本发明属于农业生物工程领域，具体涉及低直链淀粉含量基因wx-c39的功能标记及其应用。
背景技术：
直链淀粉含量是优质稻米品质性状的重要指标。稻米品质性状属于复杂的综合数量性状，主要包括碾磨品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质4个方面。淀粉的种类及含量直接决定了稻米的蒸煮食味品质，其中直链淀粉含量最为关键。一般而言，直链淀粉含量20％以上的稻米品种食味差，直链淀粉在15％～20％以下食味较好。据我国优质稻谷质量指标(gb/717891-1999)，籼稻稻谷直链淀粉含量15％～24％，粳稻稻谷直链淀粉含量15％～20％，糯稻直链淀粉含量≤2％，软米是直链淀粉含量介于2％～15％的新型大米品种(张昌泉等，2016)。由于软米直链淀粉含量低，米饭具有软而不烂、甜润爽口、膨化性好、富有弹性、冷后不易变硬、回生程度小等优点，是制作方便米饭、米类点心等速食食品的高档原材料。
低直链淀粉水稻育种受到国内外广泛关注。软米育种开始于20世纪80年代日本提出的低直链淀粉含量水稻育种目标，已经育成越光、milkyqueen、milkyprincess等优质水稻品种。泰国软米kdml105、印度香米basimati在国际市场上都具有比较重要的地位。我国软米种植主要分布于西南地区，尤其是云南。云南地区历史上就种植软米品种，其性状基因为野生稻中自然变异所产生的，并由当地百姓的食用习惯得以保留。其中以毫民、毫屁为典型代表，是历代向朝廷进贡的佳品，解放后被列为国家优质上等米，常用以招待贵宾(liu等，plantmolecularbiology,2009,71(6):609-626)。在云南，已经培育出银光、云粳20号、云粳29号、云粳优4号、楚粳39等一系列优质软米品种。随时间的推移，软米的种植发展到湖南、湖北等地。近年来，江苏、东北等地也相继重视软米品种的选育与推广。如江苏省农业科学院近年来育成的南粳46、南粳9108、南粳5055等软米品种因其较好的抗病性、优良的品质、良好的适口性以及适合轻简化、机械化栽培的要求，已在生产上大面积推广。黑龙江省农业科学院利用辐照育种选育出的龙粳38软米品种因其产量高、抗病性好、耐冷、抗倒伏，已在黑龙江各地大面积得到推广。据统计，近年来我国软米主要分布在西南地区，占我国软米总量的53％，其次是华中和华南地区，华东、东北、华北、西北等地种植面积较少。随着江苏、东北对软米育种、发展的日益重视，预计华东和东北地区的面积会大幅增加，所占的比例也会加大。
现已定位和克隆了一系列稻米食味品质相关基因，它们大多数与直链淀粉合成相关，但稻米食味品质的调控机制研究仍然还需进一步深入开展。目前已经克隆的调控淀粉合成相关的基因有wx基因、dull基因，flo基因等。waxy基因编码一个结合在淀粉粒上的淀粉合成酶，是直链淀粉含量的主要调控基因，对稻米的蒸煮食味品质起着关键作用。目前的研究发现，wx基因至少有7种等位变异，而这些变异是引起不同品种间稻米直链淀粉含量差异的主要因素(朱霁晖等，中国水稻科学,2015,29(4):431-438)。wxa主要分布于籼稻品种中，控制高直链淀粉含量的合成，稻米直链淀粉含量一般在20-25％，稻米的糊化温度较高，粘稠度较低，食味品质较差。wxb主要分布于粳稻品种中，直链淀粉含量一般在15％～20％，米饭的黏弹性、适口性要好于携带wxa等位基因的品种。大多数糯稻品种携带wx等位基因，该等位变异由wx基因第2外显子一段23bp碱基插入引起，导致基因不能合成gbssi蛋白，进而无直链淀粉合成。wxin和wxhp/wxop等位变异类型来源于wxa，但直链淀粉含量均要低于wxa。wxmp和wxmq等位变异类型来源于wxb，它们的直链淀粉含量要低于wxb，目前江苏省农业科学院相继育成的南粳46、南粳9108、南粳5055等软米品种均是源于此种类型。
利用新的软米资源，寻找新的低直链淀粉含量调控基因，对于丰富软米基因库及解析软米形成机制具有重要的理论和实践意义。楚粳39是我们从云南资源筛选获得的一个软米材料，该品种目前已在云南生产上推广应用。楚粳39的大米外观混浊乳白色，我们研究发现该品种的wx基因发生移码突变，但直链淀粉含量仍然能够达到5％左右，米质介于糯米和粘米之间，属于软米类型。
技术实现要素：
技术问题
本发明的目的是开发低直链淀粉含量基因的功能标记，通过基因型检测可以知道表型，在育种中可以进行早代选择，缩短育种进程，提高育种效率。
技术方案
本发明提供了一种用于低直链淀粉含量基因wx-c39的功能标记，所述低直链淀粉含量基因wx-c39为基因登录号是eu770319的waxy基因编码区第2外显子129至139位共11bp缺失，针对该缺失设计一对引物，wxc39-f:cgtcccagctcgccacct，wxc39-r:ccacgctgcaccgaccg。
所述功能标记可以在低直链淀粉基因wx-c39检测中得到应用。其特征在于，用所述功能标记引物pcr反应扩增水稻材料dna模板,若扩增产物为162bp，表明水稻材料携带wx-c39纯合基因型，其直链淀粉含量5％；若扩增出173bp，表明水稻材料携带waxy的纯合基因型，其直链淀粉含量在15％,若同时扩增出162bp、173bp两条带，表明水稻材料为杂合基因型，其直链淀粉含量在15％。
所述pcr反应的体系为:dna模板2μl，10×pcrbuffer2μl，5×gcbuffer4μl，5mmol/l的mgcl22μl，2mmol/l的dntp2μl，上游引物wxc39-f2μl，下游引物wxc39-r2μl，taq酶0.2μl，ddh2o3.8μl。
所述pcr反应的扩增条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，结束反应,扩增产物在3.5％琼脂糖凝胶电泳，然后凝胶成像系统成像。
有益效果
本发明人所在团队从云南粳稻品种资源筛选到一个直链淀粉含量5％左右的品种，楚粳39。楚粳39的稻米外观不透明，呈暗乳白色，电镜分析发现其淀粉颗粒排列不致密，透光性差；利用楚粳39与苏垦118的f2遗传群体分析发现乳白与透明分离比例为3:1，符合单基因质量性状特征，该直链淀粉含量性状由核基因控制的隐性性状。通过对楚粳39的waxy基因序列进行测序分析发现，其waxy基因编码区与其它粳稻品种间存在11对碱基的缺失，即第2外显子缺失cgacgcgacgt共11bp。
该基因可以通过回交转育到栽培品种中，但传统上需要进行直链淀粉含量测定，其过程经历多代的杂交和回交，育种周期长，增加了育种周期和难度。因此，利用mas技术，进行基因型筛选鉴定，加快杂交后代的早代稳定，对于低直链淀粉基因快速转育、加快育种进程具有重要意义。本发明根据该位点的突变，设计了基于pcr的indel分子标记，进行基因型选择，加快早代稳定。
本发明所提供的功能标记及其应用，具有如下优点：
通过本发明获得了wx-c39基因的功能标记，该标记不是与waxy基因连锁的标记，而是根据功能突变位点开发而成，鉴定结果能直接反应植株的直链淀粉含量，不存在遗传交换的风险。因此，本发明的准确性高、操作简单、检测效率高、成本低廉，具有很强的实用价值。
附图说明:
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1四个品种的稻米外观照片
1.苏御糯，2.楚粳39，3.南粳9108，4.苏垦118
图2wxc39分子标记对f2群体单株检测结果
m为dl2000标记，由大到小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1-16是稻米外观表现为透明的单株的基因型，泳道17-24为稻米外观表现为乳白色浑浊状的单株的基因型
图3wxc39分子标记对水稻品种的检测结果
m为dl2000标记，大到小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1.楚粳39，2.日本晴，3.淮稻5号，4.南粳49，5.南粳9108，6.9311，7.ir36，8.黄华占
具体实施方式
以下结合附图说明，以具体实施例对本发明的技术方法进行说明：
(下面详细描述本发明的实施方式，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。)
楚粳39、日本晴、淮稻5号、南粳49、南粳9108、9311、ir36和黄华占均为公知公用材料，江苏省农业种质资源库可免费提供。
本发明人所在团队通过从云南地方水稻品种资源材料中筛选到一个低直链淀粉含量的新材料。通过遗传分析发现该性状为低单基因控制的隐性性状，是一个新的waxy等位基因，在第2外显子缺失11个碱基。
针对该缺失点设计了indel分子标记，该标记与直链淀粉含量共分离，可用于低直链淀粉含量的分子标记辅助选育。
1、楚粳39低直链淀粉含量的遗传分析
直链淀粉含量测定采用gb7648-1987的方法。楚粳39稻米的直链淀粉含量为5％左右，稻米外观呈乳白色(图1)，与糯稻接近，稻米横断面用碘-碘化钾溶液染色呈黑色，而糯稻染色呈棕红色。苏垦118是常规粳稻品种，直链淀粉含量15％左右，稻米外观呈半透明(图1)，稻米横断面用碘-碘化钾溶液染色呈黑色。利用楚粳39与粳稻品种苏垦118配制杂交种f1，种植f1，收获f2种子，将种子利用精米机加工，种子乳白色与半透明比例符合1:3比例，表明该性状是由单基因控制的隐性性状。
2、楚粳39携带的目标基因分析
已有报道waxy基因是控制直链淀粉含量的主效基因。因此我们对楚粳39的waxy基因进行了测序，与日本晴基因登录号是eu770319的waxy基因进行比对，发现在第2外显子存在11个碱基的缺失，导致楚粳39的waxy基因移码突变。
3、楚粳39分子标记引物设计
针对楚粳39waxy基因在第2外显子的缺失设计了引物，正向引物wxc39-f:cgtcccagctcgccacct，反向引物wxc39-r:ccacgctgcaccgaccg。进行pcr反应的体系为dna模板2μl，10×pcrbuffer2μl，5×gcbuffer4μl，mgcl2(5mmol/l)2μl，dntp(2mmol/l)2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，taq酶0.2μl，ddh2o3.8μl。扩增条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min，结束反应。扩增产物在3.5％琼脂糖凝胶电泳，然后凝胶成像系统成像。若扩增产物为162bp，表明携带wx-c39纯合基因型，其直链淀粉含量5％左右，若扩增出173bp，表明携带waxy的纯合基因型，其直链淀粉含量在15％左右，若同时扩增出两条带，表明为杂合基因型，其直链淀粉含量在15％左右。
4、分子标记与直链淀粉含量表型的共分离分析
由于稻米乳白色与低直链淀粉含量对应，半透明与正常直链淀粉含量对应，因此，将种子去壳，可以看出乳白色和透明色。在获得的498粒种子中，128粒种子表现乳白色，370粒种子表现透明色。然后利用糙米进行发芽，长成小苗后，用ctab方法提取叶片基因组dna(murraymg,etal.,nucleicacidsresearch,1980,8(19):4321-4326)，利用分子标记引物进行基因型分析。结果见图2，可以看出乳白色都是单一条带，大小为162bp，而透明色有两种类型，一种是单一带型，大小为173bp，一种是杂合型，两条带，同时162bp和173bp。因此本研究开发的分子标记检测的基因型与表型完全对应。
5、功能标记检测水稻品种资源(以下品种均为公知公用品种)
提取楚粳39、日本晴、淮稻5号、南粳49、南粳9108、9311、ir36和黄华占的dna进行pcr检测，结果见图3。可以看出楚粳39为162bp，而其它材料为173bp带型，其它材料都是常规水稻品种，因此该标记是楚粳39携带的wx-c39等位基因的特异分子标记。
序列表
<110>江苏省农业科学院
楚雄彝族自治州农业科学院
<120>低直链淀粉含量基因wx-c39的功能标记及其应用
<141>2018-06-21
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cgtcccagctcgccacct18
<210>2
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ccacgctgcaccgaccg17