多酚含量。酸性蛋白酶添加量在1％时效果最佳，总酚含量达37.46mg/kg。实施例3酸性蛋白酶酶解温度、时间和ph对提取葡萄籽油的影响(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h。(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为1％，酸性蛋白酶的酶解温度、酶解时间、ph对酶解率以及总酚含量的影响有如表3所示。(4)碱液提取：氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20-40(g)：1(l)配置，在浆液加入配置的氢氧化钠溶液，将ph调至8，碱提反应温度为50℃，碱提反应时间为30min。(5)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。表3酸性蛋白酶酶解温度、时间和ph对葡萄籽油提取率和总酚含量的影响酶解温度(℃)酶解时间(h)ph出油率(％)提取率(％)总酚含量(mg/kg)4024.59.2353.5134.275024.510.2959.6537.466024.510.3459.9435.135014.56.7839.3032.115034.511.2665.2840.1250229.4554.7842.34502610.6761.8630.12由表3可见，酸性蛋白酶酶解温度50℃、酶解时间2h、ph＝2时的葡萄籽油总酚含量最高，可达42.34mg/kg。实施例4碱液提取温度和时间对提取葡萄籽油的影响一种辅助降血糖葡萄籽油的制备方法，主要步骤如下(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h；(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，将ph调至4.5，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为1％，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h，。(4)碱液提取：氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20-40(g)：1(l)配置，在浆液加入配置的氢氧化钠溶液，将ph调至8，碱反应温度时间如表4所示。(5)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。表4碱提取温度和时间对葡萄籽油提取率和总酚含量的影响由表4可见，碱提温度50℃、碱提时间30min时的葡萄籽油总酚含量最高，为37.46mg/kg。碱提过程中，温度过高或提取时间较长，都会降低葡萄籽油中的总酚含量。实施例5不采用碱提取对提取葡萄籽油的影响(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h；(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，将ph调至4.5，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为1％，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h。。(4)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。此时，葡萄籽油出油率为3.61％，提取率为20.93％，总酚含量40.14mg/kg。实施例6采用其他破乳方法对提取葡萄籽油的影响(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h；(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，将ph调至4.5，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为1％，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h。(4)灭酶：将浆液升温至85℃灭酶15min。(5)萃取：加入100ml正己烷，在超声清洗器中超声30min。(6)提取油脂：将混合液3500r/min，离心15min，取上层有机相，40℃旋转蒸发，得到浅黄色葡萄籽油。此时，葡萄籽油出油率为6.01％，提取率为34.84％，总酚含量为32.14mg/kg。实施例7料液比对提取葡萄籽油的影响(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h；(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，将ph调至4.5，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为1％，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h。(4)碱液提取：氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20-40(g)：1(l)配置，在浆液加入配置的氢氧化钠溶液，将ph调至8，碱提反应温度为50℃，碱提反应时间为30min。(5)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。表5料液比对葡萄籽油提取率和总酚含量的影响蒸馏水(ml)：葡萄籽粉混(g)出油率(％)提取率(％)总酚含量(mg/kg)3:19.6756.0635.684:19.9057.3936.525:110.2959.6537.466:110.1258.6738.68表5可见，蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比6(ml):1(g)提取葡萄籽油时的总酚含量较高，可达38.68mg/kg。实施例8葡萄籽油有益成分和酸值的测定(1)葡萄籽预处理：将葡萄籽采用万能磨粉机粉碎，过50目筛，得到葡萄籽粉原料，其水分及挥发物含量为8.65％，含油率为17.25％，粗蛋白含量为9.2％，纤维含量为30.6％。(2)混合酶酶解：将蒸馏水与葡萄籽粉按体积质量比5(ml)：1(g)混匀制得浆液，加入盐酸将浆液ph调至5，并添加1％的混合酶(其中纤维素酶：果胶酶：半纤维素酶：木聚糖酶的配比为0.6:0.1:0.2:0.1)，酶解反应温度50℃，酶解反应时间为2h；(3)酸性蛋白酶酶解：在浆液中加入盐酸，将ph调至4.5，并加入酸性蛋白酶酶解，添加量为1％，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为2h。(4)碱液提取：氢氧化钠与蒸馏水按质量体积比20-40(g)：1(l)配置，在浆液加入配置的氢氧化钠溶液，将ph调至8，碱提反应温度为50℃，碱提反应时间为30min。(5)提取油脂：将浆液升温至85℃灭酶15min，将混合液3500r/min，离心15min，取上层游离油，得到浅黄色葡萄籽油。葡萄籽油中有益物质的含量：不饱和脂肪酸(86.63％)、总酚(37.46mg/kg)、总生育酚(253.6mg/kg)、总甾醇(2.588mg/g)。所得葡萄籽油酸值为0.168(koh)/(mg/g)。对照例9其他方法的多酚比较葡萄籽粉碎，过40目，料液比1:9，调节ph为6.5，再加入1％复合酶(纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶质量比2:1:2:1)，45℃酶解9h，灭酶5min后冷却至室温，以3900r/min的转速离心，吸取上层清油，用冻融法反乳化乳状液，即将酶解液反复冷冻、解冻、离心，直至上层没有油层为止，称取油脂质量(李丹丹，2017)。实验所得葡萄籽油总酚含量为12.79mg/kg，酸值为0.52(koh)/(mg/g)。与对照例9相比，实施例8中葡萄籽油样总酚含量更高，酸值更低。对照例9的酶解时间过长，不利于毛油中活性成分，促进油脂氧化。对照例10其他方法的多酚比较葡萄籽粉碎，过40目，以1:3比例加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，ph5.5，50℃水浴5min，加入酶用量1％(v/w)纤维素酶搅拌，酶解1.5h后加入石油醚，继续作用30min，8000r/min离心30min，油相旋转蒸发，所得粗油称重(高璐，2009)。实验所得葡萄籽油总酚含量为20.14mg/kg，酸值为0.43(koh)/(mg/g)。与对照例10相比，实施例8中葡萄籽油样总酚含量更高，酸值更低。对照例11其他方法的多酚比较葡萄籽粉碎过40目，料液比1:6，加入ph值为4.18的柠檬酸缓冲溶液，常压蒸汽预处理20min，冷却后按1.0％(v/w)的添加量加入纤维素酶，45℃恒温水浴酶解1h，升温至55℃，继续酶解8h后升温至85℃，保持10min灭酶，冷却至室温，在4500r/min下离心10min，无水乙醚萃取油脂，干燥，去除油中残存的溶剂，得到葡萄籽油(吕姗姗，2010)。实验所得葡萄籽油总酚含量为10.28mg/kg，酸值为1.24(koh)/(mg/g)。与对照例11相比，实施例8中葡萄籽油样总酚含量更高，酸值更低。对照例11的酶解时间过长，不利于毛油中活性成分，促进油脂氧化。对照例12其他方法的多酚比较将葡萄籽恒温干燥后，粉碎过80目筛，加入蒸馏水(1:6.6)，置于超声波反应器中，超声波功率225w，超声15min，温度50℃。之后调节ph5.0，先加入纤维素酶2.0％，酶解2.0h，再调ph7.0，加1.0％中性蛋白酶酶解1.5h。酶解结束后，在沸水浴中灭酶10min，在4000r/min下离心20min，收集上层游离油和乳液。将乳状液放入烧杯中置于微波反应器，微波功率500w，微波时间7min。将微波作用后的乳状液在在4000r/min下离心15min，分离游离油，将两次所得游离油合并后称量(胡滨，2015)。实验所得葡萄籽油总酚含量为18.56mg/kg，酸值为2.16(koh)/(mg/g)。与对照例12相比，实施例8中葡萄籽油样总酚含量更高，酸值更低。实施例13传统压榨法和本发明所述方法提取对葡萄籽油色度的影响分别测定传统压榨法和实施例8提取葡萄籽油色度。表6传统压榨法和实施例8提取葡萄籽油的色度提取方式l*a*b*δe*传统压榨法83.05±2.96-4.10±0.6547.31±1.6647.82±2.02实施例884.99±1.00-4.07±0.0938.70±0.9739.02±1.13由表6可见，实施例8所得葡萄籽油的总色差δe*为39.02±1.13，该色值小于传统压榨法提取葡萄籽油的δe*值47.82，实施例8所得葡萄籽油的色差小，颜色更均一。两种葡萄籽油的亮度值l*：传统压榨法(83.05)<实施例8法(84.99)，说明实施例8法所得葡萄籽油亮度值l*更接近于白，色泽透亮，传统压榨法所得的葡萄籽油更加浑浊。两种葡萄籽油的a*均为负值、b*均为正值，说明葡萄籽油的色泽偏向于绿和黄。同时，实施例8法所得葡萄籽油的红绿值a*和黄蓝值b*比传统压榨法更偏向于中性。实施例14辅助降血糖葡萄籽油具有降血糖功能的药效实验(1)大鼠的饲养大鼠饲养于江南大学实验动物中心spf级屏障动物实验室。动物日常护理及实验条件均符合《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》。购入健康雄性c57bl/6j小鼠(20±2g)，普通饲料(ain93g)适应性饲养5天，禁食16小时，取小鼠尾血，根据小鼠空腹血糖水平将小鼠随机分成正常组(nd)、玉米油组(co)、猪油模型对照组(lard)和实施例8法所得葡萄籽油组(gso)，每组12只。3.2分组饲料配方给药分组饲料配方给药：正常对照组饲料配方根据researchdiet公司参照美国营养学会推荐的ain-93g实验动物饲料配方配制而成，模型对照组饲料配方参照d12492配制而成，每组的喂食时间为早上8:30-9:00，自由饮食，连续给予不同配方的饲料3个月。表7不同实验组的饲料配方(2)样本收集及指标测定空腹血糖和糖耐量(血样)：饲料喂养3个月后，小鼠禁食不禁水16h，测定极限空腹血糖作为0min时空腹血糖，腹腔注射1g/kg体重的葡萄糖溶液，用血糖仪测定小鼠在腹腔注射葡萄糖溶液后30min、60min、90min、120min时的尾静脉血糖，用于测定糖耐量。胰岛素、胆固醇、甘油三酯、hba1c水平(血样)：试验结束后，各组动物禁食12小时，采用1％的戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，麻醉后眼球采血，静置1h左右，3000g离心10min后取血清于-80℃冰箱保存待用。炎症因子il-6、tnf-α、crp(组织):小鼠处死后解剖，取肝脏、肾脏、脾脏、胰脏，小肠。将各内脏器官存放在-80℃备用。采用试剂盒分别测定各组生化指标，结果以mean±sd表示，采用spss统计软件(23.0)分析，对结果进行anova分析。实验结束后，各组小鼠生化指标水平变化如表8-10所示。表8不同组别小鼠糖耐量比较注：表中同一列不同的字母表示具有显著性差异。表8实验结果表明与lard模型组组相比，gso组的血糖趋势明显更加稳定，说明gso组对葡萄糖注射有更好的耐受能力，在60min和90min处的血糖明显低于lard组(p<0.05)。相较于60％高脂饲料组小鼠，nd组小鼠的胰岛素敏感性最好。折线下区域面积(auc)越低，本组小鼠的胰岛素敏感性越好。nd组小鼠曲线下面积(auc)最低，60％高脂饲料组小鼠auc和正常组小鼠相比，均有显著性增加(p<0.01)，和lard组相比，gso组小鼠折线下区域面积显著降低(p<0.01)，说明本发明制取的葡萄籽油可以有效地改善小鼠糖耐量。表9不同组别小鼠胆固醇、甘油三酯、胰岛素、hba1c比较表9结果显示，猪油模型(lard)组小鼠胆固醇、甘油三酯、胰岛素、hba1c与空白组比较均具有非常显著性差异(p<0.01)，提示造模成功。葡萄籽油(gso)组小鼠的胆固醇、甘油三酯、胰岛素、hba1c与猪油(lard)模型组相比，各指标均有明显的改善作用。同时，葡萄籽油(gso)组小鼠的胰岛素和hba1c含量和玉米油(co)组比较，也有显著性的降低(p<0.05)，提示本发明制取的葡萄籽油可以显著地降低小鼠胆固醇、甘油三酯、胰岛素和hba1c的含量，且效果比玉米油好。表10不同组别小鼠肝脏il-6、tnf-α、crp比较注：表中同一列不同的字母表示显著性差异。表10结果显示，猪油模型(lard)组小鼠白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、c反应蛋白(crp)与空白组比较均具有非常显著性差异(p<0.01)，提示造模成功。本发明制取的葡萄籽油(gso)组白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、c反应蛋白含量均有降低，与猪油模型组相比有显著性差异(p<0.01)。本发明制取的葡萄籽油组中的c反应蛋白含量和玉米油组相比有显著性的降低(p<0.05)。结论：结果表明本发明制得葡萄籽油具有明显的辅助降血糖效果。以上所述仅为本发明的优选实施方式，凡是本发明专利构思所述的方案、特征、原理及其所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属
技术领域：
的技术人员可以对所描述的具体实施例做一些修改或补充，或者采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。当前第1页12