本发明涉及一种快速检测犬埃立克体感染的引物及检测试剂和试剂盒，属生物技术领域。
技术背景
犬埃立克体病是由犬埃立克体(ehrlichiacanis，e.canis)等埃立克体所引起的一种人兽共患传染病。1935年，e.canis被首次发现，1968年首次确认其对犬的致病性，1986年美国首次发现犬埃立克体感染人的病例，目前该病在全球热带和亚热带地区广泛分布。e.canis是一种严格的胞内寄生病原菌，主要对犬的白细胞和脾脏等造成损伤，病犬表现为免疫力低下、极度消瘦，因此该病也被称为犬的艾滋病。
近年来，我国有多起犬感染e.canis的病例报道。虽然，目前国内尚没有e.canis引起人发病的报告，但国外报道人感染e.canis后会出现器官衰竭，凝血紊乱以及条件性的传染，因此该病已经引起国内外学者的广泛关注。在广州地区的调查发现，养犬场工作人员血清犬埃立克体抗体阳性率为11.54％，普通人血清抗体阳性率2.78％。
e.canis属于立克次体科、埃立克体族。埃立克体族包括埃立克体(ehrlichia)、考德里体(cowdria)和新立克次体(neorickettsia)3个属。埃立克体为革兰染色阴性，姬姆萨染色菌体呈蓝色。埃立克体通常为圆形，但有时呈椭圆形或表现出多种形态，菌体平均长度为1μm。埃立克体主要感染循环系统的单核细胞、粒细胞、淋巴细胞和血小板，以单个或多个菌体聚集的形式存在于细胞膜包被的空泡内，为严格的胞内寄生病原。不同的埃立克体对的血细胞的亲和性不同，这是埃立克体种间差异的重要特征之一。
e.canis主要的传播媒介是吸血节肢动物蜱。不同种的埃立克体由不同的蜱传播。1997年，国内学者对广东、广西和海南部分地区的蜱样本进行检测，发现携带e.canis核酸片段的蜱种为血红扇头蜱和微小牛蜱。随后在我国的南方和北方蜱中都检测到e.canis核酸。通常情况下，蜱吸食感染e.canis的犬血液而感染，e.canis在蜱体内可存活155d以上，因此越冬的蜱可在第二年感染易感犬。犬感染e.canis10天后可出现临床症状，急性期持续1周，初期主要表现为不明高热，体温可高达41.5℃；后期出现食欲不振、嗜睡、口鼻有黏液脓性分泌物等，四肢或下腹水肿，咳嗽或呼吸困难；触诊可感觉到全身淋巴结肿大；实验室检验各类血细胞数明显减少；在急性期病犬体表通常可找到寄生的蜱。急性期过后的病犬可携带e.canis长达2年。
犬埃立克体病的流行高峰期在每年的4～10月，与传播媒介蜱的繁殖活跃期相一致。在犬种的易感性方面，以德国牧羊犬最敏感，其他犬种感染后也表现出临床症状。在年龄方面，幼犬到成年犬均可感染，幼犬的临床症状严重，病程短，病死率高。
犬埃立克体病确诊主要依赖于实验室检测。目前，实验室常用的检测方法包括病原学检测、血清学检测、和分子生物学检测。病原学检测包括病原电镜观察和病原的分离培养。电镜观察可采集发热期病犬静脉血，进行抗凝和离心，收集单核细胞和血小板进行透射电镜观察，可在单核细胞的细胞质和血小板中发现埃立克体包涵体，但该方法的特异性和敏感性较差。由于该病原是一种严格的胞内寄生病原不能在无生命的培养基上生长，也不能在鸡胚中培养，必须用原代或传代细胞系来培养增殖，初次培养时间较长，病原的分离培养非常困难。血清学检测常用的方法是间接免疫荧光试验(ifa)，可采发病犬血分离血清，进行ifa测定，若抗体滴度达到即可判断为阳性。然而，用ifa进行检测时，不但需要价格昂贵的荧光显微镜，而且还会与其他不同种类的埃立克体或微生物发生交叉反应，出现假阳性结果。
pcr扩增是一种常用的分子生物学检测方法，由于其简单、快速、敏感且能够特异扩增病原的核酸，已广泛用于病原微生物的检测。用pcr检测e.canis时，可采集发热期病犬的血液，提取全血dna，用埃立克体属或种特异引物进行体外dna扩增，若pcr检测为阳性，即可确诊。目前，常用于e.canispcr检测的靶基因有16srrna、gp19、gp30、gp140和gp200基因等，其中16srrna基因保守性最高，不但可用于检测e.canis，还可以用来鉴别犬埃立克体的不同菌株。然而，pcr方法也存在不足之处，如需要专门的技术和设备，对实验室要求较高，限制了该方法在基层实验室的广泛应用。
重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是近年来发明的一种新型核酸体外恒温扩增技术。rpa技术的工作原理是通过使用重组酶与引物结合形成的复合物，在模板上寻找同源序列，定位后就会引发链交换反应并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。rpa技术可以在25-42℃恒温条件下快速完成核酸扩增，产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测。与pcr方法相比，rpa检测方法具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应时间短、不需贵重仪器等优点，在现场快速检测中实用性更强，目前已经用于一些病原微生物核酸的检测。
一种快速检测犬埃立克体(e.canis)感染的引物和检测试剂及试剂盒就应运而生。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种快速检测犬埃立克体感染的引物及检测试剂和试剂盒，为犬e.canis感染的分子诊断提供了一个快速、简便、准确的检测体系。
本发明将重组酶聚合酶扩增(rpa)和免疫侧流层析检测技术(lfa)技术相结合，建立了快速检测e.canis感染的可视化体系。
首先通过重组酶聚合酶扩增技术(rpa)对e.canis核酸进行扩增，由于rpa的上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，因此当rpa扩增结果为阳性时，rpa产物可与胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体igg结合，继续扩散后又与检测线上包被的亲和素发生结合，因此在nc膜的检测线(t线)上会出现特异性的胶体金条带；随着胶体金标记的鼠抗地高辛单克隆抗体igg的迁移，会与质控线上包被的羊抗鼠igg结合，在质控线(c线)也会出现条带。当rpa扩增结果为阴性时，上游引物会被胶体金标记抗地高辛抗体所吸收，下游引物虽然能与亲和素发生结合，但没有携带胶体金颗粒，因此在nc膜的检测线(t线)上不出现胶体金条带；同时随着胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体igg复合物的迁移，会与羊抗鼠igg结合，因此在质控线(c线)上会出现条带。
本发明釆用重组酶聚合酶扩增-侧流层析(rpa-lfa)检测技术建立了e.canis核酸的可视化快速检测体系。本发明首先通过对genbank中登录的e.canis不同菌株16srrna基因进行序列比对，筛选出高度保守基因片段为扩增的靶片段；根据rpa引物设计原则设计若干对rpa特异性引物，分别用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，通过对e.canis核酸进行rpa扩增试验，从中筛选出1对特异性高、敏感性强的rpa引物，即上游引物的dna序列为<210>2，下游引物的dna序列为<210>3，以此为基础建立了检测e.canis核酸的rpa检测体系。
在此基础上，将胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体铺在结合垫上，nc膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被羊抗鼠igg，配合加样垫和吸收垫组装成lfa试纸条。将rpa产物滴加于lfa试纸条加样垫上，建立了检测e.canis核酸的rpa-lfa可视化检测方法。利用建立rpa-lfa检测方法分别对犬埃立克体(e.canis)、查菲埃立克体(e.chaffeensis)、埃文氏埃立克体(e.ewingii)、犬血支原体(m.heamocanis)、大肠杆菌(e.coli)、犬布鲁氏菌(b.canis)等多种病原的核酸样品进行扩增，证实所筛选的e.canisrpa-lfa可视化检测引物具有很高的特异性。通过对e.canis核酸样品的检测，并与常规pcr法进行比较，证实rpa-lfa引物具有高度的敏感性，为犬e.canis感染的分子诊断提供了一个快速、简便、准确的检测试剂。
本发明主要包含以下几个方面的内容：
1、e.canis16srrna基因的合成及其重组质粒的构建核酸的提取
2、e.canis16srrna基因重组质粒拷贝数的确定
3、e.canisrpa反应体系的配制及操作步骤
4、e.canisrpa引物的筛选
5、e.canisrpa-lfa的建立及操作步骤
6、e.canisrpa-lfa检测方法结果判定
7、e.canisrpa-lfa检测引物的特异性评价
8、e.canisrpa-lfa检测引物的敏感性评价
具体过程如下：
1、e.canis16srrna基因的合成及其重组质粒的构建。
根据下载的16srrna基因序列(1308bp)，进行16srrna全长基因的体外合成，并克隆至pmd-18t载体，获得重组质粒pt-16srrna。将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度。经测定，重组质粒pt-16srrna浓度为60ng/μl。
2、e.canis16srrna基因重组质粒拷贝数的确定。
根据下列公式，计算重组质粒pt-16srrna拷贝数：拷贝数(copies/μl＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)。提取重组质粒pt-16srrna的浓度为60ng/μl，重组质粒的碱基数为4001bp，经计算得知提取质粒的拷贝数为1.37×1010拷贝/μl。经系列倍比稀释，将pt-16srrna质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μl之间。
3、e.canisrpa引物的设计与合成。
对e.canis16srrna基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列，设计rpa引物，并将上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测rpa引物。设计的rpa引物扩增目的片段大小约为220bp。同时，合成常规pcr方法使用的特异性引物pcrfp1-rp1，pcr扩增产物大小为333bp。引物名称及序列见表1。
4、rpa反应体系的配制及操作程序。
配制rpa反应体系，包括rpafp和rparp、rehydrationbuffer、ddh2o、模板和mgac试剂。将所有试剂预混后，转入预添加exo冻干酶制剂的pcr反应管中，并充分混匀。将模板加入反应管中，并将mgac加在反应管盖中，混匀，盖紧后瞬时离心，放入38-42℃水浴锅中进行rpa反应。
5、rpa反应条件的优化。
5.1rpa最佳反应时间的确定。
为了确定rpa最佳反应时间，配制若干管rpa反应体系，以e.canis核酸为模板，分别进行不同时间的rpa扩增，根据产物量来确定rpa最佳反应时间。结果发现，在38-42℃下，e.canisrpa最佳反应时间确定为28-32min。
5.2rpa最佳反应温度的确定。
为了确定rpa最佳反应温度，配制若干管rpa反应体系，分别放入不同温度下的水浴箱内进行扩增反应，确定rpa最佳反应温度确定为38-42℃。
5.3rpa最佳引物的筛选。
为了筛选出rpa最佳引物，以e.canis核酸为模板，分别用若干对e.canisrpa引物进行rpa扩增，随后对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出rpa最佳引物，即上游引物的dna序列为<210>2，下游引物的dna序列为<210>3。
6、rpa-lfa可视化检测方法的建立。
6.1胶体金标记抗体的制备。
采用柠檬酸三钠还原法制备平均颗粒直径为30-50nm的胶体金溶液。吸取0.5-1.5ml胶体金溶液加入试管中，向其中加入4-6μg小鼠抗地高辛单克隆抗体igg，恒温缓慢振荡20-40min，在3-5℃下，12000-14000r/min离心30-50min，弃去上清液，沉淀溶解于0.05-0.2mol/l的tris-hcl缓冲溶液中(ph＝7.9-8.1)，即得到胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体igg，将制备好的溶液4℃密封保存，备用。
6.2rpa-lfa试纸条的制备方法。
在rpa-lfa检测前，先制备rpa-lfa试纸条。rpa-lfa试纸条从结构上分为5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、nc膜(硝酸纤维素膜)和pvc塑料垫，在nc膜上设置检测线(t线)和质控线(c线)。
首先，将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体igg用移液枪均匀滴加喷到一片nc膜上，放在真空干燥箱中36-38℃干燥8-12min，取出后作为结合垫(金标垫)。
其次，在设有检测线和质控线的nc膜上：检测线(t线)上包被经pbs(0.01-0.02mol/l，ph＝7.3-7.5)缓冲液稀释至1.5-2.5mg/ml的链霉亲和素(streptavidin)，质控线(c线)上包被1.5-2.5mg/ml的羊抗鼠igg，室温下干燥20-40min。
当然，上述的羊抗鼠igg也可采用其它的二抗进行替换，小鼠抗地高辛单克隆抗体，同样也可采用其它的抗地高辛单克隆抗体，也应当属于本发明的保护范围。
组装的顺序分别为：在pvc塑料垫的中间区域先贴上nc膜，结合垫贴在nc膜的前方区域，为保证良好的接触，结合垫压nc膜1.5-2.5mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1.5-2.5mm，最后将吸水垫贴在nc膜的后方，吸水垫压nc膜1.5-2.5mm。将试纸板切割为3-5mm的试纸条。将制备好的试纸条置于放有干燥剂的锡箱袋内，4℃保存备用。
6.3rpa-lfa检测操作步骤：
在rpa扩增结束后，用微量移液器取4-6μlrpa产物，稀释至70-100μl，滴加于rpa-lfa试纸条加样垫上，将加样完毕的装置放入35-39℃水浴箱内，孵育8-15min。取出rpa-lfa试纸条，用肉眼观察，若质控线(c线)和检测线(t线)均显色，则检测结果判为阳性(图3)；若仅质控线显色，则检测结果判为阴性；若质控线不显色，则检测结果判为无效。
7、e.canisrpa-lfa检测引物的特异性评价。
将犬埃立克体(e.canis)、查菲埃立克体(e.chaffeensis)、埃文氏埃立克体(e.ewingii)、犬血支原体(m.heamocanis)、大肠杆菌(e.coli)、犬布鲁氏菌(b.canis)等病原的核酸样品按照rpa反应操作步骤分别进行rpa扩增，然后将rpa扩增产物分别用制备的试纸条进行检测，每种病原核酸样品重复检测3次，分析rpa-lfa检测引物的特异性。检测结果证实，只有e.canis核酸样品rpa-lfa检测结果为阳性，其他病原核酸样品rpa-lfa检测结果均为阴性，表明rpa-lfa检测引物对其他病原的核酸模板没有出现非特异性扩增反应，证实本研究所发明e.canisrpa-lfa检测引物具有良好的特异性。
8、e.canisrpa-lfa检测引物的敏感性评价。
将重组质粒pt-16srrna进行10倍倍比稀释，使其浓度在1×108、1×107、1×106……～1×100拷贝/μl之间，并将不同稀释度的重组质粒作为模板，用fp3-rp3引物进行rpa反应，确定该方法的最低检测浓度。同时比较与常规pcr方法的敏感性。检测结果发现，用e.canisrpa-lfa引物最低可以检测到1×101拷贝/μl重组质粒dna，常规pcr检测方法最低也可以检测到1×101拷贝/μl重组质粒dna(图4)，表明rpa-lfa与常规pcr方法的敏感性相同，证实本研究所发明e.canisrpa-lfa检测引物具有良好的敏感性。
本发明与常规pcr方法相比，利用rpa-lfa可视化检测引物对e.canis核酸检测具有对仪器设备要求低(只需要一个恒温水浴锅)、检测速度快(约40min)、检测结果的可视化(可以直接用肉眼观察)等优点，这些优点使得本研究发明的rpa-lfa检测引物可以用于犬e.canis感染的快速检测和诊断。
附图说明
图1为e.canisrpa-lfa检测试纸条的组装示意图。
图2为rpa对e.canis核酸样品检测结果。
图中：1.以e.canis核酸样品(pt-16srrna)为模板的rpa阳性检测结果；2.以查菲埃立克体核酸为模板的rpa阴性检测结果；m:dnamarker(dl2000)。
图3为rpa-lfa对e.canis核酸样品检测结果
图中：1.以查菲埃立克体核酸为模板的rpa-lfa阴性检测结果；2，3.以e.canis核酸样品(pt-16srrna)为模板的rpa-lfa阳性检测结果。
图4为常规pcr方法对e.canis核酸样品的扩增结果。
图中：m：dnamarker(dl2000)；1-3：amplificationofe.canis16srrna基因(1：1×103拷贝/μl重组质粒pt-16srrna；2：1×102拷贝/μl重组质粒pt-16srrna；3：1×10:1拷贝/μl重组质粒pt-16srrna)。
图5为表1本发明实施例所用的e.canisrpa-lfa特异性引物。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步详述。
1、e.canis16srrna基因的合成及其重组质粒的构建。
根据genbank中登录的e.canis16srrna基因参考序列(登录号：u26740.1)，下载16srrna基因序列(1308bp)，进行16srrna全长基因的体外合成，并克隆至pmd-18t载体，获得重组质粒pt-16srrna。将pt-16srrna质粒转化至感受态细胞dh5α，通过pcr和测序对构建的重组质粒进行验证。结果pcr扩增可得到与预期大小一致的特异性条带；对扩增产物测序结果表明，该序列与e.canis16srrna基因(u26740.1)的同源性为100％。将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度。经测定，重组质粒pt-16srrna浓度为60ng/μl。
2、e.canis16srrna基因重组质粒拷贝数的确定。
根据下列公式，计算重组质粒pt-16srrna拷贝数：拷贝数(copies/μl＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)。提取重组质粒pt-16srrna的浓度为60ng/μl，重组质粒的碱基数为4001bp，经计算得知提取质粒的拷贝数为1.37×1010拷贝/μl。经系列倍比稀释，将pt-16srrna质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μl之间。
3、e.canisrpa引物的设计与合成。
下载genbank公布的27个e.canis不同流行株(belemec01株，kc109445.1；gxht67株,af156786.1；gdt3株,af156785.1；jake株，cp000107.1；611株，u26740.1；trkysecan3株，kj513197.1；trkysecan2分，kj513196.1；trkysecan1株，kj513194.1；171株，kc479023.1；twn株，gu810149.1；ecan_bkk_07株，eu263991.1；twn1株，eu106856.1；brazil-co1株，ef195134.1；vhe株，af373612.1；105株，kc479022.1；kagoshima株，af536827.1；brazil-co2株，ef195135.1；germishuys株，u54805.1；kutahya株，ay621071.1；oklahoma株，nr_118741.1；gr21株，ef011110.1；gr78株，ef011111.1；w-137j株，ab723710.1；w-134株，ab723708.1；d12e株，jn121379.1；cmm-19(2006)株，ab723712.1；e-60株，ab723709.1)的16srrna基因序列，通过blastn和dnaman软件对e.canis16srrna基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列。参考rpa引物设计的基本原则，使用primer5.0软件设计了3对特异性引物(表1)，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测rpa引物。设计的rpa引物扩增目的片段大小约为220bp。同时，合成常规pcr方法使用的特异性引物pcrfp1-rp1，pcr扩增产物大小为333bp。引物名称及序列见表1。
4、rpa反应体系的配制及操作程序。
配制50μlrpa反应体系，包括rpafp和rparp(浓度均为10μm)各2.5μl，rehydrationbuffer29.5μl，ddh2o12.0μl，模板1μl，280mmmgac2.5μl。将所有试剂预混后，转入预添加exo冻干酶制剂的0.2mlpcr反应管中，并充分混匀。将1μl模板加入反应管中，并将2.5μlmgac加在反应管盖中，混匀，盖紧后瞬时离心，放入40℃水浴锅中进行rpa反应。
5、rpa反应条件的优化。
5.1rpa最佳反应时间的确定。
为了确定rpa最佳反应时间，配制6管50μlrpa反应体系，以e.canis核酸为模板，分别进行15min、20min、25min、30min、35min、40min的rpa扩增，根据产物量来确定rpa最佳反应时间。结果发现，在40℃下rpa反应时间为20min时，即可扩增得到一条大小为220bp的特异性条带(图2)；当rpa反应30min时，得到的扩增产物量约为20min时条带的5倍，而反应40min时rpa产物量没有明显增加。因此e.canisrpa最佳反应时间确定为30min。
5.2rpa最佳反应温度的确定。
为了确定rpa最佳反应温度，配制5管50μlrpa反应体系，分别放入25℃、30℃、35℃、40℃和45℃水浴箱内进行扩增反应，15min后分别从各管中取10μl扩增液，根据产物量来确定rpa最佳反应温度。结果发现，在25～45℃的温度范围内rpa均可有效扩增，其中40℃时扩增效果最佳，rpa产物量最大，因此rpa最佳反应温度确定为40℃。
5.3rpa最佳引物的筛选。
为了筛选出rpa最佳引物，以e.canis核酸为模板，分别用3对e.canisrpa引物(rpafp1-rp1、rpafp2-rp2、rpafp3-rp3)进行rpa扩增，随后对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出rpa最佳引物。结果3对引物均能扩增出目的基因片段，其中rpafp3-rp3引物对的特异性、敏感性和产物量最高，因此rpafp3-rp3引物对确定为e.canisrpa最佳引物(表1)。
6、rpa-lfa可视化检测方法的建立。
6.1胶体金标记抗体的制备。
采用柠檬酸三钠还原法制备平均颗粒直径为40nm的胶体金溶液。吸取1ml胶体金溶液加入试管中，向其中加入5μg小鼠抗地高辛单克隆抗体igg，恒温缓慢振荡30min。4℃、13000r/min离心40min，弃去上清液，沉淀溶解于0.1mol/l的tris-hcl缓冲溶液中(ph＝8.0)，即得到胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体igg，将制备好的溶液4℃密封保存，备用。
6.2rpa-lfa试纸条的制备方法。
在rpa-lfa检测前，先制备rpa-lfa试纸条。rpa-lfa试纸条从结构上分为5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、nc膜(硝酸纤维素膜)，nc膜上设置检测线(t线)、质控线(c线)和pvc塑料垫(图1)。
首先，取一片nc膜，将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体igg用移液枪均匀滴加喷到nc膜上，放在真空干燥箱中37℃干燥10min，取出后作为结合垫(金标垫)。
其次，在设有检测线和质控线的nc膜上：检测线(t线)上包被经pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)缓冲液稀释至2mg/ml的链霉亲和素(streptavidin)，质控线(c线)上包被2mg/ml的羊抗鼠igg，室温下干燥30min。
当然，上述的羊抗鼠igg也可采用其它的二抗进行替换，小鼠抗地高辛单克隆抗体，同样也可采用其它的抗地高辛单克隆抗体。
组装的顺序分别为：在pvc塑料垫的中间区域先贴上nc膜，结合垫贴在nc膜的前方区域，为保证良好的接触，结合垫压nc膜2mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫2mm，最后将吸水垫贴在nc膜的后方，吸水垫压nc膜2mm。将试纸板切切割为4mm的试纸条。将制备好的试纸条置于放有干燥剂的锡箱袋内，4℃保存备用。
6.3rpa-lfa检测方法操作步骤及结果判定。
在rpa扩增结束后，用微量移液器取5μlrpa产物，稀释至80μl，滴加于rpa-lfa试纸条加样垫上，将加样完毕的装置放入37℃水浴箱内，孵育10min。取出rpa-lfa试纸条，用肉眼观察，若质控线(c线)和检测线(t线)均显色，则检测结果判为阳性(图3)；若仅质控线显色，则检测结果判为阴性；若质控线不显色，则检测结果判为无效。
7、e.canisrpa-lfa检测引物的特异性评价。
将犬埃立克体(e.canis)、查菲埃立克体(e.chaffeensis)、埃文氏埃立克体(e.ewingii)、犬血支原体(m.heamocanis)、大肠杆菌(e.coli)、犬布鲁氏菌(b.canis)等病原的核酸样品按照rpa反应操作步骤分别进行rpa扩增，然后将rpa扩增产物分别用制备的试纸条进行检测，每种病原核酸样品重复检测3次，分析rpa-lfa检测引物的特异性。检测结果证实，只有e.canis核酸样品rpa-lfa检测结果为阳性，其他病原核酸样品rpa-lfa检测结果均为阴性，表明rpa-lfa检测引物对其他病原的核酸模板没有出现非特异性扩增反应，证实本研究所发明e.canisrpa-lfa检测引物具有良好的特异性。
8、e.canisrpa-lfa检测引物的敏感性评价。
将重组质粒pt-16srrna进行10倍倍比稀释，使其浓度在1×108、1×107、1×106……～1×100拷贝/μl之间，并将不同稀释度的重组质粒作为模板，用fp3-rp3引物进行rpa反应，确定该方法的最低检测浓度。同时比较与常规pcr方法的敏感性。检测结果发现，用e.canisrpa-lfa引物最低可以检测到1×101拷贝/μl重组质粒dna，常规pcr检测方法最低也可以检测到1×101拷贝/μl重组质粒dna(图4)，表明rpa-lfa与常规pcr方法的敏感性相同，证实本研究所发明e.canisrpa-lfa检测引物具有良好的敏感性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，如实施例中所使用的抗体及具体操作中所涉及的参数值等，也应视为本发明的保护范围。
<110>石河子大学
<120>快速检测犬埃立克体感染的引物及检测试剂和试剂盒
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<160>3
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<212>dna
<213>犬埃立克体（ehrlichiacanis）
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<221>misc_feature
<223>16srrna基因
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<212>dna
<213>犬埃立克体（ehrlichiacanis）
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<223>rpafp3引物
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