本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用rapd分子标记技术快速区分丝瓜品种的方法。
背景技术：
丝瓜为起源于中国的一种世界性蔬菜，其栽培历史悠久，品种资源及其丰富，2006年以来全国年播种面积超过1200千公顷，位于所有蔬菜作物的前3位，在蔬菜生产与供应中占有重要地位。近些年来，随着我国丝瓜产量及栽培面积的大幅度扩展，越来越多的优良品种应用于丝瓜生产中。因此，建立丝瓜品种快速可靠的鉴定技术体系对于丝瓜品种遗传资源的研究保护、苗期鉴定、品种区分乃至丝瓜产业的持续发展等具有重要的意义。
dna分子标记是随着分子克隆和重组dna等生物技术迅速发展而产生的一类遗传标记，由于其直接建立在分子水平上，而不受外界环境、作物发育阶段、取样部位等因素影响，其检出的多态性位点是无限的，故鉴定结果具有高度的可靠性，且重复性高，鉴别力强。
由于目前传统单一的形态学品种鉴定方法已无法满足有效鉴别或区分当今日益增多的品种的要求。分子标记的应用给作物遗传育种研究带来了巨大变化，同时也应用到了品种鉴定的研究中。在常用的rapd、issr、srap和aflp等众多分子标记技术中，随机扩增多态性dna(randomamplifiedpolymorphicdna,rapd)基于pcr技术，是应用较早的分子标记技术之一，它以分析程序简便快捷，周期性短，不易受外界环境影响，所需费用低，且无需对基因组序列进行预知等优点，已被普遍应用于指纹图谱构建、种质资源的遗传基础研究、基因的快速定位、基因连锁标记、遗传多样性分析，品种分类研究等方面。
现有的利用rapd技术在进行蔬菜作物品种区分与种质鉴定的研究工作中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱并结合统计学软件聚类分析得出聚类树，但是此聚类分析结果不但无法直观显示出区分品种的引物，无法显示鉴别过程，其操作量大，缺乏实用性。
技术实现要素：
本发明需要解决的技术问题是：提供一种利用rapd技术区分丝瓜品种的引物。
本发明还要解决的技术问题是：提供利用上述引物区分丝瓜品种的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于区分丝瓜品种的rapd引物，包括如下引物：
rp487：5’-agtcagccacg-3’；
rp559：5’-tctgtgctgga-3’；
rp1012：5’-ggcactgaggc-3’；
rp1046：5’-gtcggaggtgg-3’。
上述用于区分丝瓜品种的rapd引物在区分丝瓜品种中的应用在本发明的保护范围之内。
其中，所述的丝瓜品种包括：长香玉，绿领2号，蛇形丝瓜，绿王子，绿油1号，五叶香，香妃206，改良长沙肉丝瓜，香长丝瓜，方震ab321，长香丝瓜，绿帅，赛佳丽，碧玉，中绿，春香白丝瓜，湘优一号，香玉白，铁八棱，早玉2号。
利用上述区分丝瓜品种的rapd引物区分丝瓜品种的具体方法如下，包括如下步骤：
(1)提取丝瓜叶片基因组dna；
(2)利用rp487引物对步骤(1)得到的基因组dna进行rapd扩增，得到的pcr产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在1000bp、100bp处都出现特征性谱带，而在2000bp无特征性谱带，丝瓜的品种为“五叶香”；若在1000bp、500bp、100bp处都出现特征性谱带，丝瓜品种为“长香玉”；若在2000bp处出现特征性谱带，而在1000bp、100bp处都未出现特征谱带，则丝瓜品种为“湘优一号”；
(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用rp559引物再对基因组dna进行rapd扩增，
若利用rp487引物扩增时，在1000bp处出现特征性谱带，而在2000bp、100bp处都未出现特征性谱带，rp559引物扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：若利用rp559引物扩增时，在1000bp、500bp、200bp处都出现特征性谱带，其品种为“赛佳丽”；在200bp处出现特征性谱带，而在1000bp、500bp处都未出现特征性谱带，其品种为“绿王子”；若在1000bp、200bp都出现特征谱带而在500bp未出现特征性谱带的，其品种为“绿油1号”；若在1000bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp都未出现特征谱带，则进入步骤(4)；若在1000bp、400bp均出现特征性谱带，则进入步骤(5)；
若利用rp487引物扩增时，在100bp处出现特征性谱带，而在2000bp、1000bp处都未出现特征性谱带，利用引物rp559扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：经琼脂糖凝胶电泳检测在2000bp、500bp处均出现特征性谱带，其品种为“春香白丝瓜”；若在2000bp、1000bp都出现特征性谱带，而500bp处未出现特征性谱带，其品种为“香玉白”；若在1000bp、500bp出现特征性谱带，而2000bp处未出现特征性谱带，其品种为“蛇形丝瓜”；若在1000bp出现特征性谱带，而2000、500bp都未出现特征性谱带，则进入步骤(6)；
(4)利用rp559引物进行rapd扩增，若在1000bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp都未出现特征谱带，rp1012引物扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在2000bp、500bp处都出现特征性谱带，其品种为“香妃206”；若在2000bp、750bp处都出现特征性谱带的，其品种为“香长丝瓜”；若在750bp均出现特征性谱带的，则进入步骤(7)；
(5)利用rp559引物进行rapd扩增，若在1000bp、400bp处都出现特征性谱带，rp1012引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp与250bp处均出现特征性谱带的，其品种为“绿领2号”；若在1000bp处未出现特征谱带，而在250bp处出现特征性谱带，则进入步骤(8)；
(6)利用rp559引物进行rapd扩增，若在1000bp出现特征性谱带，而2000bp、500bp都未出现特征性谱带，再用rp1012引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp、500bp、250bp处都出现特征性谱带的，其品种为“绿帅”；在1000bp、500bp处都出现特征性谱带，而在250bp未出现特征性谱带的，其品种为“铁八棱”；若在1000bp出现特征性谱带，500bp、250bp都未出现特征性谱带，则进入步骤(9)；
(7)利用rp1012引物进行rapd扩增，若在750bp出现特征谱带，rp1046引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在800bp和500bp都出现特征性谱带的，其品种为“方震ab321”；若在800bp处出现特征性谱带，而在500bp未出现特征性谱带，其品种为“中绿”；
(8)利用rp1012引物进行rapd扩增，若在1000bp处未出现特征谱带，而在250bp处出现特征性谱带，rp1046引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp、400bp均出现特征性谱带的为品种“改良长沙肉丝瓜”；若在1000bp处出现特征谱带、400bp处未出现特征谱带的为品种“碧玉”；
(9)利用rp1012引物进行rapd扩增，若在1000bp处出现特征谱带，而在500bp、250bp处未出现特征性谱带，rp1046引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp出现特征性谱带的为品种“长香丝瓜”；若在1000bp未出现特征谱带的为品种“早玉2号”。
步骤(1)中，提取丝瓜叶片基因组dna的方法如下：
取丝瓜幼嫩叶片0.2g，经液氮研磨，加入500μlctab裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇，在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状dna用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后将絮状dna溶于te缓冲液中保存；
其中，所述的ctab裂解液的组成如下：体积分数为2％ctab，2mol/lnacl2,，20mmol/ledta，100mmol/ltris-hcl，ph＝8.0，体积分数为0.2％β-巯基乙醇；所述的氯仿/异戊醇混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
步骤(2)～(5)中，所述的rapd扩增，其pcr反应体系为20μl，其中含基因组dna50ng，mgcl22.0mmol/l，dntps0.15mmol/l，引物0.44μmol/l，taqdna聚合酶0.75u。
步骤(2)～(5)中，所述的rapd扩增，其pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，退火45s，72℃延伸90s，42个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；
其中，rp487引物的退火温度为43.1℃，rp559的退火温度为42.7℃，rp1012的退火温度为40.4℃，rp1046的退火温度为42.2℃。
在pcr扩增仪上进行扩增，扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。
本发明通过4个引物就能区分出20个不同丝瓜品种，为了清晰、完整地表示鉴别采用的引物和鉴别出的品种，同时为了方便他人对丝瓜品种进行区分、鉴定，本发明还人工绘制了“树型植物品种鉴定图”。通过树形图表示各个品种区分的过程及相应品种，通过标记引物名称和谱带的有无表示品种的鉴定方法和判断依据。本发明与现有技术不同的是未采用“0-1”矩阵构建指纹图谱并进行聚类分析，通过对比谱带进行筛选，建立直观的鉴定图谱。
有益效果：本发明的一种利用rapd技术快速区分丝瓜品种的方法，本发明方法操作简便，快速准确，9次pcr就能够将20个丝瓜品种在分子水平上区分开，所得的品种鉴定图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现丝瓜种苗的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。
附图说明
图1是利用4个引物对20个丝瓜品种进行区分鉴定的树型鉴别图；
图2是利用引物rp487在20个丝瓜品种上的rapd扩增图，数字与图11对应，m表示dnamarker；
图3是利用引物rp559对未区分的10个品种的dna进行rapd扩增得到的扩增图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图4是利用引物rp559对未区分的7个品种的dna进行rapd扩增得到的扩增图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图5是利用引物rp1012对7、9、10、15四个品种的dna进行rapd扩增得到的扩增图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图6是利用引物rp1012对2、8、14三个品种的dna进行rapd扩增得到的扩增图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图7是利用引物rp1012对11、12、19、20四个品种的dna进行rapd扩增得到的扩增图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图8是利用引物rp1046验证区分10、15两个品种的扩增产物电泳图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图9是利用引物rp1046验证区分8、14两个品种的扩增产物电泳图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图10是利用引物rp1046验证区分11、20两个品种的扩增产物电泳图，横列是特征谱带，纵列的数字与图11对应，m表示dnamarker；
图11是本发明20个丝瓜品种的编号和品种名称；
图12是利用4个引物对20个丝瓜品种进行区分鉴定的树型鉴别图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：dna的提取。
本发明的丝瓜品种样品均是市面常见的重要丝瓜品种，这20个品种包括：长香玉，绿领2号，蛇形丝瓜，绿王子，绿油1号，五叶香，香妃206，改良长沙肉丝瓜，香长丝瓜，方震ab321，长香丝瓜，绿帅，赛佳丽，碧玉，中绿，春香白丝瓜，湘优一号，香玉白，铁八棱，早玉2号。
以丝瓜幼嫩叶片为材料约0.2g，经液氮研磨，加入500μlctab裂解液(2％ctab,2mnacl2,20mmedta，100mmtris-hcl(ph＝8.0)与0.2％的β-巯基乙醇)，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却,加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)混合物后轻轻摇晃，将乳状物离心12000r/min，8～10min，上清液用氯仿/异戊醇(24：1)抽提1～2次,加入预冷异丙醇4℃冰箱静置3小时以上，收集絮状dna用70％乙醇洗涤，干燥后溶于te缓冲液中保存备用。为了方便在扩增图谱中标记出来，对每个丝瓜品种进行了编号，参考说明书附图中的图11。
实施例2：rapd-pcr反应体系与条件。
rapd-pcr反应体系为20μl，含50ng基因组dna，2.0mmol·l-1mgcl2，0.15mmol·l-1dntps，0.44μmol·l-110mer引物，0.75utaqdna聚合酶。
rapd-pcr扩增程序为94℃预变性2min，94℃变性30s，退火45s，72℃延伸90s，42个循环，72℃延伸10min，后于4℃保存。在pcr扩增仪上进行扩增，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳(含有1.2％溴化乙锭)，1×tae电泳缓冲液(1l中含有：0.242gtris,0.057ml冰醋酸，0.2ml0.25mol/ledtaph8.0)。扩增后的dna样品加入4μl6×上样缓冲液(含0.25％溴酚蓝、30％蔗糖)，在120v恒压下进行电泳0.5～0.8小时，使扩增的dna条带清晰明显分离为止，后紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。
实施例3：特异引物的严格筛选。
本发明的4个引物是在原先设计的52个随机引物经过严格筛选而得。先针对现有的丝瓜品种的基因组设计52个随机引物，从中选取出11个碱基的多态性好、扩增性强、稳定性高的rapd随机引物，后通过连续两次梯度pcr选择条带一致的温度作为退火温度。详细的说，梯度pcr反应体系为20μl，含50ng基因组dna，2.0mmol·l-1mgcl2，0.15mmol·l-1dntps，0.44μmol·l-110mer引物，0.75utaqdna聚合酶。反应于94℃预变性2min，94℃变性30s，退火45s，72℃延伸90s，42个循环，72℃延伸10min。本发明所述随机引物序列和退火温度如下：
rp487：5’-agtcagccacg-3’,退火温度43.1℃；
rp559：5’-tctgtgctgga-3’,退火温度42.7℃；
rp1012：5’-ggcactgaggc-3’,退火温度40.4℃；
rp1046：5’-gtcggaggtgg-3’,退火温度42.2℃。
实施例4：丝瓜品种的快速区分。
选用dna多态性谱带在不同品种中的有无将丝瓜品种进行区分，直到所有待鉴别的品种被单独分开为止。
通过“树型鉴别图”以更好的方便品种鉴定、统计工作。“树型鉴别图”是基于pcr扩增后的谱带形态统计出的结果，树型鉴别图以引物作为节点，节点后是该引物对不同品种的区分结果，包括区分出的类别或者直接区分出来的品种，在节点后的分支还标记了不同结果相互区分的依据，即谱带之间的区别。利用rp487、rp559、rp1012、rp1046四个引物对20个不同丝瓜品种进行rapd扩增，即可绘制出完整的树型鉴别图(如图1所示)，具体区分步骤如下：
(1)提取丝瓜叶片基因组dna；
(2)利用rp487引物对步骤(1)得到的基因组dna进行rapd扩增，得到的pcr产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在1000bp、100bp处都出现特征性谱带，而在2000bp无特征性谱带，丝瓜的品种为“五叶香”；若在1000bp、500bp、100bp处都出现特征性谱带，丝瓜品种为“长香玉”；若在2000bp处出现特征性谱带，而在1000bp、100bp处未出现特征谱带，则丝瓜品种为“湘优一号”，见图2；
(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用rp559引物再对基因组dna进行rapd扩增，
若利用rp487引物扩增时，在1000bp处出现特征性谱带，而在2000bp、100bp处未出现特征性谱带，rp559引物扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：若利用rp559引物扩增时，在1000bp、500bp、200bp处都出现特征性谱带，其品种为“赛佳丽”；在200bp处出现特征性谱带，而在1000bp、500bp处未出现特征性谱带，其品种为“绿王子”；若在1000bp、200bp出现特征谱带而在500bp未出现特征性谱带的，其品种为“绿油1号”；若在1000bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp未出现特征谱带，则进入步骤(4)；若在1000bp、400bp均出现特征性谱带，则进入步骤(5)，见图3；
若利用rp487引物扩增时，若在100bp处出现特征性谱带，而在2000bp、1000bp处未出现特征性谱带，利用引物rp559扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：经琼脂糖凝胶电泳检测在2000bp、500bp均出现特征性谱带，其品种为“春香白丝瓜”；若在2000bp、1000bp出现特征性谱带，而500bp未出现特征性谱带，其品种为“香玉白”；若在1000bp、500bp出现特征性谱带，而2000bp未出现特征性谱带，其品种为“蛇形丝瓜”；若在1000bp出现特征性谱带，而2000、500bp未出现特征性谱带，则进入步骤(6)，见图4；
(4)利用rp559引物进行rapd扩增，若在1000bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp未出现特征谱带，rp1012引物扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在2000bp、500bp出现特征性谱带的，其品种为“香妃206”；若在2000bp、750bp出现特征性谱带的，其品种为“香长丝瓜”；若在750bp均出现特征性谱带的，则进入步骤(7)，见图5；
(5)利用rp559引物进行rapd扩增，若在1000bp、400bp均出现特征性谱带，rp1012引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp与250bp处均出现特征性谱带的，其品种为“绿领2号”；若在1000bp处未出现特征谱带，而在250bp处出现特征性谱带，则进入步骤(8)，见图6；
(6)利用rp559引物进行rapd扩增，若在1000bp出现特征性谱带，而2000bp、500bp未出现特征性谱带，再用rp1012引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp、500bp、250bp出现特征性谱带的，其品种为“绿帅”；在1000bp、500bp出现特征性谱带，而在250bp未出现特征性谱带的，其品种为“铁八棱”；若在1000bp出现特征性谱带，500bp、250bp未出现特征性谱带，则进入步骤(9)，见图7；
(7)利用rp1012引物进行rapd扩增，若在750bp出现特征谱带，rp1046引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在800bp和500bp均出现特征性谱带的，其品种为“方震ab321”；在500bp未出现特征性谱带，其品种为“中绿”，见图8；
(8)利用rp1012引物进行rapd扩增，若在1000bp处未出现特征谱带，而在250bp处出现特征性谱带，rp1046引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp、400bp均出现特征性谱带的为品种“改良长沙肉丝瓜”；若在1000bp出现特征谱带、400bp未出现特征谱带的为品种“碧玉”，见图9；
(9)利用rp1012引物进行rapd扩增，若在1000bp处出现特征谱带，而在500bp、250bp处未出现特征性谱带，rp1046引物进行rapd扩增后使用如下方法判断丝瓜品种：
若在1000bp出现特征性谱带的为品种“长香丝瓜”；若在1000bp未出现特征谱带的为品种“早玉2号”，见图10。
综上所述，但凡涉及上述20个品种中任意品种或者其组合的丝瓜品种，按照上述步骤即可完成品种鉴别和区分。
利用本发明的方法统计出的“树型鉴别图”不仅可完成对未知品种的鉴定，还可查询出鉴定不同品种所需要的引物和鉴别依据。下面请参考图1，可以看出，当需要查询任意丝瓜品种的鉴别方法和所需引物时，只需要在树型鉴别图分支末端找到对应品种编号，向前回溯即可。例如，需要查询区分品种‘绿帅’‘赛佳丽’，根据本发明的方法，通过引物rp1012即可将在250bp有特征性谱带的‘绿帅’区分出来，而利用引物rp559进行扩增，在500bp出现特征性谱带的为品种‘赛佳丽’。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一种用于区分丝瓜品种的rapd引物及其应用
<130>sg20170921
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>11
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agtcagccacg11
<210>2
<211>11
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<210>3
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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