本发明属于分子标记技术领域，具体涉及黄毛鼠微卫星dna标记及其扩增引物、检测方法和应用。
背景技术：
：
微卫星dna广泛存在于原核及真核基因组中，常见的有二、三、四核苷酸重复序列，占真核基因组的50％，由串联的2-6bp的简单序列重复排列(如：ac、cca或gata、ssr)组成。最常见的是双核苷酸重复，如(ac/tg)n及(ag/tc)n。每个特定位点的微卫星dna均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。生物体中有不同个体表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不同；也有可能有相同数目的重复单位但侧翼区大小不同，或者两者都不同。对非微卫星dna位点的dnarflp研究表明，每个位点的rflp仅能检测到1至数个等位基因。故一般认为微卫星dna位点的侧翼区变异数极少，特定微卫星位点的等位基因差异，主要应来自不同数目的串联重复。
微卫星标记因高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，已广泛用于群体遗传学研究、亲缘关系鉴定、及遗传连锁图谱构建和qtl分析中。微卫星位点作为遗传标记与其他常用核dna分子标记(包括rflp、rapd、aflp等)和等位酶标记相比，具有以下优点：①作为一种高度多态性的分子标记，微卫星dna具有丰度高、共显性标记、选择中性的特点；②微卫星采用单位点dna指纹技术，检测容易，重复性较好；③微卫星dna扩大了取样范围，减轻了取样工作的困难和对研究对象的影响；④微卫星的出现为种群生物学提供了空前丰富的遗传信息资料，同时也促进了相应统计分析方法的发展。
黄毛鼠为啮齿目鼠科大鼠属(rattus)的野栖鼠种，是我国华南地区及东南亚水稻生产区最重要的害鼠之一，主要分布于长江以南及湖北、安徽等地区。黄毛鼠在平原、丘陵和山区农田数量较多，喜居于稻田、甘蔗地、菜地、灌木丛、塘边、沟边的杂草中。黄毛鼠为杂食性鼠类，喜取食水稻、红薯、小麦等，对早熟的水稻危害严重。在缺乏植性食物时，该鼠也取食小动物和昆虫。黄毛鼠一年中以3、4月份和8、9、10月份两个时期为繁殖高峰(余全茂和刘思松，1997)。黄毛鼠的种群数量变化受食物、气候和环境因子的影响，也有种群内密度调节等因素的作用。
随着分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，分子标记作为个体识别工具的优势逐渐凸显出来，现己成为遗传多样性检测、种群结构和物种种间关系等方面的分析手段之一。黄毛鼠是华南地区主要害鼠之一，其种群间交流和婚配制度尚未有系统深入的研究。黄毛鼠分子生态学的研究目前没有国内研究报道，国外这方面的研究也相对较少，为了进一步了解黄毛鼠种群结构和遗传多样性等方面的信息，需要开发新的分子遗传标记。本研究是目前对黄毛鼠的微卫星位点进行研究，运用其就黄毛鼠群体地理遗传差异进行研究，为以后关于黄毛鼠乃至啮齿动物相关领域的探讨提供了研究基础。
技术实现要素：
：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种黄毛鼠微卫星dna标记及其扩增引物、检测方法和应用。本发明建立了黄毛鼠微卫星dna的技术体系并利用这些分子标记进行黄毛鼠亲缘关系鉴定及遗传多样性的分析。
本发明通过黄毛鼠微卫星(ct)n，(ag)n，(tg)n和(ac)n富集文库的构建，含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到的含有微卫星重复序列的克隆，确定了8个多态性丰富的微卫星标记chrom1-26，chrom2-2，chrom15-6，chrom16-6，chrom16-12，chrom20-9，chrom20-37，chrom-16。
因此，本发明的第一个目的是提供一种黄毛鼠微卫星dna标记，所述的微卫星dna标记编号为chrom1-26、chrom2-2、chrom15-6、chrom16-6、chrom16-12、chrom20-9、chrom20-37和chrom-16；
所述的chrom1-26的核苷酸序列如seqidno.1所示；
所述的chrom2-2的核苷酸序列如seqidno.2所示；
所述的chrom15-6的核苷酸序列如seqidno.3所示；
所述的chrom16-6的核苷酸序列如seqidno.4所示；
所述的chrom16-12的核苷酸序列如seqidno.5所示；
所述的chrom20-9的核苷酸序列如seqidno.6所示；
所述的chrom20-37的核苷酸序列如seqidno.7所示；
所述的chrom-16的核苷酸序列如seqidno.8所示。
本发明的第二个目的是提供一种所述的黄毛鼠微卫星dna标记的扩增引物，所述的扩增引物包括：
针对chrom1-26位点：
chrom1-26f：5’-agacaatccaatctgggtgc-3’(如seqidno.9所示)，
chrom1-26r：5’-aggcaattctccactaggca-3’(如seqidno.10所示)；
针对chrom2-2位点：
chrom2-2f：5’-gaaagccacttggaggtacg-3’(如seqidno.11所示)，
chrom2-2r：5’-tgcccaaacagtgcactaag-3’(如seqidno.12所示)；
针对chrom15-6位点：
chrom15-6f：5’-cactacatcttcatgccgga-3’(如seqidno.13所示)，
chrom15-6r：5’-tcatggatcatcgtgaagga-3’(如seqidno.14所示)；
针对chrom16-6位点：
chrom16-6f：5’-cagtcttagcccttggtgga-3’(如seqidno.15所示)，
chrom16-6r：5’-cctcatgttgtaccgtccct-3’(如seqidno.16所示)；
针对chrom16-12位点：
chrom16-12f：5’-tgctgttagctccatgttgg-3’(如seqidno.17所示)，
chrom16-12r：5’-aggggtcagagtggtccttt-3’(如seqidno.18所示)；
针对chrom20-9位点：
chrom20-9f：5’-gtttggcaatttccctctga-3’(如seqidno.19所示)，
chrom20-9r：5’-agaccccaaactctggcttt-3’(如seqidno.20所示)；
针对chrom20-37位点：
chrom20-37f：5’-agctttccctcccactcatt-3’(如seqidno.21所示)，
chrom20-37r：5’-tttttcactgcccaatcaca-3’(如seqidno.22所示)；
针对chrom-16位点：
chrom-16f：5’-aagcgacgcccataaacata-3’(如seqidno.23所示)，
chrom-16r：5’-ttcacccaggacttcttgct-3’(如seqidno.24所示)。
所述的扩增引物的正向引物的5’端有荧光标记。
所述的荧光标记优选为fam、hex或tamra。
本发明的第三个目的是提供一种黄毛鼠微卫星dna标记的检测方法，包括以下步骤：
(1)、提取黄毛鼠基因组dna；
(2)、以步骤(1)提取的基因组dna为模板，分别利用所述的针对chrom1-26位点的引物对chrom1-26f和chrom1-26r、针对chrom2-2位点的引物对chrom2-2f和chrom2-2r、针对chrom15-6位点的引物对chrom15-6f和chrom15-6r、针对chrom16-6位点的引物对chrom16-6f和chrom16-6r、针对chrom16-12位点的引物对chrom16-12f和chrom16-12r、针对chrom20-9位点的引物对chrom20-9f和chrom20-9r、针对chrom20-37位点的引物对chrom20-37f和chrom20-37r，针对chrom-16位点的引物对chrom-16f和chrom-16r进行pcr扩增；
(3)、利用测序仪对pcr扩增产物进行分型。
所述的pcr扩增，其反应体系优选为50μl，包括：10×kodbuffer5μl、2mmdntps4μl、25mmmgso41μl、100μm正向引物1.5μl、100μm反向引物1.5μl、dna模板1μl、kod-plus-1μl，补水至50μl。
所述的pcr扩增，其反应程序优选为：95℃3min，95℃30s，60℃30s，68℃8min，35个循环；4℃保存。
本发明的第四个目的是提供所述的微卫星dna标记或扩增引物在黄毛鼠群体遗传多样性研究或亲权关系鉴定研究中的应用。
本发明的黄毛鼠微卫星dna标记可应用于黄毛鼠不同群体遗传多样性研究以及亲权关系鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
附图说明：
图1是黄毛鼠基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m为dl2000marker，条带大小从下到上依次为：100、250、500、750、1000、2000bp。
图2是部分微卫星位点引物扩增22个黄毛鼠样本的电泳图；其中15-6为chrom15-6位点引物扩增22个黄毛鼠样本的电泳图，16-6为chrom16-6位点引物扩增22个黄毛鼠样本的电泳图，16-12为chrom16-12位点引物扩增22个黄毛鼠样本的电泳图，20-9为chrom20-9位点引物扩增22个黄毛鼠样本的电泳图。
图3是chrom1-26位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图4是chrom2-2位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图5是chrom15-6位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图6是chrom16-6位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图7是chrom16-12位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图8是chrom20-9位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图9是chrom20-37位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
图10是chrom-16位点引物扩增22个黄毛鼠基因组dna的ssr分型图；其中s1-s22代表22个黄毛鼠样本。
具体实施方式：
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何像是上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
本发明中，所涉及的份，百分比均为重量单位，所采用的设备和原料都是本领域常用购入。下面实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域中的常规方法。
实施例1：
1、实验步骤
1.1、黄毛鼠dna提取
剪取黄毛鼠肌肉约50mg用于抽提dna，提取方法采用标准氯仿-异戊醇-酒精提取程序。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测dna的纯度和浓度，并稀释成30ng/μl的工作液，置于4℃备用。用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna浓度(见图1)。
1.2、微卫星位点选取
参照黄毛鼠的近缘种微卫星位点，利用misa软件进行ssr位点的查找。在ssr位点两侧，利用primer3软件进行60对引物的设计。
1.3、引物筛选
以质量较好的模板进行60对引物的初筛工作，扩增体系及反应程序如下：
扩增体系：
反应程序：
1.4、荧光引物的合成及pcr扩增
将筛选效果较好的引物的正向引物进行荧光标记，并以合成的荧光引物对所有样品进行pcr扩增，扩增体系及扩增条件同上。
1.5、荧光pcr产物毛细管电泳
将以荧光引物扩增的pcr产物进行凝胶电泳检测，根据检测结果进行毛细管电泳，并对结果进行分析。
2.实验结果及分析
2.1引物初筛工作
根据设计的引物，选择合成60对进行引物的初筛工作，以22个黄毛鼠dna样本进行引物的初筛，筛选出25对引物。
2.2荧光引物合成扩增及检测
对初筛出的25对引物，需进一步验证其有效性，根据初筛引物，进行荧光引物的合成，对所有22个样品进行荧光pcr扩增后电泳检测，并根据检测结果对再次筛选的引物进行毛细管电泳，部分电泳检测结果如图2。
2.3荧光引物的毛细管电泳
扩增产物经处理后，与内参一起经abi3730xl上机检测，得毛细管电泳原始数据，用genemaeker软件对其进行条带的判读。确定了8个多态性丰富的微卫星标记(见图3-10)，位点分别为：chrom1-26(如seqidno.1所示)，chrom2-2(如seqidno.2所示)，chrom15-6(如seqidno.3所示)，chrom16-6(如seqidno.4所示)，chrom16-12(如seqidno.5所示)，chrom20-9(如seqidno.6所示)，chrom20-37(如seqidno.7所示)，chrom-16(如seqidno.8所示)。
2.4最终引物序列
最终用来进行亲缘关系聚类分析的8对引物序列如下表1：
表1黄毛鼠微卫星标记及扩增引物
2.5哈德温伯格平衡分析
结果如下表2：
表2黄毛鼠微卫星标记特性表
注：na代表等位基因数目；ne代表有效等位基因数目；ho代表观测杂合度值；he代表期望杂合度值；x2代表卡方检验值；p值大小表示显著性(p<0.05具有显著性)
从表2中可知，微卫星标记chrom1-26、chrom2-2、chrom15-6、chrom16-6、chrom16-12、chrom20-9、chrom20-37和chrom-16均具有高度多态性，可应用于黄毛鼠不同群体遗传多样性研究以及亲权关系鉴定的研究。
序列表
<110>广东省生物资源应用研究所
<120>黄毛鼠微卫星dna标记及其扩增引物、检测方法和应用
<160>24
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>251
<212>dna
<213>黄毛鼠(rattuslosea)
<400>1
agacaatccaatctgggtgcctgaacgtttgactcgcaaactgcctcctgctattcgtga60
agatgagactacgaatactactactactactggaaatgatgatccaggttgattcactca120
cgctgtgggctatcgccagatcctggccagtacttatgccagttcatagcaattctactg180
ttttgccaacctttttctccacatcctgtttgcgtgatgttccttgtatagtgcctagtg240
gagaattgcct251
<210>2
<211>221
<212>dna
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gaaagccacttggaggtacgtaagtatgagtgctggaaagcgctgctgaatgtgtgcatg60
cgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgaattaagtcc120
tataatctgtgttttttggtaccagtttagtgtcttggtgcactgtctgggcagaaggat180
tcctgccctgtgcacgagagtcttagtgcactgtttgggca221
<210>3
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tgtgtgccttttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttcttccttt120
ctttctttcttttctgtgaagaattgagttgcattttgatggagattttttaatctggag180
attgctcttgtttagatgacctttttttttaaccatgctccttcacgatgatccatga238
<210>4
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<212>dna
<213>黄毛鼠(rattuslosea)
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cagtcttagcccttggtggaaaaccctggaagcacagtggaaaaacaccaggtgcttaag60
tttatggtctcaggataaaaactcaggacttagcagttgctacattgtatgctacagcct120
tgggcaacaaactagcacatcccagggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt180
gtgtgtgtgtgtgtggtggggtggtgagaacacatgacagggacggtacaacatgagg238
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tgctgttagctccatgttggtttgggctacagtgtgagactttacctccattaaaagctc60
acctagttagtagttgtgctgttagacaatgaatatattgtctaaaaggcatatataata120
ataataataattatgatagtaacttataaaccttaaacaacctttgatgctcacctgctc180
cccactccccagaaaaaaagagaaattgcactaactgacaaaaccattaaaaaggaccac240
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gtttggcaatttccctctgaattccacatctgtgctgcagtcagaagatggctgggaaca60
catgaaaaaagacagacagacagacacgcacatacactcacacacacacatgcacacagg120
aatgcacgtatgtacacaggcacatgctcgcttgcacagtaatgtaataaaatttaaaag180
ccagagtttggggtct196
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