本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片及其应用。
背景技术：
近年来，猪传染性腹泻疾病的发生与流行日益严重，给广大养殖户造成了难以估量的经济损失。目前在我国猪传染性腹泻疾病的病毒原主要是猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)、猪a群轮状病毒(grouparotavirus，gar)。这三类病毒所引起的疫病发生后外观特征基本相似，均表现为呕吐、水样喷射腹泻和脱水等，特别是哺乳仔猪发病严重且死亡率高。猪δ冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，pdcov)于2012年首次在香港被报道出有猪场发现该病毒，随后于2014年在美国俄亥俄州和伊利诺伊州报道出有猪场发现该种病毒，此后至少有19个州都有该种病毒的报道。pdcov主要感染整段小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎病伴随有小猪的腹泻和呕吐。由于腹泻病毒常常出现混合感染的情况，且临床鉴别诊断较困难，开展四种猪腹泻病毒的同步鉴别诊断对防控具有重要意义。
目前，针对病毒性疾病的诊断方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法(免疫电镜法、免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(elisa))以及分子生物学检测技术(原位杂交(ish)、聚合酶链式反应(rt-pcr))等，这些方法虽然得到了一定的应用，但在诊断混合感染中仍然存在不足。例如病毒分离不易成功，血清学检测灵敏性低，检测过程中容易出现交叉反应，分子生物学检测的样本数量有限导致无法实现样品高通量的快速检测。这些检测技术的共同缺陷是无法同步，因此急需一种高通量诊断技术来鉴别诊断四种仔猪病毒性腹泻病。
基因芯片技术是近年来迅速发展起来的一门新型的高通量检测技术，根据探针的不同可分为cdna芯片与寡核苷酸芯片。基因芯片通过将设计好的探针点制在基片上，通过荧光素或酶等标记物标记在扩增产物的单链上与制备完成的芯片进行核酸杂交，然后经过激光扫描仪扫描、肉眼观察等方法得出杂交结果并对其进行分析。该方法具有自动化、平行性和高通量等潜在优势，能同时对多种疾病进行检测，因此它广泛应用于生物学领域，在动物疫病研究方面前景广阔。
目前利用基因芯片技术检测猪腹泻病毒的报道见滑翔等，检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cdna芯片的构建，畜牧兽医学报，2015，12:235-224，该方法仅针对三种猪腹泻病毒，使用的芯片为cdna芯片，最低检测质量浓度仅为20pg·μl-1，灵敏度较低。
马锐等，猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用，农业生物技术学报，2016,24:1233-1242，公开了一种寡核苷酸芯片，该方法同样仅能检测三种特定的猪腹泻病毒；而且在操作程序上，步骤多且复杂，条件难以控制和标准化；另外对试剂材料的需求多，检测成本高；并且为了使结果肉眼可见，该方法必须使用喷样，一次性检测的样品数少。
寡核苷酸芯片通过设计特定寡核苷酸片段固定在醛基上，并用荧光标记后pcr扩增所得到的基因片段，通过碱基相互配对与荧光标记进行检测。因为探针以单链的形式固定在基片上，因此相较于cdna芯片该方法有效的降低了双链竞争抑制作用，杂交效率及灵敏度一定程度上均优于cdna芯片。但目前并无对猪腹泻病制备寡核苷酸芯片的报道，更未见同时检测4种猪腹泻病毒的高灵敏性寡核苷酸芯片。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片及其应用。
本发明提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含：seqidno：1-2所示探针、seqidno：3-4所示探针、seqidno：5-6所示探针、seqidno：7-8所示探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪a群轮状病毒和猪δ冠状病毒。
其中，还包括质控探针：seqidno：9所示的定位探针、seqidno：10所示的阳性对照探针。
其中，所述固相载体为醛基硅化处理过的醛基化玻片。例如北京博奥生物有限公司生产的
本发明还提供了扩增4种猪腹泻性病毒基因的引物对，包含8个引物对，分别如seqidno：11-12所示、seqidno：13-14所示、seqidno：15-16所示、seqidno：17-18所示、seqidno：19-20所示、seqidno：21-22所示、seqidno：23-24所示、seqidno：25-26所示。
本发明还提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的试剂盒，它包括权利要求1或2所述的寡核苷酸芯片和权利要求3所示的引物对。
其中，它还包括扩增阳性基因的引物对，序列如seqidno：27-28所示。
本发明还提供了上述寡核苷酸芯片、引物对或试剂盒在制备检测4种猪腹泻性病毒的试剂中的用途。
本发明还提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的方法，它包括如下步骤：
(1)病毒样品制备：取待检组织，提取rna并反转录为cdna；
(2)靶序列制备：用上述引物对扩增出靶序列并进行荧光标记；
(3)杂交：取步骤(2)制备的靶序列，与上述寡核苷酸芯片进行杂交；
(4)结果检测：取步骤(3)杂交后的芯片进行扫描分析，即可。
其中，步骤(3)中，所述杂交的时间为2-3h，温度为46℃
其中，步骤(4)中，所述扫描的仪器为博奥luxscan-10k/a芯片扫描仪。
本研究针对猪流行性腹泻病毒的s和m基因、猪传染性胃肠炎的s和n基因、猪轮状病毒a型的vp7和nsp4基因以及猪δ冠状病毒的n和m基因的正义链序列，分别设计各自特定的寡核苷酸探针，并以此构建可用于pedv、tgev、gar与pdcov同时检测的寡核苷酸芯片，构建的寡核苷酸芯片特异性好，内部各靶基因之间无交叉反应，与其他常见病原也无交叉反应；灵敏度为2pg·μl-1；芯片点制完成后在4℃可至少保存120d，稳定性高，准确度好，可实现四种猪腹泻病毒pedv、tgev、gar与pdcov的高通量共检，可应用于临床疫病的大量检测，应用前景广阔。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1基因芯片矩阵点样模式图
图2pcr扩增结果
(m:2000bpmarker，1:ps，2:pm，3：ts，4:tn，5:vp7，6:nsp4，7：dn，8:dm，9：λ)图3全探针扫描
图4点样缓冲液优化结果
图5水合时间优化结果，a:水合6h；b:水合8h；c:水合10h；d:水合12h.
图6水合时间优化结果曲线图
图7杂交温度优化，a:38℃；b:42℃；c:46℃；d:50℃.
图8杂交温度优化结果曲线图
图9杂交时间优化，a:杂交60min；b:杂交90min；c:杂交120min；d:杂交150min.
图10杂交时间优化结果曲线图
图11芯片特异性实验杂交结果
a:pedv特异性实验结果；b:tgev特异性实验结果；c:gar特异性实验结果；d:pdcov特异性实验结果；e:prrsv+csfv+jev+pcv2混合感染特异性实验结果。
图12芯片灵敏度实验结果(a：105倍稀释；b：106倍稀释；c：107倍稀释；d：108倍稀释)
图13芯片保存期评价结果(a：30d；b：60d；c：90d；d：120d)
图14保存期曲线图
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明pedv-tgev-gar-pdcov寡核苷酸共检芯片的构建
1、生物材料
1.1质粒
重组质粒pmd-ps、pmd-pm、pmd-ts、pmd-tn、pmd-vp7、pmd-nsp4、pmd-n、pmd-m(制备方法见“2目的基因重组质粒的构建”)、pmd-λ(购自宝生物(大连)生物科技有限公司)，质粒均由本实验室构建并保存。
1.2主要试剂：
总rna提取试剂盒、血液/组织/细胞基因组提取试剂盒：天根生化科技公司；
小量质粒提取试剂盒：omegabio-tek公司；
primescripttmrtreagentkit、阳性质控(λdna)：宝生物工程(大连)有限公司；
其它自备试剂的配置：
2×ssc：nacl17.53g，柠檬酸钠8.82g，ddh2o80ml，用naoh调ph至7.0，定容至100.0ml，用孔直径为0.2nm滤膜过滤后保存备用
10％sds:称取sds100g，溶于900ml超纯水中。
pbs缓冲液：nacl30g、kcl1g、na2hpo47.1g、kh2po41.35g，定容至1l；
50×tae：tris121.0g，冰乙酸28.55ml，0.5mol·l-1edta50.0ml，使用naoh将ph调至8.0，加ddh2o定容至500ml。
1.3主要仪器设备：
powerpactm电泳仪、mycyclertmpcr仪、凝胶成像分析系统、smartspectmplus核酸蛋白仪：美国bio-rad公司；空气恒温摇床、allegratm64r高速冷冻离心机、分子杂交仪：美国thermoforma公司；personalarrayertm16微阵列芯片点样系统、博奥luxscan-10k/a芯片扫描仪：北京博奥生物技术有限公司。
1.4引物与探针
表1引物信息
注：f＝上游引物；r＝下游引物。
表2探针信息
2目的基因重组质粒的构建
2.1引物设计：用dnaman软件分别对genbank中收录的基因序列进行多重比对分析选定各自的保守区域，用软件primerpremier5.0针对保守区域设计特异性引物，见表1。
2.2靶基因的抽提：采用天根总rna提取试剂盒抽提靶基因的总rna。
2.3rt-pcr扩增
以抽提的rna为模板，以random6primers为引物合成cdna，反应体系如下：
总体积(10.0μl)：rtenzymemix0.5μl、random6primers0.5μl、5×primescriptrtbuffer2.0μl、rna2.0μl、rnase-free超纯水5.0μ。
按下面程序进行rna反转录：37℃，15min；85℃，5s；得到的cdna在4℃保存。
以反转录得到的cdna为模板，进行pcr扩增aiv的np基因片段，反应体系和反应条件如下：
总体积(15.0μl)：2×taqpcrmastermix7.5μl、cdna2.0μl、上下游特异性引物(10.0μmol/l)各0.5μl、超纯水4.5μl。
反应条件如下：95.0℃变性5min；95.0℃变性30s，56.5℃退火30s，72.0℃延伸30s，30个循环；72.0℃延伸10min，4℃保存。取6μl扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2.4靶基因的胶回收、连接pmd19-t、转化感受细胞中、靶基因重组质粒鉴定。
2.5靶基因重组质粒菌的保存：把序列测定正确的探针基因重组质粒菌扩大培养12h，然后以20％脱脂奶粉与菌液1:1混匀后抽干，-70℃保存。
探针基因序列分别如下：
基因来源：pedv-s，基因片段大小及序列：474bp
cgctaggcttgagtctgttgaagttaactctatgcttactatttctgaagaggctctacagttagctaccatcagttcgtttaatggtgatggatataactttactaatgtgctgggtgtttccgtgtacgaccctgcaagtggcagggtggtacaaaaagggtcttttattgaagacctgctttttaataaagtggttactaatggccttggtactgttgatgaagactataagcgctgttctaatggtcgctctgtggcagatctagtctgtgcgcagtattactctggtgtcatggtactacctggcgttgttgacgctgagaagcttcaaatgtatagtgcgtctctcatcggtggtatggcgctaggaggtcttactactgcagcggcattgccttttagccatgctgttcaagcgaggctcaattatcttgctttacagacggatgttctacagcggaaccagcaatt
基因来源：pedv-m，基因片段大小及序列：421bp
cttatggcttgcatcactcttatgctgtggataatgtattttgtcaatagcattcggttgtggcgcaggacacattcttggtggtctttcaatcctgaaactgacgcgcttctcactacttctgtgatgggccgacaggtctgcattccagtgcttggagcaccaactggtgtaacgctaacactccttagtggtacattgtttgtagagggctataaggttgctactggcgtacaggtaagtcaattgcctgatttcgtcacagtcgccaaggccactacaacaattgtctatggacgtgttggtcgttcagtcaatgcttcatctggcactggttgggctttctatgtccggtcaaaacacggcgactactcagctgtgagtaatccgagtgcggttctcacagatagcgagaaagtgc
基因来源：tgev-s，基因片段大小及序列：274bp
aggcttgacgaattgagtgctgatgcacaagttgacaggctgatcacaggaagacttacagcacttaatgcatttgtgtctcagactctaaccagacaagcggaggttagggctagtagacaacttgccaaagacaaggttaatgaatgcgttaggtctcagtctcagagattcggattctgtggtaatggtacacatttgttttcactcgcaaatgcagcaccaaatggcatgattttctttcacacagtgctattaccaacggcttatgaaact
基因来源：tgev-n，基因片段大小及序列：362bp
ttcctgaaaggtggttcttctactacttaggtactggacctcatgcagatgccaaatttaaagataaattagatggagttgtctgggttgccaaggatggtgccatgaacaaaccaaccacgcttggtagtcgtggtgctaataatgaatccaaagctttgaaattcgatggtaaagtgccaggcgaatttcaacttgaagttaatcaatcaagagacaattcaaggtcacgctctcaatctagatctcggtctagaaatagatctcaatctagaggcaggcaacaattcaataacaagaaggatgacagtgtagaacaagctgttcttgccgcacttaaaaagttaggtgttgacacagaa
基因来源：gar-vp7，基因片段大小及序列：381bp
ttgaatgaatggctatgtaatccaatggatataatgctatattattatcagcaaacagatgaagctaataaatggatatcaatgggtacatcatgtacgattaaagtatgtcctctaaatacgcagactctcgggataggatgttcgactacagacataaattcatttgaaacagtggccaatgcagagaaattagctataactgatgttgtcgatggagtcaatcataaattagacgtaacaacgagtacatgtactataagaaattgtaaaaaacttggaccaagagaaaatgtcgctgtaattcaggtaggaggtccaaacatactcgacataacagctgatccaacaactgcaccacaaactgaaagaatgatgcgt
基因来源：gar-nsp4，基因片段大小及序列：270bp
gaacaggttactactaaggatgaaattgaacaacagatggacagaattgttaaggagatgaggcgtcaactggaaatgattgacaaattgacaactcgtgaaattgaacaagttgaattacttaagcgtatacatgacaaattagctgctagaccagttgatgctatagatatgtcgaaggaatttaatcagaaaaatattcgaacgctagatgaatgggaaagtggaaaaaatccatatgaaccgtcggaagtaactgcgtctatgtga
基因来源：ppdcov-n，基因片段大小及序列：775bp
tccatcctatgccttttatactggcacaggtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgataccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacacttctattaaacctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgaccccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatctgttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgaccaatctgcacccgctgcggtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatttctcaggtatttggcaaccggtctcgtactggtgccaatgtcggctctgcagacactgagaagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctctagccagacatgtgcctggtgttcaggaaatgcttttcgctggccaccttgagagcaactttcaggcaggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaa
基因来源：ppdcov-m，基因片段大小及序列：485bp
gcgtaaccgtgtgatctatgttattaaacttattctgctttggctgctccaacccttcaccctagtggtgaccatttggaccgcagttgacagatcatctaagaaggacgcagttttcattgtgtccataatttttgccgtactgaccttcatatcctgggccaagtactggtatgactcaattcgcttattaatgaaaaccagatctgcatgggcactctcacctgagagtagactccttgcagggattatggatccaatgggtacatggaggtgcattcccatcgaccacatggctccaattctcacaccagtcgttaagcatggcaagctcaagctacatgggcaagagctggccaatggcatatcagttagaaatccgccacaggatatggtgatagtgtcaccaagtgacacctttcactacacttttaagaaacctgtggaatcaaacagcgatccagaattcgctgttctgatatacca
基因来源：λ基因，基因片段大小及序列：500bp
gtcctatgacgacagctatctcgatgatgaagatgcagactggactgcgaccgggcaggggcagaaatctgccggagataccagcttcacgctggcgtggatgcccggagagcaggggcagcaggcgctgctggcgtggtttaatgaaggcgatacccgtgcctataaaatccgcttcccgaacggcaccgctggcgtggatgcccggagagcaggggcagcaggcgctgctggcgtggtttaatgaaggcgatacccgtgcctataaaatccgcttcccgaacggcaccacggtaacagcggcaaccggcatgaccgtgacgcctgccagcacctcggtggtgaaagggcagagcaccacgctgaccgtggccttccagccggagggcgtaaccgacaagagctttcgtgcggtgtctgcggataaaacaaaagccaccgtgtcggtcagtggtatgaccatcaccgtgaacggcgttgctgcaggcaaggtcaacatt
3寡核苷酸芯片制备
3.1寡核苷酸芯片点样程序
本研究使用的点样系统为晶芯personalarrayer16，使用接触式点样系统点制芯片，芯片的基片为北京博奥生产的
在打开晶芯personalarrayer16操作软件后，待系统自检完毕进入设置界面，装载点样针，放置384孔载样板。在点样前对点样仪各个系统位置进行标定，分别为清洗位置、抽干位置、第一片波片位置、样品孔板a24孔位置及排空位置，首先对各个位置的x、y轴标定之后标定z轴位置。在点样仪点样区域放置试验所需的芯片后对点样参数进行以下设置:
在点样仪的芯片卡槽内放置试验所需的芯片数量，起始玻片设置为1，点样玻片数按照实际试验所需放入后按照对应数量进行设置。根据芯片点阵设计要求，样品重复点数为4，选择重复阵列，预点数为50，预点样间距为500μm；在清洗设置中清洗、超声、抽干均为3s，重复5轮以上以保证点样针的清洁。
芯片点制完毕后静置15min，待彻底干燥后紫外交联15min，之后在分子杂交仪内37℃水合处理过夜，使用37℃预热的0.2×ssc溶液对水合处理完毕的芯片清洗5min，再以37℃预热的蒸馏水清洗5min，取封闭液(0.5％bh4na，25％ethanol，0.75×pbs)完全覆盖芯片矩阵，置于37℃分子杂交仪内15min进行封闭，再次通过预热蒸馏水进行清洗，1300r·min-1离心彻底干燥，置于4℃条件下避光保存备用。
3.2寡核苷酸芯片杂交程序
3.2.1靶基因的扩增标记
将稀释100倍的9个质粒做为模板，使用荧光标记的下游特异性引物进行荧光标记扩增，避光环境下进行加样，pcr体系如下：
总体积(30.0μl)：2×taqpcrmastermix15.0μl、模板2.0μl、上游引物2.0μl、荧光标记下游特异性引物2.0μl、超纯水9.0μl。
反应程序：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72.0℃45sec，30个循环；72℃10min，12℃保存。
3.2.2寡核苷酸芯片的杂交与清洗
将pcr扩增产物(即探针基因序列)于95℃变性5min获得荧光标记单链，再置于冰上冷却5min防止复链，将荧光标记单链与杂交缓冲液1:1混合，每一个制备完毕的寡核苷酸芯片的矩阵内加入50μl混合液以保证可以完全覆盖矩阵。将芯片放置杂交舱中于分子杂交仪内避光42℃杂交2-3h。杂交结束后，37℃预热洗液ⅰ(2×ssc+0.2％sds)、洗液ⅱ(0.2×ssc)和洗液ⅲ超纯水，将杂交完毕的芯片置于洗液ⅰ中震荡清洗5min，之后置于洗液ⅱ中震荡清洗5min，再置于超纯水中清洗5min，震荡清洗过程中需上下提拉芯片保证芯片完全清洗。最后1300r·min-1离心10min后干燥芯片，对芯片进行扫描及分析。此芯片可避光保存，在30d内扫描均有效。
3.3寡核苷酸芯片扫描及结果判定
将杂交清洗完毕干燥处理过后的寡核苷酸芯片使用博奥luxscan-10k/a芯片扫描仪扫描观察。luxscan-10k/a芯片扫描仪扫描参数设置：通道：绿光通道；荧光染料：cyanine3；power：95；pmt：650；分辨率：10。待通道激活完毕后首先预扫描整张芯片，待预扫描结束后，选取预扫描中的矩阵区域进行扫描可观察芯片杂交结果。
扫描的结果使用基因博奥luxscan-10k/a芯片扫描仪随机自带的数据分析软件luxscan3.0进行分析，通过建立虚拟点阵与矩阵内阵点一一对应获取数据，分析结果以*.lsr文件格式保存。软件数据输出模式主要有阵点信号中位值和阵点信号平均值两种。样点信号阈值概念snr，是阵点信号值中位与背景信号中位值的比值，当snr≥2.0时且阵点在矩阵内清晰可见，本研究以此来判定每个样点的杂交结果。
3.4寡核苷酸芯片检测矩阵设计排布
由于实验室购得的杂交围栏只能分出4个矩阵，为使每张芯片的利用率达到最大化，本研究在每张寡核苷酸芯片设计4个重复矩阵，使用杂交围栏隔开，以便于临床上可同时进行平行检测。设计的矩阵包括定位基因、阳性对照、待检探针基因以及分为超纯水与点样缓冲液的阴性对照。第一排为定位基因，第六排是作为阴性对照的超纯水及点样缓冲液，最后一排点为阳性对照，其余各排点相应的探针和空白对照。点阵中每组阵点重复4次，每个矩阵包含8×7＝56点。基因芯片矩阵点样模式见图1。
3.5阳性质粒的提取
挑取少许冻存含靶基因的重组质粒菌在lb液体培养基(含100μg·ml-1的amp)中复苏培养，置于37℃摇床振荡培养12h；在lb固体培养基(含100μg·ml-1的amp)上划线接种，37℃倒置恒温培养12h；挑取形态与大小合适的目标单菌落，加入5ml含amp的lb液体培养基，置于37℃恒温摇床220r·min-1振荡培养过夜。从复苏的靶基因重组质粒中分别提取pedv-s、pedv-m、tgev-s、tgev-n、gar-vp7、gar-nsp4、pdcov-n、pdcov-m、λ的重组质粒，操作步骤参见质粒提取试剂盒说明书。所提取质粒dna用80μlelutionbuffer洗脱，取7μl产物使用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：80v，20min。
3.6寡核苷酸芯片探针与点样缓冲液配比优化
向384孔载样板孔分别加入定位基因探针与点样缓冲液比例为原探针浓度、1：1、1：2、1：3、1：4浓度的混合液，每一浓度重复点样数设置为8，以确定探针与点样缓冲液的最佳比例，按2.1中方法进行点样、水合、清洗，定位基因探针是通过cy3荧光直接标记后点制在芯片，因此无需杂交，在清洗完毕后1300r·min-1离心10min后干燥芯片，对芯片进行扫描，观察并分析结果。
3.7寡核苷酸芯片水合时间优化
按本章2.1中方法点样完成后，将放置寡核苷酸芯片的杂交舱置于暗湿盒中，分别于37℃分子杂交仪内6h、8h、10h以及12h进行水合处理，以确定在芯片的制备过程中最适水合时间。对水合后的芯片进行封闭与洗涤处理，杂交后进行清洗干燥并进行芯片的扫描，观察并分析扫描结果。
3.8寡核苷酸芯片杂交温度优化
根据本章2.2.2中方法对所构建的9种阳性质粒模板的pcr产物处理后，将扩增产物与杂交缓冲液以1:1混合后在点制完成的芯片上进行杂交。每个芯片矩阵加入50μl混合液分别在38℃、42℃、46℃与50℃下进行杂交,以此确定寡核苷酸芯片的最适杂交温度。杂交后分别使用洗液ⅰ、洗液ⅱ和超纯水各清洗5min，之后1300r·min-1离心芯片10min，待彻底干燥并后进行扫描，观察并分析扫描结果。
3.9寡核苷酸芯片杂交时间优化
根据本章2.2.2中方法对pcr产物进行处理后与点制完成的芯片进行杂交，每个芯片矩阵加入50μl混合液分别进行1h、1.5h、2h与2.5h的杂交以确定芯片杂交的最优时间。杂交后分别使用洗液ⅰ、洗液ⅱ和超纯水各清洗5min，对芯片1300r·min-1离心10min后干燥并进行扫描，观察并分析扫描结果。
4结果
4.1阳性质粒提取结果
4.1.1阳性质粒浓度测定
利用核酸蛋白仪测定各质粒的od260/od280，换算成浓度，其浓度分别为pedv-s(278ng·μl-1)、pedv-m(283ng·μl-1)、tgev-s(232ng·μl-1)、tgev-n(285ng·μl-1)、gar-vp7(302ng·μl-1)、gar-nsp4(289ng·μl-1)、pdcov-n(215ng·μl-1)、pdcov-m(221ng·μl-1)以及λ(195ng·μl-1)。
4.1.2阳性质粒扩增产物鉴定
依照第2.2.1中所用的pcr体系及程序对九个基因的阳性质粒进行普通pcr扩增，鉴定其扩增产物。结果如图2所示，扩增产物与预期大小相符合。
4.2寡核苷酸芯片全基因的检测
在寡核苷酸芯片杂交完毕后进行清洗与离心干燥并对芯片进行扫描与分析，结果见图3。可见4种病毒的8个基因探针的各个阵点均有荧光信号显示且定位基因探针与阳性对照荧光信号明显，作为阴性对照的超纯水和点样缓冲液阵点没有荧光信号显示，表明制备的寡核苷酸共检芯片基因探针选取成功，芯片质量可靠。
4.3点样缓冲液的优化结果
点样缓冲液优化结果如图4所示，通过将不同比例的定位基因探针点制于寡核苷酸芯片上在扫描后均出现荧光信号。当定位基因探针与点样缓冲液浓度比例为1：2时，点阵上的荧光信号没有原探针浓度与比例为1：1的混合液中的白斑，基因芯片的荧光信号较为良好，因此也确定了其他点阵探针与点样缓冲液浓度比例均为1：2。
4.4寡核苷酸芯片水合时间优化结果
将寡核苷酸芯片在37℃条件下水合6h、8h、10h与12h，对水合后的芯片进行封闭与洗涤处理后与荧光标记单链进行杂交后进行清洗与干燥，扫描芯片后进行数据扫描分析。在6h水合后杂交得到的图像因为水合时间较短使得探针无法与基片紧密结合，导致阵点形状不规则，背景值较深且充满水印；水合8h与10h后可得到阵点清晰可见的杂交结果；当水合时间超过10h后，背景色明显变深，阵点荧光信号模糊。扫描结果显示(图5)：随着水合时间的增长，杂交信号逐渐提高；当水合时间超过10h后，背景值明显增加。当水合时间为10h时，杂交信号与背景值的中位值差值最大，芯片snr值最大(图6),杂交信号最明显，因此确定芯片在水合处理10h后进行杂交效果较好。
4.5寡核苷酸芯片杂交温度优化结果
将同一批次点制的寡核苷酸芯片做相同处理后分别在38℃、42℃、46℃和50℃温度条件下与芯片进行杂交，杂交2h后进行清洗与干燥离心，数据扫描分析后得出结果(图7)：在38℃-46℃下点阵清晰完整，当温度高于50℃时，虽点阵清晰可见，但是由于矩阵内杂质增多影响到结果的判定。数据扫描结果分析显示：随着杂交温度的升高，杂交信号逐渐提高；当杂交温度大于50℃时，杂交信号开始降低。当杂交温度为46℃时，杂交信号与背景值的中位值差值最大，芯片snr值最大(图8)，杂交信号最明显。
4.6寡核苷酸芯片杂交时间优化结果
将同一批次点制的寡核苷酸芯片做相同处理后在46℃分别杂交60min、90min、120min和150min后进行清洗与干燥离心，数据扫描分析结果表明(图9)：杂交时间的延长可有效增加基因芯片的杂交效率，但同时背景值也有增加。经数据扫描结果分析可以看出，前90min杂交信号值强度和背景值均有所增强，90min-120min后背景值增强不明显，杂交信号值仍持续增强，120min后背景值迅速增高，当芯片杂交120min时，杂交信号与背景值差值最大，芯片snr值最大(图10)，杂交信号最明显，因此确定杂交120min为最优杂交时间。
因此，本发明成功制备出pedv-tgev-gar-pdcov寡核苷酸共检芯片，该芯片最适水合时间为10h；最适杂交温度为46℃；最适杂交时间为120min。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明pedv-tgev-gar-pdcov寡核苷酸共检芯片的评价及临床应用
1临床样本
采集四川地区的209份临床猪腹泻样本的病变小肠及小肠内容物，通过芯片进行检测并将检测结果与常规rt-pcr结果进行比对。
2方法
2.1基因芯片：按照实施例1方法制备的寡核苷酸芯片。
2.2核酸样本的提取
2.2.1rna病毒核酸样本的提取
采用天根总rna提取试剂盒(柱)试剂盒对临床样本进行总rna提取。首先采集病毒含量较多的相应靶器官组织样本(pedv、tgev、gar和pdcov采取送检病料的小肠及小肠内容物剪取；csfv、prrsv及jev采取肝、肾、脾、淋巴结病变组织)，加入1ml裂解液研磨处理，在研磨过程中加入液氮，研磨至组织样本融化即可，之后按照天根总rna提取试剂盒(柱)试剂盒说明书进行rna的提取。
使用takara公司的反转录试剂盒将rna提取试剂盒提取的产物经反转录成cdna，用核酸蛋白仪进行浓度及纯度的测定，将反转录的cdna为模板扩增标记后进行杂交。反转录操作按照takara反转录试剂盒说明书进行，pcr体系如下：
总体积(10.0μl)：5×primescriptrtbuffer2.0μl、rtenzymemix0.5μl、random6mers0.5μl、totalrna2.0μl、rnase-freeddh2o5.0μl。
反应程序：37℃，15min；85℃，5sec；4℃保存。
2.2.2dna病毒核酸样本的提取
使用tiangen总dna提取试剂盒(柱)对pcv核酸进行提取，采取pcv阳性病料脾、肝、肾及淋巴结病变组织，将其剪碎放入ep管内在沸水中煮10min，待温度降低后加入20μl蛋白酶k，55℃水浴加热1h后，按照tiangen总dna提取试剂盒(柱)试剂盒说明书步骤进行dna的提取，对所提取dna产物4℃保存。
2.3特异性试验
按照实施例1中方法分别制备pedv、tgev、gar、pdcov、prrsv、csfv、jev和pcv质粒的荧光标记单链，之后选择pedv、tgev、gar和pdcov质粒的荧光标记单链及prrsv、csfv、jev和pcv质粒的荧光标记单链混合物与点制完成的寡核苷酸芯片进行杂交。杂交结束后从杂交盒舱中取出芯片，置于洗液ⅰ中震荡清洗5min，再置于洗液ⅱ中震荡清洗5min，再置于超纯水中清洗5min，最后用1300r·min-1离心10min后干燥芯片，对芯片进行扫描及分析。
2.4灵敏性试验
利用核酸蛋白仪测定各质粒的od260/od280，其浓度分别为pedv-s(278ng·μl-1)、pedv-m(283ng·μl-1)、tgev-s(232ng·μl-1)、tgev-n(285ng·μl-1)、gar-vp7(302ng·μl-1)、gar-nsp4(289ng·μl-1)、pdcov-dn(215ng·μl-1)、pdcov-dm(221ng·μl-1)以及λ(195ng·μl-1)。分别对全部阳性质粒进行10倍梯度稀释，将稀释后不同浓度cdna作为模板扩增产物，按照实施例1中2.2的方法制备荧光标记单链并进行芯片的杂交，杂交结束后进行芯片的清洗，1300r·min-1离心10min后干燥芯片，对芯片进行扫描及分析。
2.5保存期试验
本研究将按照实施例1方法同一批生产的8张芯片放置在4℃下进行密封保存。分别在30d、60d、90d、120d从各组中抽出两张芯片，使用阳性质粒荧光标记单链与芯片进行杂交，清洗干燥芯片后对芯片进行扫描及分析。
2.6临床样本检测
2.7.1rt-pcr检测临床样本
按照2.2.1方法对临床209份样品进行核酸提取并转录成cdna，使用荧光标记下游引物进行荧光标记扩增，避光环境下进行加样，pcr体系如下：
总体积(15.0μl)：2×taqpcrmastermix7.5μl、上游特异性引物1.0μl、荧光标记下游特异性引物1.0μl、dna模板1.0μl、超纯水4.5μl。
反应程序：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72.0℃45sec，30个循环；72℃10min，12℃保存。
取7μl产物使用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：80v，20min。
2.7.2寡核苷酸基因芯片检测临床样本
采集四川地区209份临床样本的病变小肠及小肠内容物，使用天根总rna提取试剂盒提取病毒rna，通过takara反转录试剂盒将所提取rna反转录为cdna后用pcr进行荧光扩增标记后进行杂交检测，与常规rt-pcr检测结果进行比较。
3结果
3.1特异性实验
分别用pedv、tgev、gar、pdcov、prrsv、csfv、jev、pcv等病毒进行pedv-tgev-gar-pdcov寡核苷酸芯片杂交特异性的检测。结果见图11。
可知：使用pedv、tgev、gar与pdcov的阳性质粒的荧光标记单链分别与芯片杂交，pedv、tgev、gar与pdcov均在相应的阵点出现明显的荧光信号，而且定位基因与阳性对照荧光信号明显，结果表现为阳性。将prrsv、pcv、csfv和jev的质粒荧光标记单链混合后与芯片进行杂交，检测结果显示除定位基因与阳性对照荧光信号清晰可见外，其余阵点均无荧光信号，结果表现为阴性。
3.2灵敏性试验
将所构建的九种阳性质粒分别进行十倍梯度稀释作为模板，将稀释范围为100-10-9的各个质粒荧光标记单链与点制完成的寡核苷酸芯片进行杂交。杂交结果选取差异较为明显的105-108倍质粒稀释后杂交结果，如图12，表明稀释至105后的质粒该芯片仍可针对其进行有效检测并且各阵点清晰可见，该芯片的最低检测浓度为2pg·μl-1。
3.3保存期试验
本研究将8张同一批次点制的寡核苷酸基因芯片放置在4℃下进行密封保存。分别在30d、60d、90d、120d随机选取两张芯片与阳性质粒的荧光标记单链产物进行杂交。结果见图13-14。
可见，直到120d后进行检测，寡核苷酸基因芯片的阵点依旧清晰可见且各阵点snr值均大于2.0，保存期曲线图表明在120天内检测芯片的snr值变化曲线并不明显，说明本研究所建立的寡核苷酸基因芯片可在4℃下进行长期保存。
3.4临床样本检测
采集四川地区的209份临床样本的病变小肠及小肠内容物，提取总rna后使用反转录试剂盒将其反转录为cdna，pcr进行荧光扩增标记后获取荧光标记单链进行杂交，与常规rt-pcr进行比对，两者结果一致(pedv阳性率为68.42％、tgev阳性率为4.30％、gar阳性率为0.95％、pdcov阳性率为2.87％)，检测结果见下表:
表3临床样本检测结果
综上，本发明寡核苷酸芯片和试剂盒可以有效检测猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪a群轮状病毒(gar)以及猪δ冠状病毒(pdcov)，特异性强、灵敏度高、稳定性好，可用于临床大规模检测，应用前景良好。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片及其应用
<130>gy151-18p1159
<160>28
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>26
<212>dna
<213>pedv病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，ps)
<400>1
cgctgttctaatggtcgctctgtggc26
<210>2
<211>29
<212>dna
<213>pedv病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pm)
<400>2
atctggcactggttgggctttctatgtcc29
<210>3
<211>32
<212>dna
<213>tgev病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，ts)
<400>3
caaggttaatgaatgcgttaggtctcagtctc32
<210>4
<211>30
<212>dna
<213>tgev病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tn)
<400>4
acgcttggtagtcgtggtgctaataatgaa30
<210>5
<211>33
<212>dna
<213>gar病毒(grouparotavirus，vp7)
<400>5
aagagaaaatgtcgctgtaattcaggtaggagg33
<210>6
<211>34
<212>dna
<213>gar病毒(grouparotavirus，nsp4)
<400>6
agaccagttgatgctatagatatgtcgaaggaat34
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>pdcov病毒(porcinedeltacoronavirus，n)
<400>7
ctcagtttcgtggcaatggagtt23
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>pdcov病毒(porcinedeltacoronavirus，m)
<400>8
ggtgaccatttggaccgcagttgacaga28
<210>9
<211>18
<212>dna
<213>定位探针(artificialsequence，)
<400>9
gatgccgcaacactgagt18
<210>10
<211>31
<212>dna
<213>阳性探针(artificialsequence，)
<400>10
ggtggcaacagtacagaaagacggacgaagg31
<210>11
<211>20
<212>dna
<213>pedv病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，ps上游引物)
<400>11
cgctaggcttgagtctgttg20
<210>12
<211>20
<212>dna
<213>pedv病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，ps下游引物)
<400>12
aattgctggttccgctgtag20
<210>13
<211>18
<212>dna
<213>pedv病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pm上游引物)
<400>13
cttatggcttgcatcact18
<210>14
<211>18
<212>dna
<213>pedv病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pm下游引物)
<400>14
gcactttctcgctatctg18
<210>15
<211>25
<212>dna
<213>tgev病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，ts上游引物)
<400>15
aggcttgacgaattgagtgctgatg25
<210>16
<211>25
<212>dna
<213>tgev病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，ts下游引物)
<400>16
agtttcataagccgttggtaatagc25
<210>17
<211>25
<212>dna
<213>tgev病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tn上游引物)
<400>17
ttcctgaaaggtggttcttctacta25
<210>18
<211>24
<212>dna
<213>tgev病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tn下游引物)
<400>18
ttttctgtgtcaacacctaacttt24
<210>19
<211>23
<212>dna
<213>gar病毒(grouparotavirus，vp7上游引物)
<400>19
ttgaatgaatggctatgtaatcc23
<210>20
<211>22
<212>dna
<213>gar病毒(grouparotavirus，vp7下游引物)
<400>20
acgcatcattctttcagtttgt22
<210>21
<211>22
<212>dna
<213>gar病毒(grouparotavirus，nsp4上游引物)
<400>21
gaacaggttactactaaggatg22
<210>22
<211>22
<212>dna
<213>gar病毒(grouparotavirus，nsp4下游引物)
<400>22
tcacatagacgcagttacttcc22
<210>23
<211>25
<212>dna
<213>pdcov病毒(porcinedeltacoronavirus，n上游引物)
<400>23
tccatcctatgccttttattatact25
<210>24
<211>25
<212>dna
<213>pdcov病毒(porcinedeltacoronavirus，n下游引物)
<400>24
gcagagttacctttttaggtttctt25
<210>25
<211>25
<212>dna
<213>pdcov病毒(porcinedeltacoronavirus，m上游引物)
<400>25
gcgtaatcgtgtgatctatgttatt25
<210>26
<211>25
<212>dna
<213>pdcov病毒(porcinedeltacoronavirus，m下游引物)
<400>26
tggtatatcagaacagcaaattctg25
<210>27
<211>21
<212>dna
<213>阳性对照(artificialsequence，上游引物)
<400>27
aaagcgacgcaatgaggcact21
<210>28
<211>19
<212>dna
<213>阳性对照(artificialsequence，下游引物)
<400>28
gttccacgaccgcaactgc19