本发明涉及treg细胞分离技术领域，具体为一种改良的高效的人自体treg细胞分离扩增方法。
背景技术
cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞(regulatorytcell，treg)是一种具有免疫调节功能的细胞群，可通过抑制自身反应性t细胞的免疫反应、抑制传统t细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式。
treg能分泌il-10、tgf-b.表达foxp3及ctla-4分子等，通过细胞间直接接触或细胞因子间接方式抑制自身反应性t细胞的免疫反应、抑制传统t细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、抑制过度自身免疫反应、诱导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式，并与免疫调节、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植免疫耐受、母胎免疫耐受等诸多方面有着密切的联系。因此，treg细胞是目前国内外研究的热点。
现有技术采用直接抽血的方法，如需最终达到治疗剂量，每次采血量要求在200ml以上，（其中的pbmc部分最熟练的操作人员、应用质量最好的pbmc分选试剂也仅能达到10^8个数量级），即使这样也有高达1/3的患者采血后无法最终获得足够的治疗剂量的细胞导致后续治疗计划流产。而多次、大量采血最终需要的只是其中全血中的白细胞中的单个核细胞中的一小部分细胞成分，其他血成分都被浪费，同样也达不到单次输注百万级（10^6个）treg细胞的治疗剂量需求。
当前，国内外已有不少前期基础研究及临床试验表明，自体treg分离、扩增、回输技术有望成为治疗自身免疫性疾病如1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、风湿性疾病、移植后免疫耐受等临床上很多棘手疾病状况的有效手段，相比糖皮质激素、免疫抑制剂及其他调节免疫功能的生物制剂，其在安全性、低副作用、有效性方面都有长足优势。然而，自体treg细胞在外周血比例较少（这在患者中表现更突出）、分离效率低、扩增困难，最终导致细胞的低得率的成为限制treg细胞免疫治疗方法的主要瓶颈。本方案即旨在解决treg细胞分离得率低的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种改良的高效的人自体treg细胞分离扩增方法，该改良的高效的人自体treg细胞分离扩增方法具体步骤如下：
s1：通过1-2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000ml的外周血，获得10^9-10^10数量级的pbmcs，取分离好的pbmcs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，300g离心10分钟，弃干上清液去除死细胞；
s2：标记非cd4+细胞：
1）用90ulmacsbuffer重悬（每107细胞）后，加入10ulbiotinlabeledcocktail抗体，混匀，4℃孵育10min，
2）加入20ulanti-biotinmicrobeads，4℃孵育15min，
3）加入1mlmacsbuffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，
4）加500ulbuffer重悬；
s3：ld分离柱阴选除去noncd4+细胞：
1）取ldcolumn分离柱置于磁场stand上的大分选器（separator，紫色）上，加2mlbuffer润洗，
2）加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1mlbuffer洗两遍，收集流过分离柱来的所有细胞悬液（即cd4+细胞悬液）包括洗液；
s4：抗体标记cd25+细胞：
1）上述cd4+细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90ulbuffer重悬（每107细胞），
2）加10ulanti-cd25microbeads（每107细胞），充分混匀，4℃孵育15min，
3）加1mlbuffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，
4）加500ulbuffer重悬即得到抗cd25磁珠标记的细胞悬液；
s5：ms柱阳选cd25+细胞：取ldcolumn分离柱置于磁场stand上的小分选器（separator，绿色）上，加500ulbuffer润洗。
优选的，s3中细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入500lbuffer洗3次，收集流过分离柱来的细胞悬液（即tresp细胞：cd4+cd25-细胞悬液）。
优选的，s5中将ms柱移除磁场，置于收集的ep管，加1mlbuffer立即塞上活塞将细胞悬液挤出收集到无菌ep管，即为纯化的treg细胞（cd4+cd25+细胞）。
优选的，分选得到的细胞用流式细胞仪鉴定纯度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过1-2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000ml的外周血，获得10^9-10^10数量级的pbmcs，轻松得到传统采血办法100倍以上的单个核细胞，并且由于其他血成分直接回输，避免浪费，对患者总血成分、血细胞计数影响更轻微；
2、仍然采用macs分选方案，在分离前pbmcs基数较大的前提下，通过直接标记cd4细胞后阳性选择cd4+t细胞，能得到10^9数量级的cd4+t细胞（流式细胞分析纯度在85%以上）；
3、继续将上述得到的cd4+t细胞，采用阳性分选cd4+cd25+的办法，最终可以获得10^7数量级的cd4+cd25+treg细胞；
4、上述分选的细胞，继续应用申报人博士论文记述的抗体包被磁珠孵育体外激活（24h）、扩增treg细胞（48h），磁场中去除磁珠后细胞可用于下一步treg回输治疗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种改良的高效的人自体treg细胞分离扩增方法，该改良的高效的人自体treg细胞分离扩增方法具体步骤如下：
s1：通过1-2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000ml的外周血，获得10^9-10^10数量级的pbmcs，取分离好的pbmcs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，300g离心10分钟，弃干上清液去除死细胞；
s2：标记非cd4+细胞：
1）用90ulmacsbuffer重悬（每107细胞）后，加入10ulbiotinlabeledcocktail抗体，混匀，4℃孵育10min，
2）加入20ulanti-biotinmicrobeads，4℃孵育15min，
3）加入1mlmacsbuffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，
4）加500ulbuffer重悬；
s3：ld分离柱阴选除去noncd4+细胞：
1）取ldcolumn分离柱置于磁场stand上的大分选器（separator，紫色）上，加2mlbuffer润洗，
2）加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1mlbuffer洗两遍，收集流过分离柱来的所有细胞悬液（即cd4+细胞悬液）包括洗液；
s4：抗体标记cd25+细胞：
1）上述cd4+细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90ulbuffer重悬（每107细胞），
2）加10ulanti-cd25microbeads（每107细胞），充分混匀，4℃孵育15min，
3）加1mlbuffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，
4）加500ulbuffer重悬即得到抗cd25磁珠标记的细胞悬液；
s5：ms柱阳选cd25+细胞：取ldcolumn分离柱置于磁场stand上的小分选器（separator，绿色）上，加500ulbuffer润洗。
具体的，s3中细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入500lbuffer洗3次，收集流过分离柱来的细胞悬液（即tresp细胞：cd4+cd25-细胞悬液）。
具体的，s5中将ms柱移除磁场，置于收集的ep管，加1mlbuffer立即塞上活塞将细胞悬液挤出收集到无菌ep管，即为纯化的treg细胞（cd4+cd25+细胞）。
具体的，分选得到的细胞用流式细胞仪鉴定纯度。
本发明减少了表达式中繁杂的特殊参数，使表达式逻辑更清晰，加大了部件的使用能力，使支持部件自身的特殊参数等能被调用从而扩展出更多样的使用方式。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。