本发明涉及肿瘤生物学技术领域，即一种大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株的制备方法和应用。
背景技术
垂体腺瘤作为一种良性肿瘤，占全部颅内肿瘤的大约10～15%。根据体内激素分泌活动可将其分为功能型和无功能型，根据肿瘤大小又可将其分为微腺瘤、大腺瘤和巨大腺瘤。泌乳素腺瘤作为最常见的垂体腺瘤，可过量分泌泌乳素并产生一系列症状。根据尸检及放射学研究，其发病率约为40～57%。虽然泌乳素腺瘤是一种良性肿瘤，但由于其造成高泌乳素血症和颅内压迫作用，可产生严重的临床症状：头痛、视力障碍、颅神经功能障碍、女性月经紊乱、闭经、泌乳、性功能障碍、不孕不育等。不仅如此，大量研究表明泌乳素腺瘤还可导致代谢综合征，如超重、胰岛素抵抗、血脂异常等。
多巴胺受体激动剂是泌乳素腺瘤的首选治疗手段。但部分不能耐受多巴胺受体激动剂或对其产生了耐药性的病人在接受了外科切除或放射治疗后，往往会复发。因此，研究泌乳素腺瘤的溴隐亭耐药机制对解决其不良预后并寻找安全有效的替代药物至关重要。大鼠泌乳素腺瘤mmq细胞系是目前研究泌乳素腺瘤常用的一种细胞株，但关于泌乳素腺瘤的耐药细胞株仍较少见，特别是由溴隐亭诱导的泌乳素腺瘤耐药细胞株未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种制备大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株的方法，制备得到的大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株具有耐药性稳定的优点。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株。
本发明的另一目的在于提供上述大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株在制备肿瘤耐药逆转剂或药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种制备大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株的方法，是以大鼠泌乳素腺瘤mmq细胞作为亲本细胞，采用溴隐亭模拟人体内给药过程，通过反复大剂量冲击联合逐步递增药物浓度的方法，诱导建立获得大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株mmq/brc。
在诱导过程中，增加适当的溴隐亭浓度非常重要，理想状况是既通过增加药物浓度筛选出部分耐药细胞又不致于使细胞全部死亡，从而不断获得有更高耐药性的mmq/brc细胞。因此本发明采用反复大剂量冲击联合逐步递增药物浓度的方法来诱导建立获得耐药细胞株mmq/brc。
所述方法包括以下具体步骤：
s1.取大鼠泌乳素腺瘤mmq细胞系，接种于含10%胎牛血清的dmemf12培养基中，置于37℃、5%co2、饱和湿度环境下培养；
s2.取对数期生长期mmq细胞或当细胞密度达到80%时，接种于含2μmol/ml终浓度溴隐亭的新鲜dmemf12培养基中，置于37℃、5%co2、饱和湿度环境下培养，观察细胞是否能在此浓度下的培养基中稳定生长、传代；
s3.按s2的方法进行培养并逐渐提高溴隐亭终浓度，依次为4μmol/ml、6μmol/ml、8μmol/ml、10μmol/ml，并冻存每个浓度下生长状态良好的细胞；
s4.将10μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为10μmol/ml、20μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
s5.重复s4两次，冻存两种浓度下的细胞；将20μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为22μmol/ml、24μmol/ml、26μmol/ml、28μmol/ml、30μmol/ml；
s6.将30μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为30μmol/ml、40μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
s7.重复s6两次，冻存两种浓度下的细胞，将40μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为42μmol/ml、44μmol/ml、46μmol/ml、48μmol/ml、50μmol/ml；
s8.将50μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为50μmol/ml、60μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
s9.重复s8两次，冻存两种浓度下的细胞，将60μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为62μmol/ml、64μmol/ml、66μmol/ml、68μmol/ml、70μmol/ml；
s10.将70μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为70μmol/ml、80μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
s11.重复s10两次，冻存两种浓度下的细胞，将80μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为82μmol/ml、84μmol/ml、86μmol/ml、88μmol/ml、90μmol/ml；
s12.将90μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为90μmol/ml、100μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
s13.长期以100μmol/ml浓度维持细胞对溴隐亭的耐药性，冻存对数期细胞，即得大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株。
本发明还请求保护上述方法制备得到的大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株，利用cck8检测细胞株对溴隐亭的半数抑制率ic50，结果表明，由该方法制备得到的细胞株性能差异不显著、耐药性稳定，mmq/brc对溴隐亭的ic50约为亲本细胞mmq的5倍。
本发明还请求保护上述大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株在制备肿瘤耐药逆转剂或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供方法制备得到的大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株具有耐药性稳定的优点，可用于研究人泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞形态学及生物学特点；可用于在体外构建肿瘤耐药模型，研究肿瘤耐药机制及其相关信号通路的研究的细胞模型，分析抗肿瘤药物敏感性及筛选和评估抗肿瘤药物；还可用于制备肿瘤耐药逆转剂或药物，具有较高的科研和生产应用价值。
附图说明
图1为实施例1中mmq和mmq/brc的ic50；“***”表示p<0.005。
图2为实施例1中不同时间段mmq细胞和mmq/brc细胞上清中泌乳素表达水平；“n.s”表示无意义。
图3为实施例1中mmq/brc细胞和mmq细胞凋亡率，***p<0.005。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株mmq/brc的诱导建立
本发明是以大鼠泌乳素腺瘤mmq细胞作为亲本细胞，采用溴隐亭模拟人体内化疗过程，通过反复大剂量冲击联合逐步递增药物浓度的方法，诱导建立获得大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株mmq/brc。具体步骤如下：
（1）取大鼠泌乳素腺瘤mmq细胞系（购自协和细胞库），接种于含10%胎牛血清的dmemf12培养基中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的培养箱中培养；
（2）取对数期生长期mmq细胞或当细胞密度达到80%时，接种于含2μmol/ml终浓度溴隐亭的新鲜dmemf12培养基中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的培养箱中培养，观察细胞是否能在此浓度下的培养基中稳定生长、传代；
（3）按步骤（2）的方法进行培养并逐渐提高溴隐亭终浓度，依次为4μmol/ml、6μmol/ml、8μmol/ml、10μmol/ml，并冻存每个浓度下生长状态良好的细胞；
（4）将10μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为10μmol/ml、20μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
（5）重复步骤（4）两次，冻存两种浓度下的细胞；将20μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为22μmol/ml、24μmol/ml、26μmol/ml、28μmol/ml、30μmol/ml；
（6）将30μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为30μmol/ml、40μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
（7）重复步骤（6）两次，冻存两种浓度下的细胞，将40μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为42μmol/ml、44μmol/ml、46μmol/ml、48μmol/ml、50μmol/ml；
（8）将50μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为50μmol/ml、60μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
（9）重复步骤（8）两次，冻存两种浓度下的细胞，将60μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为62μmol/ml、64μmol/ml、66μmol/ml、68μmol/ml、70μmol/ml；
（10）将70μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为70μmol/ml、80μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
（11）重复步骤（10）两次，冻存两种浓度下的细胞，将80μmol/ml终浓度下的细胞继续培养并提高溴隐亭终浓度，依次为82μmol/ml、84μmol/ml、86μmol/ml、88μmol/ml、90μmol/ml；
（12）将90μmol/ml终浓度下的细胞传代成两瓶，添加溴隐亭，终浓度分别为90μmol/ml、100μmol/ml，继续培养并观察细胞状态；
（13）长期以100μmol/ml浓度维持细胞对溴隐亭的耐药性，冻存对数期细胞，即得大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株mmq/brc。
将鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株mmq/brc冻存于液氮中。冻存液由70%胎牛血清、20%dmem、10%dmso培养液组成。冻存过程逐步降温，采取4℃10min→-20℃20min→-80℃过夜→液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下步骤进行：将水浴锅设置37℃预热；在15ml离心管中加入5ml以上含10%胎牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴中轻轻摇动使冻存物在1min内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后放入超净台；将解冻后的细胞悬液移入加有dmem培养液的离心管中，稍加摇匀，于1000r/min离心5min；弃去上清，加入新鲜培养基重悬细胞，接种于25cm2细胞培养瓶，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5%co2、饱和湿度条件下培养。
对制备得到的大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株mmq/brc进行形态学观察及生物学特性鉴定，结果发现，耐药细胞株呈圆形，胞核较大，悬浮聚团生长。
实施例2mmq和mmq/brc细胞生长曲线及耐药指数的测定
分别测定大鼠泌乳素腺瘤细胞株和大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株的生长曲线及耐药指数，具体步骤如下：
1、取生长状态良好的大鼠泌乳素腺瘤细胞株（mmq）和大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株（mmq/brc）细胞，于1000rpm/min离心5min，用无血清的dmem/f12培养基重悬，调整细胞密度为1×105/ml。两种细胞各分为空白对照组（仅加入培养基）、阴性对照组（细胞未加药）和实验组，以每孔90μl的体积接种于96孔板中，无血清饥饿培养12h后用于实验。
2、将溴隐亭溶解于dmem/f12培养基中，浓缩液浓度为500μm，储存于-20℃冰箱。使用时将原液稀释到各个浓度，每孔加入10μl稀释好的药物，每个浓度设置三个重复孔，重复3次以上，空白对照组加入同等体积的无血清培养基，实验重复3次。
3、药物梯度稀释，作用48h后，每个孔中加入10μlcck8，放置于37℃培养箱中避光孵育2～4h，酶标仪于450nm波长测od值。
细胞生长抑制率按以下公式计算：
结果如图1所示，耐药细胞mmq/brc的半数抑制率（ic50）明显高于（约5倍）mmq的ic50，耐药指数约为5。
实施例3mmq和mmq/brc细胞prl分泌水平
采用elisa法分别测定大鼠泌乳素腺瘤细胞株和大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株中prl的表达水平，具体步骤如下：
1、取对数生长期的mmq、mmq/brc细胞，以1×106/ml的密度接种于6孔板，每孔2ml。分别于12、24、36、48h收集细胞，离心，取上清并贮存于-80℃。
2、用大鼠泌乳素elisa试剂盒检测收集上清中的prl，检测时首先将100μl样本和标准品加入相应的反应孔中，混匀后于37℃孵育2h，用洗涤液洗板5次。
3、加入100μl一抗，于37℃孵育1h，洗板5次。
4、每孔加100μl酶标二抗，于37℃孵育30min，洗板5次。
5、每孔加100μl底物工作液，于37℃暗处孵育15min，每孔加100μl终止液混匀；用酶标仪在450nm处测吸光度值（od值）。
6、根据标准品所做的标准曲线，得出样品od值对应的prl含量。计算变化率，应用以下公式：变化率(%)=（处理组prl浓度/对照组prl浓度）×100%。
结果如图2所示，mmq/brc和mmq细胞在12、24、36、48小时所分泌的rpl水平无明显差异。
实施例4mmq和mmq/brc细胞凋亡率
采用anneinv-fitc/pi流式细胞术检测mmq和mmq/brc细胞凋亡率，具体步骤如下：
1、取生长状态良好的mmq和mmq/brc细胞，于1000rpm/min离心5min，用无血清的dmem/f12培养基重悬，调整细胞密度为1×105/ml，以每孔2ml的体积接种于6孔板中，无血清饥饿培养12h后用于实验，共设两组：mmq组和mmq/brc组。另外还设有阴性组（调节细胞群）、单染pi组、单染annexinv-fitc组，后两组为调节补偿组，后面三组均未经药物处理。
2、每孔加入适当体积的溴隐亭溶液，使终浓度为25µmol/ml。
3、48h后，分别收集各组细胞于15ml离心管中，由于在ep管中离心时需要较大的离心力才能将细胞离心至管底，因此为减少物理因素对细胞的损害，选用15ml离心管在低速离心机中以2000rpm/min的速度离心5min来收集细胞，然后用pbs洗2次，于2000rpm/min离心5min，弃上清，留沉淀。
4、加入500µl的bindingbuffer重悬细胞，并加入5µlannexinv-fitc和5µlpi混匀，室温，避光反应10～15min。
5、在1h内用流式细胞仪检测。
结果如图3所示，两种细胞经终浓度为25µmol/ml的溴隐亭处理48小时后，mmq/brc的凋亡率约为26%，而mmq的凋亡率为64%。说明mmq/brc确实对溴隐亭有一定的耐受性。
实施例5
重新以大鼠泌乳素腺瘤mmq细胞作为亲本细胞，按照实施例1所述的诱导方法获得大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株a～d；经检测，所述耐药细胞株a～d均呈圆形，胞核较大，悬浮聚团生长，与耐药细胞株mmq/brc差异不显著；所述耐药细胞株a～d的耐药指数分别为5、5.2、5.1、4.9，与溴隐亭耐药细胞株mmq/brc差异不显著；所述耐药细胞株a～d、耐药细胞株mmq/brc、mmq细胞在12、24、36、48小时所分泌的rpl水平无明显差异；所述耐药细胞株a～d经终浓度为25µmol/ml的溴隐亭处理48小时后的凋亡率分别为25%、26%、26%、25%，与耐药细胞株mmq/brc差异不显著；上述结果说明，本发明实施例1建立的大鼠泌乳素腺瘤溴隐亭耐药细胞株诱导方法重复性好，获得的耐药细胞株性能稳定，具有较高的科研和生产应用价值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式一一列举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。