本发明涉及一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
马铃薯m病毒potatovirusm,pvm发现于美国、法国、英国、德国、荷兰等国家,目前,pvm在世界各地均有发生[1]。pvm是香石竹潜隐病毒属carlavirus成员。病毒粒体大小为650nmx12nm,有一个未完全封闭的病毒衣壳。致死温度为65-71℃,体外保毒期为5-7d,稀释限点为102-103。在寄主植物的任何部位都可检测到病毒,病毒主要存在于细胞质中。发现在感病植物细胞的细胞质中可出现呈无定形的x体状的内含体。该病毒基因组为单链正义rna,长8535bp,其3'端有个poly(a),5'端可能有一个甲基化的帽子结构,基因组rna含有6个orfs,编码6个蛋白。pvm的rna的orfi编码223kda的复制酶；orf2、orf3和orf4分别编码一个25kda、12kda和7kda蛋自,组成了一个三基因盒,参与病毒的胞间运动；orf5编码34kda外壳蛋白；重叠的orf6编码11-16kda富含半胱氨酸的蛋白,该产物的功能还不清楚,但从结合核酸的能力看,可能有助于蚜虫传播或者涉及寄主基因转录及病毒rna的复制[1]。
pvm的自然寄主主要是茄科植物，包括马铃薯、番茄及人参果等，在实验室中也可侵染觅色黎、昆诺黎、毛曼陀罗、千日红、菜豆、番茄、豇豆等。该病毒可通过机械传播、嫁接传播也可通过节肢动物如蚜虫的非持久性方式传播,但不能通过种子和花粉传播。侵染寄主后引起的典型症状为小叶皱缩扭曲斑驳和矮化。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的引物；
本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于鉴定马铃薯m病毒的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述马铃薯m病毒rt-lamp检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的引物，其特征在于包括：
pvm-f3:5’-tatgaggaccggttcgcc-3’
pvm-b3:5’-gaccattcataccgccagtc-3’
pvm-fip:5’-cggggttggtcgccttatcag-ttacgtggagaacactgctg-3’
pvm-bip:5’-aaggacgtggctttacgtggt-acctcggcattaagagagct-3’。
一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
如上所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
如上所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为bstdna聚合酶和amv逆转录酶混合液。
如上所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
一种马铃薯m病毒检测方法，其特征在于包括以下步骤：
a、植物组织总dna提取；
b、lamp检测：
采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的dna5μl，使总量达到25μl；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μl；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
c、lamp结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯m病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯m病毒。
如上所述的检测方法，其特征在于步骤a中植物组织总dna提取的具体步骤：
a制样：取0.5g的带毒组织加入1ml抽提缓冲液进行研磨；
b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到pcr管中，用ddh2o反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddh2o；
c结合：加入100μl的样品到pcr管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μlddh2o到pcr管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待pcr管内溶液澄清后，上清即为病毒rna；
g核酸浓度的测定
取5μldna溶液加ddh2o梯度稀释至1ml，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；rna的浓度按照以下公式计算获得：
rnac＝40×n×a
式中：
c——rna浓度(ng/μl)
a——260nm处的吸光值
n——核酸稀释倍数
1od260nm＝40μg/ml单链rna
当od260/od280比值在1.7～1.9之间时，适宜于pcr扩增和lamp检测。
如上所述的检测方法，其特征在于所述纳米磁珠通过以下方法制备：
1)fe3o4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰
分别取5.2gfecl3·6h2o、2.7gfeso4·7h2o、0.85ml12.1mol/l的浓盐酸溶解于200ml水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250ml、0.75mol/lnaoh溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/ml的fe3o4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mlfe3o4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150ml，超声振荡30min，滴加0.4mlaptes，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将aptes修饰的fe3o4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/ml的氨基化fe3o4纳米磁珠无水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制备
取0.5ml氨基化fe3o4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mlpbs清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(v/v)戊二醛溶液2ml，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用pbs洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5ml不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化fe3o4纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用pbs和超纯水分别洗涤3次，再用pbs定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。
本发明中所用到的材料：
1.1毒株
pvm购买于美国agdia公司。
1.2主要试剂和耗材
(1)pcr反应试剂：10×pcrbμffer、dntps、mgcl2、taqdna聚合酶以及反转录酶(reversetranscriptasem-mlv)均购自宝生物工程(大连)有限公司；
(2)dnamarkerdl1000、6×loadingbμffer，宝生物工程(大连)有限公司；
(3)rna扩增反应试剂盒loopamprnaamplificationkit,
(4)bstdnapolymeraselargefragment:购自newenglandbiolabs公司；
(5)甜菜碱(betaine)：购自广州威佳生物有限公司；dntps、mgcl2，宝生物工程(大连)有限公司；
(6)lamp引物(正向外引物f3、正向内引物fip、反向内引物bip、反向外引物b3)由宝生物工程(大连)有限公司合成；
(7)纳米磁珠(magneticnanoparticles，mnp)试剂盒购自北京金纳科技有限公司；
1.3主要仪器设备
(1)－80℃冷冻冰箱；
(2)labofμge400r高速冷冻台式离心机；
(3)微量移液器，1000μl、200μl、100μl、10μl，2.5μl，；
(4)分析天平，梅特勒－托利多仪器有限公司；
(5)高温高压灭菌锅；
(6)超纯水系统，milli－qacademic，millipore公司；
(7)日本shimadzμ公司μv-120-02型可见－紫外分光光度计；
(8)超净工作台；
(9)漩涡混合器；
(10)lamp实时浊度仪，la－320c，日本荣研生物公司。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
一、本发明针对侵染马铃薯的pvm的外壳蛋白基因设计了一组特异性的引物，成功建立了针对这种病毒的lamp检测方法；
二、本发明检测体系中的镁离子浓度、dntp浓度、甜菜碱添加量、反应温度、内外引物间比例合适，从而使得
三、本发明中引物特异性较好，灵敏度高；
四、本发明利用lamp法检测这两种病毒检测约耗时约2小时，比普通elisa和rt-pcr方法更加快速；
五、本发明lamp法不需要pcr仪等昂贵、操作复杂的仪器，水浴锅或恒温装置即可完成反应，反应结束后，通过观察是否产生了白色沉淀或加入sybr显色剂观察颜色变化就可判定反应是否发生，操作简便，适于检验检疫局一线检测实验室推广，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-tatgaggaccggttcgcc-3’
pvm-b3:5’-gaccattcataccgccagtc-3’
pvm-fip:5’-cggggttggtcgccttatcag-ttacgtggagaacactgctg-3’
pvm-bip:5’-aaggacgtggctttacgtggt-acctcggcattaagagagct-3’。
实施例2
一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-tatgaggaccggttcgcc-3’
pvm-b3:5’-gaccattcataccgccagtc-3’
pvm-fip:5’-cggggttggtcgccttatcag-ttacgtggagaacactgctg-3’
pvm-bip:5’-aaggacgtggctttacgtggt-acctcggcattaagagagct-3’。
本发明中所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
所述的酶溶液为bstdna聚合酶和amv逆转录酶混合液。
荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
实施例3
一种马铃薯m病毒检测方法，包括以下步骤：
a、植物组织总dna提取；
b、lamp检测：
采用实施例2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的dna5μl，使总量达到25μl；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μl；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
c、lamp结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯m病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯m病毒。
实施例4
一种马铃薯m病毒检测方法，包括以下步骤：
a、植物组织总dna提取；
步骤a中植物组织总dna提取的具体步骤：
a制样：取0.5g的带毒组织加入1ml抽提缓冲液进行研磨；
b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到pcr管中，用ddh2o反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddh2o；
c结合：加入100μl的样品到pcr管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μlddh2o到pcr管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待pcr管内溶液澄清后，上清即为病毒rna；
g核酸浓度的测定
取5μldna溶液加ddh2o梯度稀释至1ml，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；rna的浓度按照以下公式计算获得：
rnac＝40×n×a
式中：
c——rna浓度(ng/μl)
a——260nm处的吸光值
n——核酸稀释倍数
1od260nm＝40μg/ml单链rna
当od260/od280比值在1.7～1.9之间时，适宜于pcr扩增和lamp检测。
其中所述纳米磁珠通过以下方法制备：
1)fe3o4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰
分别取5.2gfecl3·6h2o、2.7gfeso4·7h2o、0.85ml12.1mol/l的浓盐酸溶解于200ml水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250ml、0.75mol/lnaoh溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/ml的fe3o4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mlfe3o4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150ml，超声振荡30min，滴加0.4mlaptes，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将aptes修饰的fe3o4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/ml的氨基化fe3o4纳米磁珠无水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制备
取0.5ml氨基化fe3o4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mlpbs清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(v/v)戊二醛溶液2ml，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用pbs洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5ml不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化fe3o4纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用pbs和超纯水分别洗涤3次，再用pbs定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。
b、lamp检测：
采用实施例2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的dna5μl，使总量达到25μl；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μl；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
c、lamp结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯m病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯m病毒。
实施例5
一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-tatgaggaccggttcgcc-3’
pvm-b3:5’-gaccattcataccgccagtc-3’
pvm-fip:5’-cggggttggtcgccttatcag-ttacgtggagaacactgctg-3’
pvm-bip:5’-aaggacgtggctttacgtggt-acctcggcattaagagagct-3’。
本发明中所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
所述的酶溶液为bstdna聚合酶和amv逆转录酶混合液。
荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
实施例6
一种马铃薯m病毒rt-lamp鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-tatgaggaccggttcgcc-3’
pvm-b3:5’-gaccattcataccgccagtc-3’
pvm-fip:5’-cggggttggtcgccttatcag-ttacgtggagaacactgctg-3’
pvm-bip:5’-aaggacgtggctttacgtggt-acctcggcattaagagagct-3’。
本发明中所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
所述的酶溶液为bstdna聚合酶和amv逆转录酶混合液。
荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
序列表
<110>陈,定虎
<120>检测马铃薯m病毒用的引物、试剂盒及方法
<130>检测马铃薯m病毒用的引物、试剂盒及方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>potatovirusm
<400>1
tatgaggaccggttcgcc18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>potatovirusm
<400>2
gaccattcataccgccagtc20
<210>3
<211>41
<212>dna
<213>potatovirusm
<400>3
cggggttggtcgccttatcagttacgtggagaacactgctg41
<210>4
<211>41
<212>dna
<213>potatovirusm
<400>4
aaggacgtggctttacgtggtacctcggcattaagagagct41