本发明属于植物病害病原检测技术领域，具体涉及一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法。
背景技术：
根结线虫（meloidogynespp．）是植物病原线虫中种类最多、分布最广和危害最严重的一类线虫。这类线虫主要以土壤传播的形式，危害植物的根系，使受害植物的根部形成肿瘤状的根结，从而发生严重影响植物正常生长发育的根结线虫病，已知受根结线虫病危害的植物主要包括茄科、豆科、葫芦科、禾本科、伞形花科等3000多种，在温带、亚热带和热带地区的植物受害尤其严重。其中尤以烟草受根结线虫危害最为严重，据联合国粮农组织估计，发达国家因根结线虫造成的烟草损失平均每年为4%，全世界的平均损失估计为10%，发展中国家的损失超过25%。在我国自20世纪80年代中后期以来，烟草根结线虫病病区不断扩大，危害加重，在河南、山东、云南、贵州、四川、湖北等烟区发生较为普遍，危害较重，病区发病率一般为70%－100%，重者达90%以上，减产30%－70%，成为了我国烟草生产上的主要病害。
根结线虫属于土壤习居性生物，由于受到土壤环境的限制外部施加的物理、化学因素很难对根结线虫起作用，尤其是近年来，用于根结线虫病防治的多数化学杀线虫剂存在高毒、高残留的弊端，已在世界范围内被普遍禁用。因此采取安全高效的根结线虫病防控方法已成为大势所趋。在烟草根结线虫病的防控过程中，选择采用合适的抗病烟草品种被认为是一项经济、高效、绿色的措施。然而，根结线虫种类繁多，不同根结线虫对寄主植物的致病能力不同，抗病品种对根结线虫的抗性范围也有限，当前国内烟草上分布最广泛危害最严重的根结线虫主要是花生根结线虫（meloidogynearenaria）、南方根结线虫（m.incognita）和爪哇根结线虫（m.javanica），这三种根结线虫的形态和分子生物学特征极为相似，但对不同烟草品种存在较大的致病性差异。因此准确、快速鉴定上述三种根结线虫是选育和利用抗病烟草品种的前提条件。
鉴定根结线虫种类最常用的方法是形态学方法，该方法通过显微操作方法切割根结线虫雌成虫会阴区角质膜，在显微镜下观察会阴区花纹的差异来确定根结线虫的种类。这种方法的优点是简便、直观，存在的弊端是：1.根结线虫种类多，许多种类的会阴花纹特点比较容易混淆，使得鉴定的准确性完全依靠操作者的经验，误判的概率较高；2.同一种类的根结线虫的会阴花纹存在个体差异，在实际操作时至少需要对20头以上的雌成虫进行观察才能确诊，费工、费时；3.形态学鉴定只适用于成虫，不适宜幼虫，而土壤中分离到的根结线虫都是以二龄幼虫的形式存在，使的该方法在实际应用中受到限制。另外，同工酶电泳方法也是根结线虫鉴定中常用的方法，该方法以根结线虫雌成虫的蛋白粗提物进行聚丙烯酰胺电泳，通过酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶染色后根据酶带的谱型来进行种类判断，该方法部分克服了形态学鉴定的缺点，可以比较快速准确的判断根结线虫种类，但依然只能用雌成虫来作为鉴定对象。
近年来随着分子生物学技术的发展，采用pcr技术对根结线虫进行快速、准确鉴定已成为趋势。与形态学和同工酶电泳鉴定方法相比，pcr鉴定法适用范围更为广阔，根结线虫的卵、二龄幼虫和雌雄成虫皆可作为鉴定的对象。早期的pcr鉴定包括采用随机引物扩增的rapd－pcr技术或采用线虫通用引物扩增后再对扩增产物进行限制性酶切的pcr－rflp技术，它们的共同缺点是由于使用非根结线虫专用的特异引物而造成鉴定的稳定性和准确性不高。因此，国内外学者近年来开始转而采用根结线虫种类特异性pcr引物扩增来进行根结线虫的种类鉴定。徐建华等发明的《一种根结线虫快速分子检测引物及其用法》（专利号：zl03131763.4），曾建敏等发明的《一种烟草中根结线虫的鉴定方法》（专利号：zl201610585565.x）提供了烟草根结线虫病病原线虫pcr鉴定的新方法，该方法采用三对根结线虫种类特异引物对分离自烟草病根和土壤的根结线虫分别进行pcr检测，鉴定方便，准确率高，大大提高了烟草根结线虫病病原的诊断效率。但由于采用了分步pcr检测法，至少需要进行三次以上的pcr反应才能完成一个样品的鉴定，使得鉴定过程操作繁琐、耗时长。因此，开发一种能解决上述技术问题的检测鉴定方法是非常必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法。
本发明的目的是这样实现的，包括pcr引物设计、dna模板制备、pcr扩增、产物检测步骤，具体包括：
a、pcr引物设计：根据南方根结线虫、花生根结线虫和抓哇根结线虫的种类特异性序列设计6条pcr引物，即tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6用于上述3种根结线虫pcr鉴定，其序列分别为：
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b、dna模板制备：
在检测烟草病根样品时：将病根样品表面的附着物去除，挑取根结线虫卵块或根结组织置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨成粉末转入离心管中，加入dna提取缓冲液，置于50~60℃水浴保温50~70min，冷却至室温，用等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂和氯仿-异戊醇混合溶剂依次抽提，取上清液加等体积的异丙醇沉淀，沉淀经体积百分浓度60~80%的乙醇溶液清洗并干燥后，溶于灭菌纯净水中，调节dna浓度值50ng/μl，得到用于pcr检测的dna模板制备液；
在检测样品为烟草根际土壤时：取土壤样品采用常规方法进行土壤线虫分离，将得到的线虫悬浮液置于解剖镜下观察，挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2~3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶k溶液中，用解剖针将线虫切断，60℃水浴1h后95℃加热10min，冷却至室温即得用于pcr检测的dna模板制备液；
c、pcr扩增：以用于pcr检测的dna模板制备液进行pcr扩增得到pcr扩增产物；
d、产物检测：取5~10μl的pcr扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳电泳，结束后经溴化乙锭染色后再紫外透射仪下观察，如检测到分子量为700bp的电泳谱带表明受检样品中含有南方根结线虫，如检测到分子量为260bp的电泳谱带表明受检样品含有花生根结线虫，如检测到分子量为570bp的电泳谱带表明受检样品中含有爪哇根结线虫。
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
1、本发明根据南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的种类特异区序列设计了包含6条pcr引物用于上述3种根结线虫的种类鉴定，鉴定的稳定性好、准确性高。
2、本发明所设计的6条引物组合使用，可以实现1次pcr反应完成3种烟草根结线虫病病原线虫的同步检测，鉴定方便、省时。
3、本发明采用普通pcr仪和常规试剂，检测成本，利于推广应用。
4、本发明包含设计了针对病根样品和土壤样品的dna制备方法，可以以包括卵、幼虫和成虫在内的各发育阶段的根结线虫为对象进行种类鉴定，具有广泛的使用范围。
附图说明
图1为本发明烟草结线虫病病根样品的pcr扩增结果示意图；
其中，m为dna分子量标准（dl2000），1-12依次为采自云南省禄劝县、沾益县、江川县、丘北县、师宗县、耿马县、蒙自市、屏边县、宾川县、砚山县、建水县和弥勒市的烟草根结线虫病病根样本；
图2为本发明烟草根结线虫病根际土壤样品的pcr扩增结果示意图；
其中，m为dna分子量标准（dl2000），1-2分别为采自云南省丘北县和江川县的烟草根结线虫病根际土样本。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法，包括pcr引物设计、dna模板制备、pcr扩增、产物检测步骤，具体包括：
a、pcr引物设计：根据南方根结线虫、花生根结线虫和抓哇根结线虫的种类特异性序列设计6条pcr引物，即tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6用于上述3种根结线虫pcr鉴定，其序列分别为：
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b、dna模板制备：
在检测烟草病根样品时：将病根样品表面的附着物去除，挑取根结线虫卵块或根结组织置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨成粉末转入离心管中，加入dna提取缓冲液，置于50~60℃水浴保温50~70min，冷却至室温，用等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂和氯仿-异戊醇混合溶剂依次抽提，取上清液加等体积的异丙醇沉淀，沉淀经体积百分浓度60~80%的乙醇溶液清洗并干燥后，溶于灭菌纯净水中，调节dna浓度值50ng/μl，得到用于pcr检测的dna模板制备液；
在检测样品为烟草根际土壤时：取土壤样品采用常规方法进行土壤线虫分离，将得到的线虫悬浮液置于解剖镜下观察，挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2~3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶k溶液中，用解剖针将线虫切断，60℃水浴1h后95℃加热10min，冷却至室温即得用于pcr检测的dna模板制备液；
c、pcr扩增：以用于pcr检测的dna模板制备液进行pcr扩增得到pcr扩增产物；
d、产物检测：取5~10μl的pcr扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳电泳，结束后经溴化乙锭染色后再紫外透射仪下观察，如检测到分子量为700bp的电泳谱带表明受检样品中含有南方根结线虫，如检测到分子量为260bp的电泳谱带表明受检样品含有花生根结线虫，如检测到分子量为570bp的电泳谱带表明受检样品中含有爪哇根结线虫。
b步骤中所述的dna提取缓冲液为200mmol/ltris-hclph＝8.5，250mmol/lnacl，25mmol/ledta，0.5%sds组成。
b步骤中所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂中酚、氯仿和异戊醇的体积配比为25:24:1。
b步骤中所述的氯仿-异戊醇混合溶剂中氯仿和异戊醇的体积配比为24:1。
c步骤中pcr反应体系为1×pcrbuffer，1utaq酶，0.2mmdntps，以及引物tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6各0.4μm的25μlpcr反应体系。
c步骤中pcr反应条件为预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，52℃60s，72℃90s；最后再72℃延伸10min。
本发明所述的烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法具体操作如下：
（1）根据南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的种类特异性序列设计6条pcr引物，即tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6用于上述3种根结线虫pcr鉴定，其序列分别为：
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（2）用于烟草根结线虫病病原线虫pcr检测的dna模板制备，包括：
在检测烟草病根样品时，将病根样品表面的附着的泥土等杂质用自来水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，解剖镜用挑针挑取根结线虫卵块，或直接用剪刀将根结部分剪下，称取0.2g的卵块或根结组织置于经高压灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状转入1.5ml的离心管中，加入0.5mldna提取缓冲液（200mmol/ltris-hclph＝8.5，250mmol/lnacl，25mmol/ledta，0.5%sds），置于55℃水浴中保温1h。待冷却至室温后，用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和氯仿：异戊醇（24:1）依次抽提，取上清液加等体积异丙醇沉淀。沉淀经70%乙醇清洗并干燥后，溶于灭菌纯净水中，调节dna浓度至50ng/μl，得到用于pcr检测的dna模板制备液。
在检测样品为烟草根际土壤时，先取200g土壤样品采用常规方法进行土壤线虫分离，将得到的线虫悬浮液置于解剖境下观察，挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2-3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶k溶液中，用解剖针将线虫切断，60℃水浴1h后95℃加热10min，冷却至室温即得用于pcr检测的dna模板制备液。
（3）pcr扩增：取2μl在步骤（2）得到的dna模板制备液加入含1×pcrbuffer，1utaq酶，0.2mmdntps，以及引物tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6各0.4μm的25μlpcr反应体系中；置于pcr仪内进行扩增，经优化的扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，52℃60s，72℃90s；最后再72℃延伸10min。
（4）pcr产物检测：取5～10μl步骤（3）得到的pcr扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶在电泳结束经溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，如检测到分子量为700bp的电泳谱带表明受检样品中含有南方根结线虫，如检测到分子量为260bp的电泳谱带表明受检样品含有花生根结线虫，如检测到分子量为570bp的电泳谱带表明受检样品中含有爪哇根结线虫。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
1.用于三种烟草根结线虫病病原线虫鉴定的特异引物的设计：根据美国国家生物技术信息中心（ncbi）公布的南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫基因组序列信息，用dnastar7.0软件分析，找出三种根结线虫的种类特异性序列，利用primerpremier5.0软件设计6条用于三种根结线虫种类鉴定的pcr引物：
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dna合成仪合成上述6条寡聚核苷酸引物。
2.用于烟草根结线虫病病原线虫pcr鉴定的dna模板制备：分别采自云南省禄劝县、沾益县、江川县、丘北县、师宗县、耿马县、蒙自市、屏边县、宾川县、砚山县、建水县和弥勒市的烟草根结线虫病病根样品，将病根表面的附着的泥土等杂质用自来水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，解剖镜用挑针挑取根结线虫卵块，或直接用剪刀将根结部分剪下，称取0.2g的卵块或根结组织置于经高压灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状转入1.5ml的离心管中，加入0.5mldna提取缓冲液（200mmol/ltris-hclph＝8.5，250mmol/lnacl，25mmol/ledta，0.5%sds），置于55℃水浴中保温1h。待冷却至室温后，用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）和氯仿：异戊醇（24:1）依次抽提，取上清液加等体积异丙醇沉淀。沉淀经70%乙醇清洗并干燥后，溶于灭菌纯净水中，调节dna浓度至50ng/μl，得到用于pcr检测的病根dna模板制备液。
3.病原线虫的pcr特异扩增：取2μl病根dna模板制备液加入含1×pcrbuffer，1utaq酶，0.2mmdntps，以及引物tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6各0.4μm的25μlpcr反应体系中；置于pcr仪内进行扩增，经优化的扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，52℃60s，72℃90s；最后再72℃延伸10min。
4.pcr产物检测：取5μl的pcr扩增产物加入2μl6×电泳上样缓冲液，进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后凝胶块用溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，结果发现禄劝县、沾益县的样本中扩增出一条分子量为570bp的条带，表明受检样本中含爪哇根结线虫；丘北县、师宗县、耿马县、蒙自市、屏边县和宾川县的样本中扩增出一条分子量为700bp的条带，表明受检样本中含有南方根结线虫；江川、砚山县、建水县和弥勒市的样本中扩增出一条分子量为260bp的条带，表明受检样品中含有花生根结线虫(图1)。
实施例2
1.用于三种烟草根结线虫病病原线虫鉴定的特异引物的设计：根据美国国家生物技术信息中心（ncbi）公布的南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫基因组序列信息，用dnastar7.0软件分析，找出三种根结线虫的种类特异性序列，利用primerpremier5.0软件设计6条用于三种根结线虫种类鉴定的pcr引物：
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tr2：5'-gaggattcagctccccagcac-3'
tr3：5'-gagtacggatttgaaatacaggg-3'
tr4：5'-tgaatgctatgccatcaggag-3'
tr5：5'-cgattgaactgagcccagact-3'
tr6：5'-tttattcgcaagacaacaccc-3'
dna合成仪合成上述6条寡聚核苷酸引物。
2.用于烟草根结线虫病病原线虫pcr鉴定的dna模板制备：分别采集云南省丘北县和建水县的烟草根结线虫病的根际土壤样品，每样品各取土壤200g，采用常规方法进行土壤线虫分离，将得到的线虫悬浮液置于解剖境下观察，挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2-3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶k溶液中，用解剖针将线虫切断，60℃水浴1h后95℃加热10min，冷却至室温即得用于pcr检测的土壤dna模板制备液。
3.病原线虫的pcr特异扩增：取2μl土壤dna模板制备液加入含1×pcrbuffer，1utaq酶，0.2mmdntps，以及引物tr1、tr2、tr3、tr4、tr5和tr6各0.4μm的25μlpcr反应体系中；置于pcr仪内进行扩增，经优化的扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，52℃60s，72℃90s；最后再72℃延伸10min。
4.pcr产物检测：取5μl的pcr扩增产物加入2μl6×电泳上样缓冲液，进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后凝胶块用溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，结果发现丘北县的样本中扩增出一条分子量为700bp的条带，表明受检样本中含有南方根结线虫，江川的样本中扩增出一条分子量为260bp的条带，表明受检样品中含有花生根结线虫(图2)。
sequencelisting
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法
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