本发明涉及狂犬病疫苗，尤其是一种糖蛋白密码子优化的新型狂犬病重组疫苗株。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒(rabiesvirus，rabv)引起的一种人畜共患传染病，一旦发病死亡率接近100％，严重威胁着人畜安全。近些年，我国平均每年约有700人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前三位，95％的人类狂犬病死亡是因为带病毒的犬咬伤造成。而在暴露前和暴露后及时接种疫苗可以有很好的保护作用，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等灭活疫苗，这些疫苗虽然具有安全、有效等优点，但灭活疫苗免疫原性较低，生产工程中往往需要进行病毒浓缩，提高了疫苗生产成本，阻碍了其在发展中国家的使用。另外，对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种很难实现，而流浪狗、猫等动物为我国目前主要的传染源，对流浪动物的有效免疫是我国狂犬病防控的关键。因此，发展低毒、高免疫原性的狂犬病疫苗是当前主要目标之一。
反向遗传操作技术的成熟使我们可以更有针对性地对狂犬病毒基因组进行改造以改变病毒的生物学特性，达到增强其安全性及免疫原性的目的。在许多欧美国家，重组狂犬病病毒疫苗已开始应用于狂犬病防控。目前应用的重组狂犬病病毒疫苗包括sadb19株、rc-hl株(itoh,minamoton,watanabet,gotoh,ronglt,sugiyamam,kinjot,mannenk,mifunek,konobet,etal.auniquemutationofglycoproteingeneoftheattenuatedrc-hlstrainofrabiesvirus,aseedvirususedforproductionofanimalvaccineinjapan.microbiolimmunol.1994,38:479–482.)、hep-flury株(inoueki,shojiy,kuranei,iijimat,sakait,morimotok.animprovedmethodforrecoveringrabiesvirusfromclonedcdna.jvirolmethods.2003feb；107(2):229-36.)等。其中sadb19株是1994年schnell等第一次运用反向遗传技术成功改造并拯救出的狂犬病毒株(schnellmj1,mebatsiont,conzelmannkk.infectiousrabiesvirusesfromclonedcdna.emboj1994,13(18):4195-203.)。
随后以这些病毒为母本，通过反向遗传学系统构建表达双份狂犬病毒糖蛋白的重组病毒，如lbnse-gl-g株(muhammadtariqnavid,yingyingli,lingzhao,etal.comparisonoftheimmunogenicityoftwoinactivatedrecombinantrabiesvirusesoverexpressingtheglycoprotein.archvirol(2016)
161:2863–2870.)、rc-hl株(hosokawa-muto,j，ito,n，minamoto,n,etal.characterizationofrecombinantrabiesviruscarryingdoubleglycoproteingenes.microbiolimmunol.2006；50(3):187-196)、hep-dg株(xiaohuiliu,youtianyang,xiaofengguo,etal.arecombinantrabiesvirusencodingtwocopiesoftheglycoproteingeneconfersprotectionindogsagainstavirulentchallenge.plosone.2014；9(2):e87105.)。这些重组病毒表明：狂犬糖蛋白表达量的提高有助于降低狂犬病毒致病性并提高狂犬病毒灭活疫苗免疫原性。但狂犬病毒基因组所能容纳的外源基因大小及数量有限，而依据密码子偏爱性进行基因序列优化的方式可以提高基因mrna翻译水平以进一步提高蛋白表达量。
2011年，schnell采用密码子优化的方式在不改变狂犬n2c病毒糖蛋白序列的同时增加了糖蛋白的表达量，得以进一步探究狂犬病毒糖蛋白表达量与病毒致病性的关系(wirblich,schnellmj.rabiesvirus(rv)glycoproteinexpressionlevelsarenotcriticalforpathogenicityof.journalofvirology.2011；85(2):697-704.)。另外，密码子优化在提高疫苗免疫原性方面也已有报导，如在流感疫苗的研发中优化流感凝集素基因可以提其表达量并增高疫苗免疫原性(fedorovaef,kiselevaiv,rudenkolg，etat.codonoptimizationofhemagglutininasapromisingtoolforimprovingoftheinfluenzavaccinesimmunogenicity.molgenmikrobiolvirusol.2014；(4):3-9.)。由此可见，将密码子优化与反向遗传操作系统结合对狂犬病毒改造在降低狂犬病毒致病性及提高免疫原性方面有潜在的应用价值，但是截至目前，尚无将此技术用于提高狂犬病疫苗免疫原性的报导。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于糖蛋白密码子优化的新型狂犬病重组疫苗，以提高狂犬病灭活疫苗的免疫原性。
本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
以之前报道的狂犬病疫苗株lbnse-gl-g为母本病毒(muhammadtariqnavid,yingyingli,lingzhao,etal.comparisonoftheimmunogenicityoftwoinactivatedrecombinantrabiesvirusesoverexpressingtheglycoprotein.archvirol(2016)161:2863–2870.)，将lbnse株糖蛋白依据鼠源密码子偏爱性进行优化得到og，分别替换lbnse-gl-g中的两个g基因，通过反向遗传操作技术拯救重组病毒lbnse-ogl-og。该病毒株具有较高的病毒滴度，且致病性低，灭活后免疫能提高机体免疫后的中和抗体水平，提高机体保护率。
所用的lbnse毒株来源于用于欧洲野生动物免疫用的疫苗株sad-b19，但在sad-b19病毒g蛋白上将194位的天冬氨酸(aat)突变为丝氨酸(tcc)，将333位的精氨酸(aga)突变为谷氨酸(gaa)，相当于另一株疫苗株sag2(在欧洲广泛用于野生动物口服免疫的疫苗株)，大大减弱了病毒的致病性(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.rasalingamp,rossiterjp,mebatsiont,jacksonac.comparativepathogenesisofthesad-l16strainofrabiesvirusandamutantmodifyingthedyneinlightchainbindingsiteoftherabiesvirusphosphoproteininyoungmice.virusres.2005,111:55-60.conzelmannkk,coxjh,schneiderlg,thielhj.molecularcloningandcompletenucleotidesequenceoftheattenuatedrabiesvirussadb19.virology.1990,175:485-499.)。
lbnse-gl-g毒株是在lbnse毒株的g基因与l基因之间额外插入一个g基因获得的重组病毒株。
本发明中依据鼠源密码子偏爱性对lbnse株g基因优化后得到的og基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示，大小为1575bp。以lbnse-gl-g株的感染性克隆为骨架，将原有的2个g基因均替换为og基因，得到lbnse-ogl-og株感染性克隆，其核苷酸序列如seqidno：2所示，全长为13151bp，其中og序列位于第3317-4891位点以及4955-6529位点之间。
感染性克隆lbnse-ogl-og与分别表达狂犬病毒n、p、g和l四个蛋白的辅助质粒共同转染bsr细胞后，经免疫荧光证明拯救了表达两份优化后糖蛋白基因的lbnse-ogl-og的重组狂犬病病毒，并经过测序验证了替换后的og序列的正确性。
为了验证lbnse-ogl-og毒株g蛋白的表达量是否提高，将拯救的病毒lbnse-ogl-og感染bsr细胞，然后提取细胞裂解液，用westernblot进行验证，证明lbnse-ogl-og株g蛋白表达量有显著的提高。
本发明中的重组病毒lbnse-ogl-og在bsr细胞及na细胞上的生长曲线与亲本病毒相似，表明糖蛋白基因的优化及额外插入并没有影响到病毒的生长和增殖。另外，重组病毒lbnse-ogl-og在bsr细胞上的滴度可以达到108.25ffu/ml，达到多种免疫途径滴度的要求。
将重组病毒lbnse-ogl-og经脑内途径接种小鼠，在观察的14天内，小鼠未表现出任何发病症状，并且体重未有显著变化，表明该重组病毒安全性高。
重组病毒lbnse-ogl-og经甲醛灭活后肌肉免疫可以显著提高机体免疫原性，三周后攻毒保护率明显高于亲本毒株lbnse及lbnse-gl-g。
总之，本发明中重组病毒lbnse-ogl-og具有良好的增殖特性和安全性，并且提高了狂犬病毒糖蛋白的表达量，灭活后肌肉免疫可以增强机体的免疫反应，诱导高水平的中和抗体，提高机体保护率。因此，重组病毒lbnse-ogl-og是一种优良的狂犬病疫苗的候选株。
附图说明
图1狂犬病毒疫苗株lbnse、lbnse-gl-g、lbnse-ogl-og示意图。
图2拯救出的重组狂犬病病毒lbnse-ogl-og的免疫荧光(100x)实验检测结果。
图3重组病毒lbnse-ogl-og在不同细胞上的生长曲线图。
图4重组病毒lbnse-ogl-og糖蛋白表达量westernblot检测结果。
图5重组病毒lbnse-ogl-og在小鼠体内致病性实验结果。
图6重组病毒免疫后的中和抗体水平柱状图及折线图。
图7重组病毒免疫后第二周及第三周的中和抗体水平。
图8重组病毒免疫后第二周及第三周的抗狂犬全蛋白igg水平。
图9icr小鼠免疫不同疫苗21天后以狂犬病毒强毒株cvs-24脑内攻毒后的存活率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1重组病毒lbnse-ogl-og的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒
lbnse毒株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，它是在sad-b19病毒株g蛋白上将194位的天冬氨酸(aat)突变为丝氨酸(tcc)，将333位的精氨酸(aga)突变为谷氨酸(gaa)，相当于另一株疫苗株sag2，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。lbnse-gl-g毒株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，它是在lbnse的g基因与l基因之间额外插入一个g基因获得的重组病毒株，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(muhammadtariqnavid,yingyingli,lingzhao,etal.comparisonoftheimmunogenicityoftwoinactivatedrecombinantrabiesvirusesoverexpressingtheglycoprotein.archvirol(2016)161:2863–2870.)
1.1.2质粒
用于拯救lbnse毒株的感染性克隆plbnse的构建策略及具体方法可参考有关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。
1.1.3细胞和单克隆抗体
bsr细胞(bhk-21细胞的一个克隆细胞系)，生长于含10％胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)(gibco,grandisland,ny)的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium,dmem)(mediatech,herndon,va)培养液。鼠神经瘤细胞(mouseneuroblastomacells,na)，生长于含10％fbs的rmpi1640培养液(mediatech)。异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体购自fujirebio(melvin,pa)公司。
1.1.4实验动物
6周龄的icr小鼠，购于湖北省华中农业大学实验动物中心。
1.1.5主要试剂
胶回收试剂盒、质粒小提和大提试剂盒、superfect转染试剂盒均购于qiagen公司，各种限制性内切酶购于newenglandbiolabs,beverly,ma公司，amvreversetranscriptasexl及primerstarhspcr购自takara公司。
1.2基因优化与合成
基于鼠源密码子优化后的糖蛋白基因序列由南京金斯瑞公司合成。
1.3重组病毒lbnse-ogl-og的拯救
参见文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。具体如下：将bsr细胞接种于六孔板，待细胞长至80％的覆盖度，按照转染试剂superfect(qiagen公司)的产品说明说进行操作，将2μg的全长感染性克隆，0.5μgn辅助质粒，0.25μgp辅助质粒，0.15μgg辅助质粒以及0.1ugl辅助质粒共同转染bsr细胞，转染后的细胞放入37℃培养箱，co2浓度为5％，孵育3小时，弃掉上清，用pbs洗两次，加入含2％fbs维持液在34℃含5％co2的培养箱培养4天后换新鲜维持液继续培养三天，收集上清，-80℃分装保存。
1.4拯救病毒的鉴定
1.4.1免疫荧光检测
将拯救的病毒与bsr细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的80％丙酮于-20℃固定20分钟，然后用pbs洗2遍，将异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体(购于fujirebio公司)进行1:70稀释，每孔加入50ul，放入37℃孵育1小时后用pbs洗三遍，在荧光显微镜(leicadmires)下进行观察。
1.4.2wb检测糖蛋白表达量
将拯救的病毒与bsr细胞共培养48小时后，将细胞裂解后进行westernblot检测。
1.5病毒滴定
取96孔细胞培养板，以4行×9列为一个样品区，每板两个分区，按10倍倍比稀释法稀释病毒原液，每个稀释度设4个重复，按照100μl/孔，将不同稀释度依次加入样品区，每孔加入5×104的bsr细胞后于37℃，5％co2感作48h，然后弃细胞上清液，用80％冷丙酮(80％ice-coldacetone)固定感染细胞。以抗狂犬病毒n蛋白荧光抗体(fitc-conjugatedanti-rvnantibodies)染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域(antigen-positivefoci)。根据reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为ffu/ml(fluorescentfocusunitspermilliliter)。
1.6重组病毒lbnse-ogl-og在bsr和na细胞上的生长特性
将病毒以感染复数(病毒/细胞)为0.01(moi＝0.01)分别感染bsr与na细胞，分别在感染后第1天，第2天，第3天，第4天及第5天收取上清液，进行病毒滴定，记录病毒在不同时间点的滴度，并绘制出生长曲线。
1.7动物实验
1.7.1重组病毒lbnse-ogl-og致病性实验
将6-8周龄的icr小鼠，每组10只，分别用30μl的dmem或者108ffu/ml的重组病毒lbnse-ogl-og及lbnse、lbnse-gl-g，以脑内注射(i.c.)的方式进行感染，每日观察，记录小鼠的临床发病及死亡情况。
1.7.2重组病毒lbnse-ogl-og中和抗体水平实验
将6-8周龄的icr小鼠，每组10只，分别用1ml无菌注射器将1×107ffu的重组病毒株lbnse-ogl-og和lbnse、lbnse-gl-g毒株和经甲醛灭活后进行肌肉途径免疫，并分别于免疫后二和三周进行采血测定中和抗体水平。
1.7.3重组病毒lbnse-ogl-og保护率实验
于免疫后21天以50ld50cvs-24脑内途径攻毒icr小鼠，并持续观察21天，监测lbnse-ogl-og的保护率。
2.实验结果
2.1感染性克隆lbnse-ogl-og的构建及拯救病毒检测
lbnse毒株是在sad-b19的基础上在g基因194位和333位进行突变，并且将g和l基因之间的假基因敲除，加入两个酶切位点bsiwi和nhei。重组病毒lbnse-gl-g毒株是在lbnse毒株g、l额外插入了一个g基因，重组病毒lbnse-ogl-og是在lbnse-gl-g病毒的基础上，将两个g基因均替换为依据鼠源密码子优化后的og基因，如图1所示。利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验进行检测，如图2所示，可以看到绿色的荧光灶，即为拯救出的重组狂犬病病毒lbnse-ogl-og，而细胞阴性对照则观察不到荧光灶。另外，经过rt-pcr检测重组病毒，测序后确认lbnse-ogl-og中糖蛋白基因均已替换为og基因。
2.2病毒的体外生长特性
为了研究糖蛋白基因的优化及额外插入是否影响狂犬病毒自身的复制及增殖，将lbnse毒株、lbnse-gl-g和lbnse-ogl-og毒株分别感染bsr和na细胞，并且于不同时间点测定其病毒的滴度，绘制出病毒的生长曲线。如图3，可以观察到重组病毒lbnse-ogl-og和病毒lbnse、lbnse-gl-g具有相似的生长曲线，这表明表达两份优化糖蛋白基因并未影响病毒的复制和增殖，并且最高滴度与母本病毒也相差不大。重组病毒lbnse-ogl-og在bsr细胞上最高滴度为1×108.25ffu/ml，满足各种免疫方式的滴度需求。
2.3重组病毒粒子表面g蛋白含量检测
重组病毒lbnse-ogl-og经过病毒纯化后，进行westernblotting检测如图4所示，病毒粒子g/n蛋白比例在lbnse-ogl-og(1.12)中明显高于在lbnse-gl-g(0.98)及lbnse(0.73)株中，说明重组病毒粒子表面镶嵌更多的g蛋白。
2.4重组病毒致病性情况检测
重组病毒lbnse-ogl-og脑内注射6-8周龄的icr小鼠中，观察3周，如图5所示，期间并未出现任何发病症状，体重未发生明显变化，说明重组病毒对小鼠无致病性，安全性高。
2.5重组病毒肌肉免疫效果评价
将重组病毒lbnse-ogl-og和lbnse毒株(欧洲用于野生动物免疫疫苗株)、lbnse-gl-g灭活后肌肉途径免疫icr小鼠，免疫后于每周采血测定中和抗体水平。诱导高的中和抗体水平是预防狂犬病的有效手段，因此，中和抗体的测定作为狂犬病疫苗效果评价的方法。如图6、7所示，重组病毒lbnse-ogl-og诱导的中和抗体水平要显著高于lbnse毒株及lbnse-gl-g，如图8所示，血清中总的免疫球蛋白g的含量在lbnse-ogl-og免疫的小鼠也更高。如图7所示，lbnse-ogl-og免疫后三周的平均中和抗体水升高至14.25iu/ml，显著高于lbnse毒株的4.73iu/ml及lbnse-gl-g的9.32iu/ml，并且具有良好的保护效果。
免疫三周后攻毒保护实验也显示，lbnse-ogl-og株免疫小鼠的保护率(90％)显著高于lbnse-gl-g(60％)及lbnse(40％)，如图9所示。
总之，本发明中的重组狂犬病病毒lbnse-ogl-og对小鼠无明显体重变化，无致病性，安全性高，在免疫效果上，与欧洲用于野生动物免疫的疫苗株lbnse及表达两份糖蛋白的lbnse-gl-g相比，lbnse-ogl-og可以诱导产生更高的中和抗体水平，第三周可达14.25iu/ml，并且在免疫后三周具有良好的保护率。因此，本发明重组病毒lbnse-ogl-og具备了作为疫苗株的安全低毒、长期有效的特点，可以作为狂犬病疫苗的候选株。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病新型重组疫苗
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1575
<212>dna
<213>狂犬病疫苗株lbnse-gl-g糖蛋白og基因()
<400>1
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