本发明涉及核桃dna指纹图谱构建方法及其应用的引物对。
背景技术：
核桃(juglansregia)的故乡是亚洲西部的伊朗，汉代张骞出使西域后带回中国。因此，核桃又被称胡桃，羌桃，为胡桃科植物。核桃与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。
核桃营养价值丰富，有“万岁子”“长寿果”“养生之宝”的美誉。核桃中86％的脂肪是不饱和脂肪酸，核桃富含铜、镁、钾、维生素b6、叶酸和维生素b1，也含有纤维、磷、烟酸、铁、维生素b2和泛酸；每百克含蛋白质15～20克，脂肪较多，碳水化合物10克；并含有人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等多种维生素；而且，具有药用价值，可用于治疗肾虚腰痛，两脚痿弱，小便频数，遗精阳痿；肺气虚弱或肺肾两虚，喘咳短气；肠燥便秘，大便干涩；石淋，小便不利等。是深受老百姓喜爱的坚果类食品之一。
核桃的故乡是亚洲西部的伊朗，汉代张骞出使西域后带回中国。按产地分类，有陈仓核桃、阳平核桃，野生核桃；按成熟期分类，有夏核桃、秋核桃；按果壳光滑程度分类，有光核桃、麻核桃；按果壳厚度分类有两类，分别是薄壳核桃和厚壳核桃。
1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立核桃品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。就国内而言，由于地域间引种利用，核桃地方品种遗传相似性高，传统的形态学和细胞学鉴定方法很难做到准确而真实的鉴定核桃的品种差别，为此需要在分子水平上进行分析鉴定。
dna指纹图谱能够从dna水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。而微卫星(又称为简单重复序列，ssr)是由1～6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段dna。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。
技术实现要素：
为了有效保护我国核桃的品种知识产权，有必要开展核桃微卫星标记开发，并应用于核桃优良品种鉴定的研究。
本发明的目是为了提供核桃微卫星dna标记指纹图谱构建方法及其应用的引物对，该指纹图谱的构建与常规形态学和细胞学检测相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点；对未来更充分、有效的利用核桃种质资源奠定基础。
本发明构建核桃微卫星dna标记指纹图谱的专用引物hssr2，引物对hssr2的正向引物序列为5’-gatttctccaggaaggctcc-3’，反向引物序列为5’-aggaagaagaggagggcttg-3’。
本发明构建核桃微卫星dna标记指纹图谱的专用引物hssr4，引物对hssr4的正向引物序列为5’-gaatgatggccttgatgattg-3’，反向引物序列为5’-gcaacccatcctcaacttct-3’。
本发明核桃微卫星dna标记指纹图谱的构建方法：
提取核桃基因组dna，利用专用引物hssr2或专用引物hssr4进行扩增与筛选，电泳检测，测定条带片段大小及构建微卫星dna标记指纹图谱。
本发明能以单一引物的扩增谱带构建指纹图谱表，并引入带型编号和扩增谱带位点编号信息，是一种开放性的，可以随品种数目增加和更新换代而不断扩充和更新的，由一系列若干个指纹图谱表构成的dna指纹图谱构建方法。该方法使品种鉴定过程中dna指纹图谱检索更简便快速，更适合在农业生产中推广应用。
本发明利用分子标记技术来构建不同核桃品种的dna指纹图谱，有利于核桃品种真实性的快速、准确鉴定，与常规的种植检验和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，结果更稳定、可靠，且省时省力；构建dna指纹图谱和鉴定技术使ssr分子标记技术在作物品种真实性鉴定中广泛的推广应用打下良好的基础。
采用本发明构建的核桃dna指纹图谱，可以根据核桃品种数量增加及品种的更新换代等需要不断增加和更新，以满足农业生产中核桃品种真实性鉴定的需要。
本发明所采用的dna指纹图谱构建及鉴定方法，除了可以应用于核桃的品种真实性鉴定外，还可以应用于其他物种的种质鉴定。本发明所提供的指纹图谱构建及鉴定方法，除了可以应用于ssr指纹图谱构建，还可以应用于其他分子标记技术指纹图谱构建。
本发明构建的dna标记指纹图谱多态性高，指纹丰富，重复性好；利用该dna标记指纹图谱检测核桃品种鉴定的准确性和效率大大提高。
本发明专用引物hssr2和hssr4是从众多pcr引物对中筛选出来的，设计过程中避免了引物二聚体、发卡结构及错配等引物二级结构的出现。
具体实施方式
实施例1
利用专用引物hssr2构建核桃微卫星dna标记指纹图谱的方法：
一、dna提取
提取不同核桃品种生物体样品dna，取部分dna溶液测其浓度，稀释至20ng/μl，于-20℃保存备用；
二、以步骤一核桃的基因组dna为模板，采用专用引物hssr2进行pcr扩增；pcr反应体系为(20μl)：1×buffer，1.5mmol/lmgcl2，0.1mmol/ldntps，500nmol/l引物，1utaq酶，50ngdna模板。反应在eppendorfmastercyclergradientpcr扩增仪进行，pcr程序为：94℃2min；94℃15s，52～65℃30s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min；
三、pcr产物在6.0％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，检测。
根据引物呈现的条带信息建立指纹图谱，以核桃品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，制得引物hssr2对不同核桃品种的dna指纹图谱表为：
本实施例选择了14份核桃品种，都为现阶段生产中栽培利用的品种，包括新疆本地早实类型、新疆本地晚实类型、国内选育早实类型、国外早实类型等，基本代表了现阶段国内外栽培利用的主要核桃类型。核桃品种材料选定类型及来源广，具有代表性。
实施例2
利用专用引物hssr4构建核桃微卫星dna标记指纹图谱的方法：
一、dna提取
提取不同核桃品种生物体样品dna，取部分dna溶液测其浓度，稀释至20ng/μl，于-20℃保存备用；
二、以步骤一核桃的基因组dna为模板，采用专用引物hssr4进行pcr扩增；pcr反应体系为(20μl)：1×buffer，1.5mmol/lmgcl2，0.1mmol/ldntps，500nmol/l引物，1utaq酶，50ngdna模板。反应在eppendorfmastercyclergradientpcr扩增仪进行，pcr程序为：94℃2min；94℃15s，52～65℃30s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min；
三、pcr产物在6.0％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，检测。
根据引物呈现的条带信息建立指纹图谱，以核桃品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，制得引物hssr4对不同核桃品种的dna指纹图谱表为：
本实施例选择了14份核桃品种，都为现阶段生产中栽培利用的品种，包括新疆本地早实类型、新疆本地晚实类型、国内选育早实类型、国外早实类型等，基本代表了现阶段国内外栽培利用的主要核桃类型。核桃品种材料选定类型及来源广，具有代表性。