本发明属于基因工程领域，具体涉及土生隐球酵母编码c2h2型转录因子基因asr1的重组表达载体和表达该基因的酿酒酵母工程菌株，以及酿酒酵母工程菌株在吸附环境中活性铝的应用。
背景技术：
酸性土壤在世界上广泛存在，其中可耕种面积为1.79亿hm2；我国酸性土壤的分布遍及14个省区，约占全国耕地面积的21%（熊毅和李庆逵，1987）。氮肥的过量施用是导致农田土壤酸化的最主要原因。此外，工业化发展导致的酸雨、人类不良的耕作方式和阳离子在土壤中的淋失，使酸性土壤的面积不断扩大，酸化程度不断加剧。
铝（aluminum，al）在地壳中分布广泛，约占地壳总质量的7%。在土壤中，铝的主要存在形态是不溶于水的氧化物或铝硅酸盐，这些形态是对植物和环境没有伤害的；但是随着土壤酸化程度的增加，土壤中的铝从不溶于水的形态中溶解出来，转化为可溶于水的无机离子态，如al3+、(aloh)2+、(aloh)2+，这些形态对植物根系的毒害作用最大，又称为活性al。因此，在酸性土壤上铝毒害是影响农作物产量的主要限制因素之一；通常，解决铝毒害的方法是大量施用石灰来提高土壤的ph值，使游离铝沉淀；但是这种方法难以彻底解决土壤酸度和铝毒害问题，同时还存在着潜在的环境问题。
土壤微生物是土壤生态体系的重要组成部分，在植物和土壤的相互作用过程中扮演着重要的角色。土壤微生物参与土壤养分转化、物质代谢、有机物分解、矿化以及污染物降解等多种生化反应。特别是，土壤微生物在土壤中污染物或者是重金属清除中发挥了重要作用，也即微生物修复技术。微生物修复技术是利用微生物（土著菌、外来菌、基因工程菌）对污染物的代谢作用而转化、降解污染物。微生物修复技术已成功应用于煤气厂址pahs污染修复，石油烃污染土壤修复，农药污染土壤修复等。此外，重金属污染土壤的微生物修复主要是利用土壤中天然的微生物资源，削减、净化土壤中重金属或降低重金属毒性，从而使污染物的浓度降低到可以接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将其稳定化以减少其向周边环境扩散。在重金属污染土壤的生态修复中微生物主要通过以下几种方式起作用：（1）通过微生物的吸附、代谢达到对重金属消减、净化作用和固定作用；（2）通过微生物改变重金属的化学形态，使重金属固定或生物可利用性降低，减少重金属的危害；（3）土壤微生物通过氧化还原作用改变根际重金属形态或产生的有机酸可增加金属的溶解性，提高重金属的有效性，以利于植物吸收；（4）通过促进植物生长，提高植物抗病性、抗逆能力等方式间接影响修复效率。因为微生物种类多，代谢类型丰富，生长在酸性环境中的微生物在长期的进化过程中，为了保护细胞免受铝的毒害，产生了一系列的抗铝毒机制：如有机酸及其代谢产物对铝的螯合作用；抗氧化胁迫作用；抗细胞程序性死亡等。因此，筛选或者改良土壤微生物使其增加对铝的耐受性或者提高其对土壤中铝的清除能力，是解决酸性土壤上铝毒害的直接而有效的措施。
锌指基因广泛存在于生物体内，参与细胞分化、胚胎发育等相关基因的表达。根据半胱氨酸及组氨酸的数目不同，锌指蛋白分为很多亚型，其中最为广泛的是c2h2型锌指结构，它作为生物体内重要的转录因子可调控众多生理反应。对粗糙脉孢菌c2h2家族锌指转录因子基因敲除的57株突变株在以2％结晶纤维素为唯一碳源的培养条件下进行产纤维素酶水平分析，发现突变株在蛋白水平及内切β-1,4-葡聚糖酶酶活水平均比野生型有25％-77％不等的显著提高。运用blastp比对并结合pfam和smart对烟草基因组数据库分析，鉴定了118条c2h2锌指蛋白家族成员，所有c2h2分为5个亚家族，同一亚家族成员之间在结构域和理化性质上呈现较高一致性，每个成员都含有c2h2结构域，在数量上存在较大差异。组织表达分析表明，每个c2h2亚家族都有成员在不同组织中表达，在叶及根中有些基因的表达量较高。c2h2型锌指蛋白参与基因表达调控的方式是识别并结合特异dna片段，但具体是怎样识别和结合靶基因的还不完全清楚。对锌指蛋白-dna复合物进行晶体结构分析，及应用定点突变技术来研究结构中具体是哪些氨基酸在识别并结合dna中起重要作用，获得锌指蛋白中氨基酸与dna中碱基相对应的识别码，从而为研究其调控基因表达方式奠定了基础。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种含有c2h2型转录因子基因asr1的重组表达载体，其中c2h2型转录因子基因asr1核苷酸序列如seqidno：1所示。
本发明另一目的是提供一种含有上述重组表达载体的酿酒酵母工程菌株。
本发明另一目的是将上述酿酒酵母工程菌株应用在吸附环境中活性铝中。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
1、本发明提取从云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤中分离的土生隐球酵母bsll1-1菌株基因组dna，送上海人类基因组研究中心进行基因组测序，得到c2h2型转录因子基因asr1基因组序列。根据该序列设计特异引物，用土生隐球酵母的cdna为模板，用设计好的引物扩增asr1基因片段；将扩增片段连接到pmd-18t载体得到质粒pmd18-t-asr1，将质粒转化大肠杆菌dh5a，然后涂布含氨苄青霉素的平板，挑取阳性菌落测序。
2、从测序正确的pmd18-t-asr1质粒上用bamhi、hindⅲ限制性内切酶分别酶切并回收目的片段，连接到经相同限制性内切酶酶切的酵母表达载体pyes3/ct质粒上，得到重组质粒pyes3/ct-asr1，将重组质粒用电击法转化酿酒酵母（invsc1）感受态细胞，用real-timepcr法在转基因酵母中检测到了目的基因在转录水平的表达，从而成功得到含pyes3/ct-asr1表达载体的重组酵母工程菌株invsc1-pyes3/ct-asr1。
3、本发明比较了酵母菌株与转基因酵母菌株在铝离子胁迫下的生长，配制铝浓度为5mm的ypd诱导固体培养基，将酵母菌株invsc1和转基因酵母工程菌株invsc1-pyes3/ct-asr1活化使初始od600为1，将菌液稀释101、102、103、104倍，每个浓度梯度分别取5µl点种到含有不同铝浓度的固体平板上，在28℃培养箱中倒置培养，观察菌落大小。以不加铝离子的ypd固体平板作为对照，每种设置三个平板作为重复；结果发现在含有铝离子的平板上，转基因酵母菌株比对照酵母长势好，这说明asr1基因增强了酿酒酵母菌株抗铝离子胁迫的能力。
4、通过检测培养基中剩余活性铝的含量，进而检测pyes3/ct-asr1转基因酵母吸收或吸附铝的能力。分别用含有0.2mm和2mm铝的培养基作为对照，其培养基中剩余铝含量定义为100%。在含有铝时，与转空载体pyes3/ct酵母相比，pyes3/ct-asr1转基因酵母的培养基中剩余的活性铝明显减少。这些结果表明，在转基因酵母中，asr1基因可能通过增加菌体对铝的吸附或者吸收来达到耐铝的目的。
本发明的优点和技术效果如下：
本发明的c2h2型转录因子基因可以增加酵母的耐铝能力，c2h2型转录因子基因工程菌株可以通过吸附作用降低环境中活性铝的含量，这种利用微生物修复环境中活性铝的技术费用低，操作简便，对环境影响小，不会造成二次污染。
附图说明
图1为本发明酵母表达载体的构建及酶切检测图，a图为pcr扩增asr1基因全长电泳检测图；b图为pyes3∕ct胶回收纯化检测图；c图为双酶切检测pyes3∕ct-asr1重组质粒电泳图；
图2为本发明转基因酵母基因表达水平检测图；
图3为本发明转基因酵母耐铝能力检测图；
图4为本发明转基因酵母吸附（或吸收）铝能力的检测图；其中：图a为0.2mm铝时转基因酵母和对照酵母培养基中剩余铝含量；图b为2mm铝时转基因酵母和对照酵母培养基中剩余铝含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1:土生隐球酵母（c.humicolus）bsll1-1菌株总rna提取及cdna的合成
使用trizol试剂盒(takara公司)进行酵母总rna的提取，步骤如下：取土生隐球酵母菌体约0.2g，加入研钵中用液氮研磨至粉末状，然后加入1ml的trizol提取液继续研磨至清澈。将研磨液移到ep管，室温静置约5min，加入0.2ml氯仿剧烈振荡1min，然后将样品置于冰上5min，12000rpm4℃离心15min。将上清转移至新的ep管中，再用氯仿进行一次抽提。取上清并加入等体积异丙醇，-20℃静止0.5h后，12000rpm，4℃离心30min。弃上清，用75％的乙醇1ml清洗两次，12000rpm，4℃离心5min，倒掉乙醇。自然晾干后用20-40µldepc处理后的水进行溶解，-80℃保存。
用reversetranscriptasem-mlv反转录试剂盒对提取的总rna进行反转录。
1、在管中配制下列模板rna/引物混合液
2、70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上；
3、离心数秒钟使模板/引物的变性溶液聚集于管底部；
4、在上述管中配制下列转录反应液
5、42℃保温1h；
6、70℃保温15min后冰上冷却，得到的cdna溶液可直接用于pcr扩增。
实施例2：asr1转录因子asr1基因的克隆及测序
以土生隐球酵母cdna为模板进行asr1基因的pcr扩增，扩增的引物为正向：aagcttatgccgcctggaccgtcacccaaagat(下划线为hindⅲ酶切位点)，反向：ggatccctagaatgggcatggcccacattcgtt（下划线为bamhⅰ酶切位点）。反应条件：首先94℃预变性3min，然后94℃、30s，62℃、30s，72℃、2min进行30个循环，循环结束后72℃延伸10min；得到的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1a），用dna胶回收试剂盒纯化目的条带；将目的片段连接到pmd18-t载体上，得到含有目的片段的重组载体pmd18-t-asr1；用热刺激法将其转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α中，然后涂于含有氨苄青霉素的lb固体平板上，37℃倒置培养约12h；挑取单菌落于液体lb培养基中培养约12h后提取质粒，将质粒进行ecorⅰ、salⅰ双酶切检测，酶切检测正确重组载体送到上海生工生物有限公司测序，asr1核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。
实施例3：asr1转基因酵母的构建及检测
将测序正确的pmd18-t-asr1质粒用bamhi和hindiii酶切，回收asr1片段，用bamhi和hindiii酶切pyes3/ct质粒，回收得到带有bamhi和hindiii酶切位点的线性pyes3/ct片段（图1b），然后将二者进行连接反应，得到pyes3/ct-asr1质粒；用bamhi和hindiii对pyes3/ct-asr1质粒酶切，酶切产物电泳检测到了目的条带（图1c），说明外源基因成功插入到酵母表达载体上。
将检测正确的pyes3/ct-asr1质粒电击转化酿酒酵母invsc1感受态细胞，在sd-trp平板上长2-3天，挑取单菌落，30℃培养过夜，收集菌体，提取rna，检测目的基因表达水平。以18srrna基因作为内参，通过real-timepcr对菌株invsc1、转空载和转基因酵母的asr1基因进行定量分析。引物序列如下：
与invsc1相比较，转空载酵母和转基因酵母asr1基因的表达量分别是invsc1的0.92和4.92倍，这表明asr1基因在转基因酵母中表达量较高（图2）。
实施例4：转基因酵母耐铝能力检测
配制铝浓度为5mm的ypd诱导固体培养基（碳源为半乳糖），将活化的菌体按初始od600为1，稀释倍数分别为101、102、103、104，将稀释的菌液5μl点种到平板上，48h后观察生长情况，从图3中看出，转基因酵母invsc1-pyes3/ct-asr1耐铝能力都明显高于对照酵母invsc1-pyes3/ct。特别是在稀释倍数为103和104时，pyes3/ct-asr1转基因酵母生长较好，对照酵母和转空载体酵母基本不生长，这说明asr1基因能够增强酿酒酵母耐铝胁迫的能力。
实施例5：转基因酵母吸附（或吸收）铝的检测
通过检测培养基中剩余活性铝的含量，进而可以检测pyes3/ct-asr1转基因酵母吸收或吸附铝的能力。分别用含有0.2mm和2mm铝的培养基作为对照，其培养基中剩余铝含量定义为100%。在含有0.2mm铝时，pyes3/ct-asr1转基因酵母培养基中活性铝剩余量为40%，与转空载体pyes3/ct酵母相比，pyes3/ct-asr1转基因酵母的培养基中剩余的活性铝明显减少。在含有2mm铝时，pyes3/ct-asr1转基因酵母培养基中活性铝剩余量为73%，与转空载体pyes3/ct酵母相比，pyes3/ct-asr1转基因酵母的培养基中剩余的活性铝也明显减少（图4）。这些结果表明，在转基因酵母中，asr1基因可能通过增加菌体对铝的吸附或者吸收来达到耐铝的目的。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>c2h2型转录因子基因asr1的重组表达载体及应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1872
<212>dna
<213>土生隐球酵母bsll1-1(c.humicolusbsll1-1)
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<212>dna
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<400>7
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