本发明涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体涉及一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒。
背景技术：
猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)是一种新出现的猪冠状病毒，属于尼多病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)，为单股正链有囊膜的rna病毒，于2012年首次在香港的猪群中发现。随后在美国、加拿大、韩国也有报道检测出该病毒。我国大陆地区于2014年首次报道检测出该病毒。牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，bvdv)，于1946年在美国首次报道。我国于1980年首次报道并且分离到病毒。bvdv除了感染牛以外，还可以感染猪、羊、牦牛、骆驼等野生动物。bvdv属于黄病毒科(flaviviridae)、瘟病毒属(genuspestivirus)，为单股正链有囊膜的rna病毒。由于pdcov和bvdv感染猪以后的临床表现、病理变化等非常相似，给临床诊断造成了一定困难。因此建立一种能够快速区分pdcov和bvdv的多重pcr诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分pdcov和bvdv，且灵敏度高、特异性强。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重pcr检测引物组，所述引物组包括4条特异性引物，具体为：
l1：5ˊ-atctccctagcttcgctagttctcta-3ˊ
l2：5ˊ-atagcgtcgcgcttggacttgttc-3ˊ
l3：5ˊ-ggtgtggaggaacctgtttatgatcag-3ˊ
l4：5ˊ-cctttactattacccgacctgcagtcacctc-3ˊ。
一种多重pcr检测在制备快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒试剂盒中的应用。
一种含有多重pcr检测引物组的快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。
试剂盒还包括病毒rna的提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。
反转录试剂包括5×m-mlv缓冲液、dntp、m-mlv反转录酶、rnase酶抑制剂、l2、l4引物。
反转录试剂所构建的反转录体系为：5×m-mlv缓冲液2.0μl、2.5mmol/ldntp2.0μl、200u/μlm-mlv反转录酶0.5μl、40u/μlrnase酶抑制剂0.3μl、10mmol/ll2、l4引物0.3μl、rna模板4.9μl。
pcr扩增试剂包括10×pcr扩增缓冲液、dntp、l1引物、l2引物、l3引物、l4引物、taqdna聚合酶和双蒸水。
pcr扩增试剂所构建的pcr扩增体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、2.5mmol/ldntp8.0μl、10mmol/ll1、l2、l3、l4引物各1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。
试剂盒的使用方法，包括病毒rna的提取、反转录、pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。
对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析：当扩增片段为185bp，则样本为猪源牛病毒性腹泻病毒；当扩增片段大小为525bp，则样本为猪德尔塔冠状病毒。
本发明有益效果：
本发明根据genbank中收录的pdcov和bvdv序列，通过比对pdcov和bvdv之间的差异，自行设计特异性引物l1、l2、l3和l4，该引物组能够对pdcov和bvdv进行特异性扩增，其中，使用l1和l2引物可以扩增pdcov，使用l3和l4引物可扩增bvdv。发明人在此基础上成功研制了专用试剂盒，先提取病毒rna，并采用rt-pcr方法鉴别检测pdcov和bvdv，pdcov预期扩增片段大小为525bp，bvdv预期扩增片段大小为185bp。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，对pdcov和bvdv的最低检测量分别为1.0×103拷贝/μl和1.2×104拷贝/μl；特异性强，对猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒的扩增结果均为阴性；重复性好，对同一样品进行3次检测，每次间隔一个月，都能获得同样的结果；且与其它方法相比符合率可达95％以上，能够广泛用于临床pdcov和bvdv的检测。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为pdcovpcr反应体系的引物优化结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-4分别为引物添加量0、0.2、0.5、1.0μl。
图2为bvdvpcr反应体系的引物优化结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-5分别为引物添加量0、0.2、0.5、0.8、1.0μl。
图3为pdcovpcr反应体系的退火温度优化结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-7分别为退火温度53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
图4为bvdvpcr反应体系的退火温度优化结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-6分别为退火温度53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃。
图5为pdcovpcr反应体系的循环数优化结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-4分别为32、33、34、35个循环。
图6为bvdvpcr反应体系的循环数优化结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-5分别为30、31、32、33、34个循环。
图7为l5、l6引物对pdcov的扩增结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-10分别为退火温度51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃。
图8为l7、l8引物对pdcov的扩增结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-9分别为退火温度51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
图9为l9、l10引物对bvdv的扩增结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-8分别为退火温度51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃。
图10为l11、l12引物对bvdv的扩增结果。图中，m：dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-9分别为退火温度51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
图11为pdcov和bvdvpcr扩增结果。图中，m为dl2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1为pdcov，泳道2为bvdv。
图12为本发明对pdcov和bvdvpcr特异性实验结果。图中，m为dl2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1为pdcov，泳道2为bvdv，泳道3-9分别为猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒。
图13为试剂盒对pdcov最低检出浓度和灵敏度检测结果。图中，m为dl2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-6为拷贝数1.0×107拷贝/μl、1.0×106拷贝/μl、1.0×105拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl、1.0×103拷贝/μl、1.0×102拷贝/μl。
图14为试剂盒对bvdv最低检出浓度和灵敏度检测结果。图中，m为dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-5分别为模板浓度1.2×107拷贝/μl、1.2×106拷贝/μl、1.2×105拷贝/μl、1.2×104拷贝/μl、1.2×103拷贝/μl。
图15为临床样本的pcr检测结果。图中，m为dl2000marker(条带从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道1-5为pdcov阳性，泳道6-9为bvdv阳性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
1、引物设计
根据genbank中收录的pdcov和bvdv序列，通过比对pdcov和bvdv之间的差异，自行设计特异性引物l1、l2、l3和l4，具体如下：
l1：5ˊ-atctccctagcttcgctagttctcta-3ˊ(seqidno.1)
l2：5ˊ-atagcgtcgcgcttggacttgttc-3ˊ(seqidno.2)
l3：5ˊ-ggtgtggaggaacctgtttatgatcag-3ˊ(seqidno.3)
l4：5ˊ-cctttactattacccgacctgcagtcacctc-3ˊ(seqidno.4)
使用引物l1、l2、l3和l4进行pcr扩增，pdcov预期扩增片段大小为525bp，bvdv预期扩增片段大小为185bp。
2、病毒rna的提取
(1)取pdcov和bvdv的猪小肠组织约3cm，反复冻融3次后，用高压过的剪刀剪碎，加入3ml高压处理的pbs，在研钵中充分研磨，将混合物13000g离心2min，取上清备用；
(2)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12,000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为有机相，一个中间层，上层是无色的水相，rna存在于水相中；
(3)将(2)中的上层水相转移到另一只干净的ep管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12，000g，4℃离心10min；
(4)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤rna沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；
(5)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无rnase水溶解rna，即得到总rna。
3、反转录
以步骤2提取的rna为模板，进行反转录，获得cdna，反转录反应体系为：5×m-mlv缓冲液2.0μl、dntp(2.5mmol/leach)2.0μl、200u/μlm-mlv反转录酶0.5μl、40u/μlrnase酶抑制剂0.3μl、l2、l4引物(10mmol/leach)0.3μl、rna模板4.9μl。
反应条件为：42℃1h，70℃10min。
4、聚合酶链式反应(pcr)
4.1引物浓度的优化
以pdcov的cdna为模板，对pcr反应体系的引物工作浓度进行优化，将浓度为10mmol/l的l1引物和l2引物的添加量分别设定为0、0.2、0.5、1.0μl，具体的反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、dntp(2.5mmol/leach)8.0μl、10mmol/ll1和l2引物、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。扩增结果见图1，结果发现在0.5μl和1.0μl出现预期525bp大小的片段，且1.0μl亮度更强。
以bvdv的cdna为模板，对pcr反应体系的引物工作浓度进行优化，将浓度为10mmol/l的l3引物和l4引物的添加量分别设定为0、0.2、0.5、0.8、1.0μl，具体的反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、dntp(2.5mmol/leach)8.0μl、10mmol/ll3和l4引物、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。扩增结果见图2，结果发现在0.5μl、0.8μl和1.0μl出现预期185bp大小的片段，且1.0μl亮度更强。
综合上述反应，本发明最终将复合pcr的引物设定为10mmol/l，1.0μl。
4.2pcr退火温度的优化
以pdcov的cdna为模板，对pcr反应程序的退火温度进行优化，将退火温度设定为53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃，具体的反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、dntp(2.5mmol/leach)8.0μl、10mmol/ll1和l2引物各1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。扩增结果见图3，结果发现在55℃、56℃出现预期525bp大小的片段。
以bvdv的cdna为模板，对pcr反应程序的退火温度进行优化，将退火温度设定为53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃，具体的反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、dntp(2.5mmol/leach)8.0μl、10mmol/ll3和l4引物各1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。扩增结果见图4，结果发现在56℃出现预期185bp大小的片段。
综合上述反应，本发明最终将复合pcr的退火温度设定为56℃。
4.3pcr循环数的优化
以pdcov的cdna为模板，对pcr反应程序的循环数进行优化，将循环数设定为32、33、34、35个循环，具体的反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、dntp(2.5mmol/leach)8.0μl、10mmol/ll1和l2引物各1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。扩增结果见图5，结果发现在33个循环出现预期525bp大小的片段，34和35个循环也有目的条带出现，且亮度更强。
以bvdv的cdna为模板，对pcr反应程序的循环数进行优化，将循环数设定为30、31、32、33、34个循环，具体的反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、dntp(2.5mmol/leach)8.0μl、10mmol/ll3和l4引物各1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。扩增结果见图6，结果发现在33个循环开始出现预期185bp大小的片段，随着循环数增加，亮度增强。
综合上述反应，本发明最终将复合pcr的循环数设定为35个。
4.4pcr反应体系和反应程序的确定
本发明的pcr反应体系和反应程序最终确定为：
pcr反应体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、2.5mmol/ldntp8.0μl、10mmol/ll1、l2、l3、l4引物各1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、cdna模板3.0μl，补加双蒸水至50.0μl。
pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。
5、电泳
对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100v，电泳40min，在dna凝胶成像系统仪下观察结果。
本发明的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的病毒rna提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。
实施例2引物的优化
pdcov引物优化：
根据genbank中收录的pdcov和bvdv序列，通过比对pdcov和bvdv之间的差异，自行设计pdcov的特异性引物l5、l6，具体如下：
l5：5’-atcagctgctacctctc-3’(seqidno.5)
l6：5’-tggctcataggtctggtta-3’(seqidno.6)
使用引物l5、l6在51-60℃的退火温度下进行pcr扩增，pdcov预期扩增片段大小为516bp，结果见图7。图7可以看出，在退火温度为52℃时出现目的条带，与bvdv的退火温度不一致，无法实现在同一个pcr反应程序的扩增，因此无法完成两种病毒的同时检测。
另外，本发明还设计特异性引物l7、l8对pdcov进行pcr扩增，具体序列如下：
l7：5’-caggtgctcaaagctcaa-3’(seqidno.7)
l8：5’-tccttaagtctctcatagt-3’(seqidno.8)
结果见图8。图8可以看出，在51-59℃的退火温度下进行pcr扩增，结果无目的条带扩增。
bvdv引物优化：
根据genbank中收录的pdcov和bvdv序列，通过比对pdcov和bvdv之间的差异，自行设计bvdv的特异性引物l9、l10，具体如下：
l9：5’-tccaccctcaatcgacg-3’(seqidno.9)
l10：5’-gtggtcctggcttcaggtagat-3’(seqidno.10)
使用引物l9、l10在51-58℃的退火温度下进行pcr扩增，bvdv预期扩增片段大小为146bp，结果见图9。图9可以看出，在退火温度为51℃时出现目的条带，与pdcov的退火温度不一致，无法实现在同一个pcr反应程序的扩增，因此无法完成两种病毒的同时检测。
另外，本发明还设计特异性引物l11、l12对bvdv进行pcr扩增，具体序列如下：
l11：5’-ctaaagctcccacacaaga-3’(seqidno.11)
l12：5’-ttagttgtctcacacataaacccctcctc-3’(seqidno.12)
预期目的条带为214bp，结果见图10。图10可以看出，在51-59℃的退火温度下进行pcr扩增，结果无目的条带扩增。
实施例3扩增结果
分别以pdcov和bvdv为样本，按照实施例1中的方法进行检测，电泳结果表明，bvdv扩增片段大小为185bp，pdcov扩增片段大小为525bp(图11)，与预期相符。
实施例4特异性
分别以猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒为对照毒株，pdcov和bvdv为实验毒株，按照实施例1中的方法进行检测(图12)，结果表明，只有pdcov和bvdv可以分别得到525bp和185bp片段，其它病毒均无扩增条带产生。实验结果证实，本发明的引物和检测方法具有很高的特异性。
实施例5重复性
对同一样品进行3次检测，每次间隔一个月，都能获得同样的结果。说明本发明的方法具有很好的重复性。
实施例6灵敏度
将pdcov的cdna进行10倍梯度稀释，使模板浓度为1.0×107拷贝/μl、1.0×106拷贝/μl、1.0×105拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl、1.0×103拷贝/μl，1.0×102拷贝/μl，并按照实施例1的方法进行检测，结果见图13。结果表明，在第1-5泳道可以发现目的条带，即本发明对pdcov的最低检出浓度为1.0×103拷贝/μl，在第6泳道无目的条带，判断其灵敏度为1.0×103拷贝/μl。
将bvdv的cdna进行10倍梯度稀释，使模板浓度为1.2×107拷贝/μl、1.2×106拷贝/μl、1.2×105拷贝/μl、1.2×104拷贝/μl、1.2×103拷贝/μl，并按照实施例1的方法进行检测，结果见图14。结果表明，在第1-4泳道可以发现目的条带，本发明对bvdv的最低检出浓度为1.2×104拷贝/μl，在第5泳道无目的条带，判断其灵敏度为1.2×104拷贝/μl。
实施例7
对确认感染pdcov和bvdv的病猪临床样本进行采集，利用本发明的试剂盒和方法对其进行检测，电泳结果与确诊结果一致，结果见图15。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>河南省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
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