本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种小麦抗白粉病基因pm5e的高通量检测标记及其在育种中的应用。
背景技术：
小麦(triticumaestivuml.)是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，常年种植面积在2666.67万亩以上，约占粮食作物总面积的27％左右。因此，确保小麦产量和品质的稳步提高是关系到我国粮食安全和人们生活水平不断提高的一个重要因素。
小麦白粉病是一种世界性病害，分布于全球各地，尤其是湿度较大的地区发生更为严重。发病时一般减产5％-10％，重病田减产20％以上。近年来，小麦白粉病的发病范围在不断扩大，危害程度也不断加重，已成为当前小麦生产的严重威胁。选育和使用高效的抗病品种，是防治白粉病经济、安全、有效的措施。而白粉病抗病育种的基础是高效、多样化的抗源。深入研究抗病基因的抗性表现及遗传特点将有助于对这些抗病基因进行有效利用。不同的小麦品种抗性不同，所含的抗病基因也不同。截止目前，已经定位并给予正式命名的质量抗白粉病基因有86个，即pm1-pm60，其中pm1、pm2、pm3、pm4、pm5及pm24分别有5、2、17、4、6和2个等位基因，pm18＝pm1c，pm22＝pm1e，pm23＝pm4c，pm31＝pm21。这86个等位基因位于21条染色体的56个染色体位点上。其中，pm5基因位于7bl染色体上，含6个等位基因，分别为pm5a、pm5b、pm5c、pm5d、pm5e及pm5f。
pm5e是一个隐性抗白粉病基因，携带该基因的冬小麦品种复壮30，是从泾阳30经系统选育而成的，对我国当前流行的白粉病小种表现为高抗或免疫，具有重要的利用价值。前人利用ssr标记对该基因定位，初步将其定位到7bl染色体上，但是这两个ssr标记与目标基因的遗传距离分别为11cm和6.6cm(huang等2003)，王洪刚等(2008)在此基础上，开发了2个ssr标记，且遗传距离分别为5.1cm和4.9cm，这两个ssr标记虽然在一定程度上缩短了pm5e基因与标记之间的遗传距离，但是仍然存在遗传距离较远，多态性水平较低、检测效率低等问题；后来刘志勇等(2008)通过bsr-seq筛选出特异性snp位点，并转化成特异性的引物，进一步对pm5e基因定位，将pm5e基因定位在est标记cj729392与cj584170之间，该研究提高了引物特异性，但多态性水平仍较低，而且2个标记之间的遗传距离较大(23.5cm)。
竞争性等位基因多态性pcr(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)是目前国际上对单个snp进行基因分型分析的主流方法之一，原理是根据引物末端碱基的特异匹配对snp及indel进行分型，包含2条末端碱基为不同(即两种snp)的正向引物和1条反向引物，两条正向引物5’端分别携带有不同序列的荧光接头序列fam或hex，因此，根据荧光信号的不同就可检测snp的特异性。kasp标记可以对snp位点进行精准的双等位基因判断，可以同时对大量样本进行检测，同时还具有遗传稳定性好等优点，是一种高通量的分子标记。
因此，筛选出与小麦白粉病抗性相关的snp，并将其进一步开发为适宜于高通量、高效率检测的kasp标记，应用于抗小麦白粉病材料的选择，对提高小麦产量和品质等方面均有重要的意义。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种小麦抗白粉病基因pm5e的高通量检测标记及其在育种中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种与小麦白粉病抗性相关的snp标记，共包含2个snp标记，分别为标记ax-95000860和标记ax-94638908；所述标记ax-95000860和ax-94638908均位于小麦7bl染色体上，其中，标记ax-95000860的物理位置为721220493，snp位点处碱基为c或t；标记ax-94638908的物理位置为708115367，snp位点处碱基为c或t。
上述snp标记在小麦抗白粉病育种中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第二方面，提供一种基于kasp技术开发的用于检测与抗白粉病基因pm5e紧密连锁的snp的引物；所述与抗白粉病基因pm5e紧密连锁的snp分别为ax-95000860和ax-94638908；ax-95000860的物理位置为721220493，snp位点处碱基为c或t；分子标记ax-94638908的物理位置为708115367，snp位点处碱基为c或t；
其中，检测ax-95000860的引物序列分别如seqidno.1-3所示；检测ax-94638908的引物序列分别如seqidno.4-6所示。
本发明的第三方面，提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。
本发明还提供上述引物或检测试剂或试剂盒在小麦抗白粉病材料创制中的应用。
本发明还提供上述引物或检测试剂或试剂盒在分子标记辅助小麦抗白粉病选择育种中的应用。
本发明还提供上述引物或检测试剂或试剂盒在选育具有白粉病抗性的小麦资源中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测与抗白粉病基因pm5e紧密连锁的snp的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测小麦样品的dna；
(2)取浓度为20ng/μl的模板dna3μl，seqidno.1-3所示的混合引物或seqidno.4-6所示的混合引物0.0825μl，2×mastermix3μl，进行pcr扩增；
(3)采用荧光检测仪分析pcr扩增产物基因型。
优选的，步骤(2)中，pcr扩增的条件为：
1)94℃预变性5min；
2)94℃变性20s；
3)65℃退火30s，步骤2)-3)循环10次，每个循环退火温度降低0.8℃；
4)94℃变性20s；
5)57℃退火30s，步骤4)-5)循环38次；
6)4℃保存。
本发明的有益效果：
本发明提供了两个在育种中有重要利用价值的小麦抗白粉病基因pm5e的snp标记(标记ax-95000860和标记ax-94638908)，并基于这两个新发现的snp标记开发了kasp检测标记，可以快速、高效、高通量检测pm5e在小麦品种中的分布及在分离群体中的分布情况，有利于对pm5e精细定位和克隆，并可在育种群体中对pm5e进行标记辅助选择，利用pm5e提高小麦的白粉病抗性，减少对小麦产量的影响，提高小麦抗白粉病育种效
附图说明
图1：ax-95000860标记的kasp分型结果，靠近横轴圆点代表c(抗白粉病)基因型，纵轴圆点代表t(感白粉病)基因型，对角线的圆点代表杂合型；×代表未加入dna孔，■代表ddh2o空白对照。
图2：ax-94638908标记的kasp分型结果，靠近横轴圆点代表c(抗白粉病)基因型，纵轴圆点代表t(感白粉病)基因型，对角线附近的圆点代表杂合型；×代表未加入dna孔，■代表ddh2o空白对照。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术中所介绍的，筛选出与小麦白粉病抗性相关的snp，并将其开发为能准确其snp位点的kasp检测标记，对抗小麦白粉病材料的选择，提高小麦产量和品质等方面均有重要的意义。为开发pm5e的kasp检测标记，本发明利用35k基因芯片技术，通过构建抗病池和感病池，筛选出在抗病池和感病池间存在多态性snp位点的探针，用来搜索小麦基因组序列数据库，找出比对到7bl染色体位点上的探针，共计88个。根据前人已公布的研究结果，pm5e基因被定位在两个est序列cj729392与cj584170之间，这两个est序列之间的遗传距离为23.5cm。利用比对结果，选择位于这两个est序列之间的特异性探针，把位于这两个est序列之间的含有snp特异性位点的探针，经进一步比对分析，将snp转化成kasp标记，在含有抗白粉病基因pm5e的复壮30与高感白粉病材料chancellor杂交获得的214个f2:3代群体中进行基因分型，经过连锁分析，找到两个跟pm5e基因连锁较近的kasp标记，可用于pm5e的高通量检测与标记辅助育种。
本发明提供的两个在育种中有重要利用价值的小麦抗白粉病基因pm5e的分子标记，分别为：分子标记ax-95000860和分子标记ax-94638908；这两个分子标记(即snp)均位于小麦7bl染色体上，其中，分子标记ax-95000860snp的物理位置为721220493，snp位点处碱基为c或t；分子标记ax-94638908snp的物理位置为708115367，snp位点处碱基为c或t。(snp位置是根据现已公布的小麦基因序列数据库而确定的)。
snp标记ax-95000860和标记ax-94638908系本发明首次发现并提出，这两个snp标记与pm5e基因紧密连锁，将这两个snp标记应用于pm5e基因的转育，对于加快抗白粉病小麦品种的选育，提高育种效率具有重要的实践意义。
为检测这两个关键snp在中国小麦白粉病群体中的特异性，有利于对抗白粉病基因pm5e精细定位和克隆，本发明基于kasp技术开发了用于检测与抗白粉病基因pm5e紧密连锁的snp的引物，引物序列如下：
ax-95000860-kasp-fam_c-r：5＇caggattggactcggctggaaac3＇，seqidno.1；
ax-95000860-kasp-hex_t-s:5＇caggattggactcggctggaaat3＇，seqidno.2；
ax-95000860-kasp-r:5＇atgtcaggtcaccacgatgc3＇，seqidno.3。
ax-94638908-kasp-fam_c-r：5＇atgataacatgctgcgcatgac3＇，seqidno.4；
ax-94638908-kasp-hex_t-s:5＇atgataacatgctgcgcatgat3＇，seqidno.5；
ax-94638908-kasp-r:5＇tacacaaactaggtggaggtacaac3＇，seqidno.6。
在获得上述引物之后，发明人进一步提供了具体的检测方法如下：
1.利用ctab法提取待检测的小麦全基因组dna；
2.对复壮30与chancellor杂交获得的214个f2群体进行白粉病表型鉴定，选取高抗、高感的f2单株各15株，分别混成抗池和感池，利用35k基因芯片找到目标基因附近的snp位点；
3.利用primer5.0，将这些snp位点转化成kasp检测标记，和上步提取的基因组dna在q-cycler96pcr仪(hainlifescienceukltd.uk)上进行pcr扩增，并在abiquantstudiotm12kflex实时荧光定量pcr系统上(lifetechnologiescorporationusa)进行snp检测；
判定的标准以点的颜色和聚集在横轴或纵轴的位置决定：信号为红色，聚集在横轴附近且与抗白粉病对照聚集在一起，判定为抗白粉病基因型；信号为蓝色，与纵轴和感白粉病对照聚集在一起，判定为感白粉病基因型；信号为绿色，与两个坐标轴和抗、感病对照均不聚集在一起，在y＝x直线附近的判定为杂合基因型；
4.分析上述得到与pm5e基因紧密连锁的snp标记在小麦群体中的分布情况。
具体方法如下：
利用ctab法提取待检测小麦全基因组dna：
(a)取小麦幼嫩叶片置于96孔深孔板中，利用液氮冷冻处理并于组织研磨器上磨成粉末；(b)于96孔深孔板中的每个孔中加预热65℃的ctab缓冲液800μl，置于65℃水浴90min,每隔10min轻轻晃动一次，使dna充分裂解；(c)加入800μl体积比为24:1的氯仿异戊醇混合液，轻晃10min；(d)12000r，4℃的条件下离心10min，然后取600μl上清液，置于新的洁净96孔深孔板中(注意序号一一对应)；(e)加600μl预冷的异丙醇及60μl3m醋酸钠(ph＝5.2)轻晃摇匀，即可看到白色dna絮状物产生，置于-20℃冰箱冷冻60min，增加dna产量。(f)4000r离心10min后倒掉上清液，将沉淀用预冷的70％乙醇清洗2-3次后风干至无酒精味；(g)加200μl超纯水溶解dna，待dna充分溶于水后，置于-20℃冰箱保存备用。
与pm5e基因连锁的kasp检测标记开发：
目前，已经公布了6个与pm5e紧密连锁的标记，包含4个ssr标记(xgwm783、xgwm1267、xwmc364和xbarc065)和2个est标记(cj729392与cj584170)。抗病亲本复壮30中含有pm5e基因，而另一亲本chancellor表现为高感白粉病。利用这两个抗感材料创建f2分离群体，共214株，并在苗期及成株期进行白粉病表型鉴定。根据鉴定结果，分别选取高抗、高感的f2单株各15株，构建抗、感基因池。利用35k基因芯片技术对抗感基因池的多态性snp位点进行鉴定，其中在7bl上鉴定出88个snp位点。利用urgi网站在中国春的参考基因组上对包含snp位点的探针序列及两个est标记序列进行比对，筛选出27个位于这两个est标记之间的探针，用primer5.0设计成kasp引物。在214个f2分离群体中进行基因分型，找到两个与pm5e基因连锁的snp标记，并将其进一步开发为kasp检测标记。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明所采用的方法中未做详细说明的均为本领域现有技术。
实施例1：小麦基因组dna提取
1)dna提取叶片的收集
在小麦三叶期，选取小麦幼嫩叶片，按编号放入对应的96孔深孔板中，为防止dna降解，在冰盒上操作；
2)利用ctab法提取小麦基因组dna；置于-20℃保存备用。
上述步骤具体如下：
(a)取小麦幼嫩叶片置于96孔深孔板中，利用液氮冷冻处理并于组织研磨器上磨成粉末；(b)于96孔深孔板中的每个孔中加预热65℃的ctab提取液600μl，置于65℃水浴60min，每隔10min轻轻晃动一次，使dna充分裂解；(c)加入600μl体积比为24:1的氯仿异戊醇混合液，轻晃10min；(d)12000r，4℃的条件下离心10min，然后取500μl上清液，置于新的洁净96孔深孔板中(注意序号一一对应)；(e)加500μl预冷的异丙醇及50μl3m醋酸钠(ph＝5.2)轻晃摇匀，即可看到白色dna絮状物产生，置于-20℃冰箱冷冻20min，增加dna产量。(f)4000r离心10min后倒掉上清液，将沉淀用预冷的70％乙醇清洗2-3次后风干至无酒精味；(g)加200μl超纯水溶解dna，待dna充分溶于水后，置于-20℃冰箱保存备用。
上述步骤中所用到的溶液的制备方法如下：
(a)ctab提取液的配制
加去离子水定容至1000ml。
(b)3mnaac(ph＝5.2)
称40.8g三水乙酸钠，倒入烧杯中，加水至80ml，用冰醋酸调ph值到5.2，定容到100ml。
(c)1mtris-hcl(ph＝8.0)
在800ml水中溶解121.1gtris(或是157.6gtrishcl)，冷至室温，加浓盐酸(或是naoh)调ph值到8.0，(约需4.2ml)，定容至1000ml。
(d)0.5medta·2na(ph＝8.0)
在800ml水中加186.1gedta·2na，将ph计放入溶液中，用naoh调ph(约需20gnaoh颗粒)，一边加naoh一边搅拌，使edta·2na溶解，ph大约调至7.8溶液变澄清，定容至1000ml。
(e)氯仿/异戊醇(24：1)
按照体积比氯仿：异戊醇＝24:1配制。
(f)70％酒精1000ml
700ml的无水乙醇中加300ml的去离子水。
实施例2：复壮30中pm5e基因中紧密连锁标记的开发
目前，已经公布了6个与pm5e紧密连锁的标记，包含4个ssr标记(xgwm783、xgwm1267、xwmc364和xbarc065)和2个est标记(cj729392与cj584170)。由于ssr标记的特异性较低，因此本研究开发的kasp检测标记是在两个est标记基础上完成的。抗病材料复壮30中含有pm5e基因，chancellor表现为高感白粉病。利用这两个抗感亲本创建f2分离群体，共214株，并在苗期及成株期进行白粉病表型鉴定。根据鉴定结果，分别选取高抗、高感的f2单株各15株，构建抗、感基因池。利用35k基因芯片技术对抗感基因池的snp位点进行鉴定，其中在7bl上鉴定出88个snp位点。利用urgi网站在中国春的参考基因组上对包含snp位点的探针序列及两个est标记序列进行比对，筛选出27个位于这两个est标记之间的探针，用primer5.0设计成kasp检测标记。设计时剔除有发夹结构的、引物间能形成引物二聚体、上下游引物间tm值超过3℃的标记，共设计16个，通过在f2分离群体中进行基因分型，有3个kasp检测标记能够很好的区分各个体的基因型，通过连锁分析发现，只有本专利公布的两个kasp检测标记与pm5e基因紧密连锁。
实施例3：引物稀释与kasp化验引物混合：
将ax-95000860的三条引物用trishcl稀释到100μm后，按照体积比ax-95000860-kasp-fam_c-r：ax-95000860-kasp-hex_t-s：ax-95000860-kasp-r：trishcl＝6：6：15：23的比例混合，分装后于-20℃保存，作为kasp化验引物。
ax-94638908引物的稀释与混合方法同ax-95000860。
实施例4：pcr扩增体系和程序
pcr体系配制
依下表在冰上配制体系，3μl(20ng/μl左右)模板dna，2×mastermix3μl(lgcgroupuk)，kasp化验引物0.0825μl(引物由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供)。
pcr程序如下：
1)94℃预变性5min；
2)94℃变性20s；
3)65℃退火30s(每个循环降低0.8℃)，步骤2)-3)循环10次；
4)94℃变性20s；
5)57℃退火30s，步骤4)-5)循环38次；
6)4℃保存。
实施例5：结果分析
利用abiquantstudiotm12kflex实时荧光定量pcr系统对扩增好的pcr体系进行snp分布结果的收集，ax-95000860的分布结果如图1所示，其中，横轴为抗白粉病基因型，纵轴为感白粉病基因型，对复壮30与chancellor杂交f2代群体的214个材料进行检测后，得到抗白粉病基因型材料48个(和本发明抗白粉病对照复壮30基因型相同)，感白粉病基因型材料51个(和本发明感白粉病对照chancellor基因型相同)，杂合基因型材料112个(和本发明抗、感白粉病对照亲本均不同的杂合基因型)，3个材料因dna质量原因未检测到基因型。
ax-94638908的分布结果如图2所示，同样对复壮30与chancellor杂交f2代的214个群体检测分析，得到抗白粉病基因型材料56个，感白粉病基因型材料47个，杂合基因型材料111个，2个材料因dna质量原因未检测到基因型。根据该结果结合白粉病表型鉴定结果，将表型转化为基因型，进行连锁图谱的绘制，作进一步研究，有助于加快该基因的精细定位与克隆。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
sequencelisting
<110>山东农业大学
<120>小麦抗白粉病基因pm5e的高通量检测标记及其在育种中的应用
<130>2018
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
caggattggactcggctggaaac23
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
caggattggactcggctggaaat23
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
atgtcaggtcaccacgatgc20
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
atgataacatgctgcgcatgac22
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
atgataacatgctgcgcatgat22
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
tacacaaactaggtggaggtacaac25