本发明属于细胞培养领域，具体提供一种人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞系及其构建方法，并提出细胞系的应用价值。
背景技术
1.唾液腺腺样囊性癌
唾液腺腺样囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，简称sacc)占口腔颌面部恶性肿瘤的27％，好发于腮腺及舌下腺。sacc病程发展缓慢，主要致死原因为sacc的嗜神经侵袭及远端器官转移。
2.肿瘤微环境
肿瘤的发生发展受到多种因素的调控，其中肿瘤微环境作为重要的调控因素得到深入研究。肿瘤微环境指肿瘤细胞、间质细胞、可溶性细胞因子等及其周围的细胞外基质包裹共同形成的微环境。肿瘤微环境中存在多种类型的间质细胞，包括成纤维细胞、癌相关成纤维细胞、血管内皮细胞、骨髓来源的间充质干细胞及免疫细胞。其中癌相关成纤维细胞是较为重要的细胞类型。
3.癌相关成纤维细胞的来源及研究现状
3.1癌相关成纤维细胞(carcinoma-associatedfibroblasts，简称cafs)，通过激活自分泌及旁分泌信号，参与肿瘤的侵袭转移。cafs来源广泛，主要包括以下途径：(1)宿主成纤维细胞激活；(2)上皮细胞间充质转化；(3)血管内皮细胞。由于cafs的来源复杂，鉴定cafs时常通过多种生物学标记物联合使用。现阶段cafs的生物学标记物为：平滑肌肌动蛋白-α、成纤维特异性蛋白、成纤维活化蛋白。cafs参与肿瘤的发生发展。chen等发现肺癌来源的cafs通过分泌胰岛素样生长因子ii/胰岛素样生长因子受体，激活nanog旁分泌途径调控肿瘤干细胞的生长。转移方面，研究人员发现cafs通过分泌mmps及趋化因子，重构肿瘤细胞所处的ecm并促进肿瘤细胞的定向迁移能力。
3.2sacc来源的cafs研究现状
近年来，研究人员已经证实sacc中存在cafs细胞，并参与sacc的侵袭及转移。lijiao等通过原代提取联合多重生物学标记物提取鉴定cafs。通过微流控芯片技术发现，sacc来源的cafs位于肿瘤细胞前沿，构建侵袭通道促进定向侵袭。
4.细胞株的构建
细胞株是生物学体外研究不可或缺的研究对象，是指经过原代提取并能长期传代培养的细胞，传代数不低于40代。细胞株的构建方法常为以下两种：(1)细胞选择法；(2)单细胞克隆法。成功构建的细胞株需要进行多种生物学特征的验证，包括：(1)细胞株亲源dna指纹鉴定；(2)细胞株形态学成像及组织特异性抗原鉴定；(3)生长及增殖能力鉴定；(4)支原体等污染源排除。
技术实现要素：
本发明的目的是建立人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa，并提出其生物医学研究中的应用价值。
本发明中所述人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa已经在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏日：2017年3月29日，保藏编号：cctccno:c201745。
本发明中人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的建立包括以下步骤：
(1)原代细胞caf-a1传代培养至第10代时，通过多次(优选两次)有限稀释法筛选单细胞并克隆培养形成细胞系；
(2)经过细胞免疫荧光实验检查人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞标记物vimentin、fap、fsp-1、α-sma的表达。
本发明所述人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的构建，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：
(a)原代提取细胞连续培养至第10代，消化并进行细胞计数，以200个细胞为初始接种至96孔板第一个孔；
(b)通过有限稀释法，逐步将细胞等比稀释，依次接种至下一个孔内，以此类推；
(c)等比稀释后标记单一细胞培养孔，并连续培养10天，收集由单一细胞形成的克隆，并进行传代培养，扩大细胞数。
其中，原代细胞为外科手术切除组织提取的cafs细胞，命名为caf-a1。
本发明所述人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的构建，其特征在于，步骤(1)有限稀释法使用的培养液配置如下：基础培养液为dmemf12(hyclone)、10％胎牛血清(sciencell)、1％青霉素-链霉素溶液(hyclone)、10ng/ml成纤维细胞生长因子(protech)、1％htmediasupplement(hyclone)。
本发明还提供了所述人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的应用，其特征在于：
(1)应用于唾液腺腺样囊性癌增殖研究；
(2)应用于唾液腺腺样囊性癌迁移、侵袭和转移研究；
(3)应用于唾液腺腺样囊性癌血管新生研究。
本发明中通过细胞免疫荧光染色鉴定细胞系的panck、vimentin、fap、fsp-1、α-sam的表达情况。
本发明中通过划痕实验、transwell小室实验、微流控芯片诱导实验、小管形成实验及裸鼠皮下移植瘤实验证实cafs细胞系的应用前景。
本发明的有益效果为：本发明成功构建人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系，为唾液腺腺样囊性癌研究及药物研发提供了良好的实验模型。
附图说明
图1唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维包原代培养、克隆培养及细胞系传代培养的明场成像图(scalebar＝500μm)。
图2人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系的生物学标记物鉴定(scalebar＝20μm)，依次为：panck、vimentin、α-sma、fap、fsp-1。
图3人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系促进肿瘤细胞的迁移(scalebar＝200μm)。
图4人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系促进肿瘤细胞的侵袭(scalebar＝200μm)。
图5人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系促进肿瘤细胞的增殖。
图6人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系促进血管内皮细胞的小管形成(scalebar＝200μm)。
具体实施方式
实施例1
人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系的构建及鉴定：
(1)临床标本：取自大连医科大学附属第一医院口腔外科手术切除标本。
(2)原代细胞提取及细胞系构建的试剂：dmemf121:1(hyclone)、10％胎牛血清(sciencell)、1％青霉素-链霉素溶液(hyclone)、10ng/ml成纤维细胞生长因子(protech)、1％htmediasupplement(hyclone)、ⅰ型胶原酶(lifetechnology)、一型胶原(lifetechnology)、胰蛋白酶(gibco)。
(3)原代细胞提取及培养方法：
将术中取下标本放置冰冻pbs中，运输至超净台。冲洗组织，去除坏死、脂肪及非肿瘤组织。使用组织剪，将组织剪至5×5×5mm3碎块，离心收集组织沉淀。使用ⅰ型胶原酶重悬组织沉淀，混匀后，放置37℃恒温消化2小时。使用100目细胞筛过滤消化得到的细胞悬液，1500rpm离心10分钟。使用细胞完全培养液重悬细胞，接种至ⅰ型胶原包被过的培养皿中。待细胞生长融合度达到90％时，使用胰蛋白酶对细胞进行传代培养，并进行冻存。
(4)人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的构建：
原代细胞培养液中添加成纤维细胞生长因子，通过生长依赖去除上皮细胞。原代细胞消化时，收集消化1分钟的细胞，接种至培养皿，静止1小时后，轻摇培养皿并去除上清，对贴壁细胞进行培养。初步纯化的细胞培养至第10代时，消化细胞，细胞计数后以500个细胞为初始，接种至96孔板第一排。利用有限稀释法，将上一个孔中的1/2体积的细胞悬液移至下一个孔，以此类推，直至稀释出现单细胞，停止稀释，对单细胞进行培养。连续培养单细胞，每隔3天进行换液，直至单细胞克隆灶形成，对其进行扩增培养，并冻存。
(5)人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的鉴定：
pbs冲洗细胞爬片，并在4％多聚甲醛条件下室温固定20分钟。使用山羊血清封闭非特异性抗原。滴加一抗，并于4℃进行抗体孵育。pbs冲洗后，孵育荧光标记二抗。使用dapi进行复染，并封片拍照。
实施例2
人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa促进肿瘤细胞的增殖：
将sacc细胞系sacc-83和sacc-lm以500个细胞接种至6孔板。分别使用人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞系来源的条件培养液及正常培养液诱导肿瘤细胞。诱导7天后，使用4％多聚甲醛固定细胞。使用结晶紫进行细胞染色拍照，统计克隆灶数量。
通过balb/c裸鼠背部皮下注射肿瘤细胞(共1×106个细胞)或肿瘤细胞联合caf-sa细胞(共1×106个细胞)，连续观测4周，记录原位肿瘤的大小，评价caf-sa促进肿瘤增殖的能力。
实施例3
人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa促进肿瘤细胞的迁移：
实验中使用pdms构建划痕实验磨具。将sacc-lm及sacc-83细胞系接种至磨具的两个培养孔中，待细胞贴壁后取下磨具，使用pbs冲洗细胞后更换人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞系的条件培养液及正常培养液作为对照。连续诱导3天后，拍照并进行数据统计。
实施例4
人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系促进肿瘤细胞的侵袭：
实验中将基质胶按照1:8的比例包被transwell小室，并上室接种1.5×104个肿瘤细胞。小室下层加入caf-sa的条件培养液，连续培养3天。通过结晶紫染色，拍照记录侵袭至对侧的肿瘤细胞，评价caf-sa促进肿瘤细胞侵袭的能力。
实验中使用transwell小室及微流控芯片模型考察人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞系促进肿瘤细胞的侵袭的能力。将metrigel按照1:8稀释后包被至小室上层，并在上层接种sacc-lm和sacc-83细胞系，小室下层添加人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞系的条件培养液及正常培养液。诱导48小时后使用多聚甲醛固定细胞，并使用结晶紫对细胞进行染色。擦去上层细胞后拍照。将微流控芯片中间通道接种metrigel，待基质胶凝固后在左侧通道接种sacc-lm和sacc-83细胞系，另一侧添加条件培养液或正常培养液。诱导3天结束时使用鬼笔环肽对细胞进行染色，荧光倒置显微镜拍照统计数据。
实施例5
人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系促进血管内皮细胞的小管形成：
使用metrigel包被96孔板，将培养10代以内的人脐静脉血管内皮细胞消化后使用条件培养液或正常培养液重悬，以每孔10000个细胞接种至96孔板，连续培养0h、6h、12h、24h后镜下观察并记录小管形成情况。
以上发明内容结合优选的实验方法进行实验操作及说明，其目的是为sacc基础研究提供体外研究的实验模型，不能认定本发明的具体操作实施只局限于本说明。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。