本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法。
背景技术
中国是世界上养猪最多的国家之一，由于猪与人的亲缘关系近，其生理生化指标与人类相似，因而经常被用来研究人类的生殖发育机制。
精原干细胞(spermatogonialstemcells,ssc)是哺乳动物体内唯一可以将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。在早期研究中，sscs一直被认为是单能的，而实际上ssc在培养过程中能够自主重编程形成es样多潜能干细胞，尽管自发重编程的效率相对较低，因此，精原干细胞也被认为是一种多潜能细胞的理想来源，其可以向多种细胞类型分化，包括平滑肌细胞、血管内皮细胞、卵母样细胞、肝干细胞样细胞、肾实质细胞、神经元样细胞、神经上皮样细胞等。
如今，体外培养小鼠以及一些别的物种的精原干细胞已经实现。1998年，brinster等首次报道了关于精原干细胞的长期培养，研究表明，过表达gdnf会使精原细胞快速增殖，而干扰gdnf则会使精原细胞数量减少，这项发现随后迅速促进了精原干细胞培养基的优化与筛选。筛选行之有效的精原干细胞体外培养体系对于研究精子发生相关的作用机制必不可少。截止到目前，已报道的主要有四种小鼠精原干细胞的培养体系，而猪等家养动物长期培养sscs的稳定体系还没有建立，特别是当sscs进行无饲养层培养时。猪作为一种重要的模式动物，建立和完善猪精原干细胞(pssc)的培养体系非常重要。已有的精原干细胞长期培养体系并不能完全实现猪精原干细胞的体外长期培养，因此我们需要优化psscs的体外培养体系，为探索其生物学特性奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其通过筛选不同的细胞外基质以及将化学小分子物质应用于猪的精原干细胞长期培养，在体外可将猪的精原干细胞培养至三个月。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2d赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，将猪的精原干细胞体外培养至两个月并维持较好精原干细胞特性。
一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2d赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加chir99021，repsox以及cd脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月并维持较好精原干细胞特性。
所述的的2d赛天然人工合成多肽基质涂层为一种商品化的人工合成的多肽，应用于猪的精原干细胞的无饲养层培养。
一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1)猪睾丸原代细胞的分离：
采用两步酶消化法，经连续两次差异贴壁，通过多能性干细胞染料cdy1对分离富集得到的猪精原干细胞鉴定；
2)精原干细胞的培养与传代：
当猪的精原干细胞生长密度达到80-90％时，进行传代，首先，轻柔操作，弃去原培养液，随后用pbs清洗一次，加入1-1.5ml0.25％的胰蛋白酶于37℃消化3-5min，取出后用高糖dmem(10％fbs)终止消化，轻柔吹打之后收集细胞悬液于离心管中，1200rpm离心5min，随后用配制好的猪精原干细胞培养液重悬，接种于预先处理好的细胞培养板。
所述的细胞培养板处理方法为：多聚赖氨酸包被培养皿至少4h，之后将培养板用pbs洗两次并自然干燥。明胶(0.1％)包被培养皿1h，随后用pbs洗涤一次待用。层粘连蛋白包被的平板(10μl/ml)1h。10μl/ml层粘连蛋白包被培养皿1h后，接种细胞。2d赛天然试剂盒含有组分a和b。培养板孔中加入液体a温育10min。吸出液体a后，加入成分b，温育1h备用。
猪精原干细胞的培养液的配制方法为：dm/f12基础液用于配制500ml完全培养基，加入10％ksr,1％neaa，5％fbs,0.1％的β-巯基乙醇(1000×)，1％的l-谷氨酰胺浓缩液(100×)，用磁力搅拌器充分混匀后，于0.22μm的滤器过滤除菌，分装于20/50ml的瓶中，4℃保存，每次使用前依次加入lif，bfgf，egf，gdnf；所述的各因子终浓度均为20ng/ml。
一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于具体包括以下操作：
1)50ml离心管中加入pbs(双抗100x)，放置于冰盒中，75％酒精清洗猪睾丸一次，随后用添加双抗的pbs洗两次，剪去附睾，脂肪等，接着剪去白膜，中间多次更换手术器械，留下一部分样品用pfa固定用于包埋切片，剩余睾丸组织于玻璃60皿中剪碎，添加适量ⅳ型胶原酶(2mg/ml),待组织剪至细腻且无肉眼可见组织块时，加入1:1:1的ⅳ型胶原酶(2mg/ml)；dnase(20μg/ml)；dispase(2mg/ml)，37℃培养箱消化，中途多次摇晃，15min后取出，用枪头挑一挑，至不再粘稠，转移至50ml离心管中，并加入约30mlpbs，颠倒混匀之后自然沉降5min，肉眼可见底部粉色组织块沉淀，将除组织块之外的液体转移至新的离心管，300g离心5min，弃上清，用pbs将底部白色曲细精管反复清洗离心两次，以除去间质细胞及红细胞，随后加入5ml胰蛋白酶，吹打混匀，37℃培养箱消化5min，取出后，用20μl移液枪取一滴于培养皿中，镜检，当观察到80％以上曲细精管已消化开时，终止消化(血清或者等体积完全培养液)，离心弃上清，完全培养液重悬，即可接种培养皿，随后每隔两小时进行一次差异贴壁，连续两次，进行猪精原干细胞培养。
2)从第60d时即加入各种化学小分子组合，涉及的小分子包括：chir99021(c)，repsox(r)，am580(a)，sgc0946(s)，vc(v)，叶酸(f)以及脂质(l)，总共包括六个实验组，分别为：cr(chir99021，repsox)；cras(chir99021，repsox，am580，sgc0946)；crv(chir99021，repsox，vc)；crf(chir99021，repsox，叶酸)；crl(chir99021，repsox，lipid)和crasf(chir99021，repsox，am580，sgc0946，叶酸)组，每天半量换液，均采用tryple(gibco)消化细胞。第一代后，每隔3-6d，将细胞继传代并在24孔板中培养，每组重复三次。
3)pkh26标记猪精原干细胞进行异种移植：胰蛋白酶消化细胞，将2×107个细胞加入15ml离心管中，以400×g离心5min；去除上清液，保证细胞块中剩余的液体少于25μl；加入1ml稀释液c，标记前，准备4×10-6m的pkh26染料(用稀释剂c稀释)并置于离心管中，然后尽快将1ml细胞加入到1ml染料中，并立即将样品进行吹打混合，之后于25℃孵育2min，加入等体积血清终止反应，孵育1min，细胞400×g，25℃离心10min，随后将细胞转移至新管中并洗涤三次，保证无多余染料残留，离心，重新悬浮；用载玻片，滴加一滴于荧光显微镜下检测标记效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1)本发明通过筛选不同的细胞外基质后，使用2d赛天然作为细胞培养基质，在体外可将猪的精原干细胞培养至两个月，在培养过程中观察到两种不同的克隆形态。一种与典型的小鼠胚胎干细胞克隆类似，呈现ap阳性，将其用不同的培养体系进行亚培养时，依旧可以再次形成ap阳性致密克隆。另一种为典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，前者极有可能提供一种猪多能性干细胞获得的新方法；
2)本发明首次将化学小分子物质应用于猪的精原干细胞长期培养，通过筛选不同的化学小分子组合，最终确定chir99021，repsox以及cd脂质浓缩物可以使猪精原干细胞培养时间从两个月延长至三个月，细胞活力较好，依旧维持上皮状生长，并保持较好精原干细胞特性，细胞免疫荧光结果证明其依旧可以表达典型精原干细胞标记如pgp9.5等；
3)本发明确定了猪的精原干细胞异种移植到小鼠曲精小管后的潜在命运。发现psscs异种移植到无精症小鼠的睾丸中，可在不育小鼠生精小管中增殖以及自我更新，维持其未分化状态，但不能进一步向下游发生减数分裂。psscs移植后不能进行减数分裂并进一步在小鼠曲精小管中形成精子，这可能是由于啮齿动物与猪之间的种属差异过大造成的。
附图说明
图1多能性标记cdy1检测分离猪精原干细胞阳性率
图2显示peptide-coating2d有助于猪精原干细胞的特性维持；
图3不同代次猪精原干细胞标记检测；
图4不同化学小分子组合的筛选延长猪精原干细胞培养时间；
图5cck8检测添加不同化学小分子后精原干细胞活力；
图6细胞免疫荧光检测添加chir99021，repsox，以及脂质复合物之后猪精原干细胞的特性；
图7phk26标记精原干细胞效果检测；
图8收样后标记红色荧光观察；
图9石蜡切片免疫荧光检测异种移植后猪精原干细胞特性。
具体实施方式
本发明提供一种精原干细胞体外无饲养层培养方法，是以2d赛天然人工合成多肽作为猪精原干细胞体外培养基质，发现其有助于猪的雄性生殖干细胞未分化状态的维持，可以使猪的精原干细胞培养至两个月，进一步筛选不同的化学小分子物质，最终确定chir99021，repsox以及脂质复合物结合作用有助于猪精原干细胞的长期培养，可进一步将猪的精原干细胞体外培养至三个月，细胞依旧保持较好活力以及上皮样形态生长，特性良好，将其用标记染料pkh26标记后，异种移植于小鼠曲细精管中后，依旧保持增殖以及自我更新能力，但不能进行正常的减数分裂。
本发明以2d赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加chir99021，repsox以及cd脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月。
所述的的2d赛天然人工合成多肽基质涂层为一种商品化的人工合成的多肽，可应用于干细胞的无饲养层培养。
所述的猪精原干细胞在培养过程中呈现出两种克隆形态，一种与小鼠胚胎干细胞克隆类似，另一种为典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，前者极有可能提供一种猪多能性干细胞获得的新方法。
所述的化学小分子包括chir99021，repsox以及cd脂质浓缩物等，可以使猪精原干细胞培养时间从两个月延长至三个月，并维持较好精原干细胞特性。
本发明猪的精原干细胞体外无饲养层培养方法包括以下步骤：
1、猪睾丸原代细胞的分离：
采用两步酶消化法，经连续两次差异贴壁，通过多能性干细胞染料cdy1对分离富集得到的猪精原干细胞鉴定。
2、精原干细胞的培养与传代：
当猪的精原干细胞生长密度达到80-90％时，进行传代，首先，轻柔操作，弃去原培养液，随后用pbs清洗一次，加入1-1.5ml0.25％的胰蛋白酶于37℃消化3-5min，取出后用高糖dmem(10％fbs)终止消化，轻柔吹打之后收集细胞悬液于离心管中，1200rpm离心5min，随后用配制好的猪精原干细胞培养液重悬，接种于预先处理好的培养皿。所述的细胞培养板处理为：多聚赖氨酸包被培养皿至少4h，之后将培养板用pbs洗两次并自然干燥。明胶(0.1％)包被培养皿1h，随后用pbs洗涤一次待用。层粘连蛋白包被的平板(10μl/ml)1h。10μl/ml层粘连蛋白包被培养皿1h后，接种细胞。2d赛天然试剂盒含有组分a和b。培养板孔中加入液体a温育10min。吸出液体a后，加入成分b，温育1h备用。
3、猪的精原干细胞培养体系为：
dm/f12基础液用于配制500ml完全培养基，加入10％ksr,1％neaa，5％fbs,0.1％的β-巯基乙醇(1000×)，1％的l-谷氨酰胺浓缩液(100×)，用磁力搅拌器充分混匀后，于0.22μm的滤器过滤除菌，分装于20/50ml的瓶中，4℃保存，每次使用前依次加入lif，bfgf，egf，gdnf，终浓度为20ng/ml。
4、试验中主要涉及的化学小分子包括：
chir99021(c)，repsox(r)，am580(a)，sgc0946(s)，vc(v)，叶酸(f)以及脂质(l)。所有组均应用2d赛天然涂层作为基质涂层。从培养第60d时即加入各种化学小分子组合，总共包括六个组，分别为：cr(chir99021，repsox)；cras(chir99021，repsox，am580，sgc0946)；crv(chir99021，repsox，vc)；crf(chir99021，repsox，叶酸)；crl(chir99021，repsox，lipid)和crasf(chir99021，repsox，am580，sgc0946，叶酸)组，每天半量换液。均采用tryple(gibco)消化细胞。第一代后，每隔3-6d，将细胞继传代并在24孔板中培养，每组重复三次。
本发明本发明精原干细胞体外无饲养层培养方法具体包括以下操作步骤：
1、50ml离心管中加入pbs(双抗100x)，放置于冰盒中，75％酒精清洗猪睾丸一次，随后用添加双抗的pbs洗两次，剪去附睾，脂肪等，接着剪去白膜，中间多次更换手术器械，留下一部分样品用pfa固定(用于包埋切片)，剩余睾丸组织于玻璃60皿中剪碎，添加适量ⅳ型胶原酶(2mg/ml),待组织剪至细腻且无肉眼可见组织块时，加入1:1:1的ⅳ型胶原酶(2mg/ml)；dnase(20μg/ml)；dispase(2mg/ml)，37℃消化，中途多次摇晃，15min后取出，用枪头挑一挑，至不再粘稠，转移至50ml离心管中，并加入约30mlpbs，颠倒混匀之后自然沉降5min，肉眼可见底部粉色组织块沉淀，将除组织块之外的液体转移至新的离心管，300g离心5min，弃上清，用pbs将底部白色曲细精管反复清洗离心两次，以除去间质细胞以及红细胞，随后加入5ml胰酶，吹打混匀，37℃培养箱消化5min，取出后，用20μl移液枪取一滴于培养皿中，镜检，当观察到80％以上曲细精管已消化开时，终止消化(血清或者等体积完全培养液)，离心弃上清，完全培养液重悬，即可接种培养皿，随后每隔两小时进行一次差异贴壁，连续两次；
2、用不同细胞外基质处理培养皿，主要包括：多聚赖氨酸包被培养皿至少4h，之后将培养板用pbs洗两次并自然干燥。明胶(0.1％)包被培养皿1h，随后用pbs洗涤一次待用。层粘连蛋白包被的平板(10μl/ml)1h。10μl/ml层粘连蛋白包被培养皿1h后，接种细胞。2d赛天然试剂盒含有组分a和b。培养板孔中加入液体a温育10min。吸出液体a后，加入成分b，温育1h备用，分别接种差异贴壁后的猪精原干细胞。
3、结合多能性染料cdy1阳性率统计，确定分离得到的猪精原干细胞比率为80％以上。利用2d赛天然试剂盒进行猪的精原干细胞长期培养，结合免疫荧光与半定量对精原干细胞特异性标记进行检测，发现可将猪的精原干细胞体外培养至2个月，在此基础上，进一步筛选一些化学小分子物质，最终发现chir99021，repsox以及cd脂质浓缩物的组合使用可以使猪精原干细胞培养时间从两个月延长至三个月，并维持较好的精原干细胞特性。
4、通过将猪的精原干细胞移植到小鼠曲细精管中探索其潜在的发育分化潜能。主要移植了两组细胞，分别为刚分离纯化的猪精原干细胞与培养三个月的猪精原干细胞(添加chir99021，repsox，脂质复合物组)。在将细胞注入睾丸前，为了显示受体曲细精管中供体细胞的定位，采用红色荧光染料(pkh26；sigma)标记猪的精原干细胞。
实施例：
以下通过对猪精原干细胞的分离培养鉴定，以及细胞形态特征、标志物的基因及免疫荧光鉴定等试验来做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、猪精原干细胞的分离以及纯化
20日龄的关中黑猪睾丸，采自于杨凌区农户，经过连续两次差异贴壁，多能性染料cdy1鉴定发现精原干细胞阳性率为80％以上(图1)。
2、不同细胞外基质的筛选：
主要包括四种基质的筛选，多聚赖氨酸包被培养皿至少4小时，之后将培养板用pbs洗两次并自然干燥。明胶(0.1％)包被培养皿1小时，随后用pbs洗涤一次待用。层粘连蛋白包被的平板(10μl/ml)1小时。10μl/ml层粘连蛋白包被培养皿1小时后，接种细胞。2d赛天然试剂盒含有组分a和b。培养板孔中加入液体a温育10分钟。吸出液体a后，加入成分b，温育1小时备用。将分离纯化得到的猪精原干细胞接种于处理好的培养板上，进行培养；采用的培养基成分为：dm/f12基础液用于配制500ml完全培养基，加入10％ksr,1％neaa，5％fbs,0.1％的β-巯基乙醇(1000×)，1％的l-谷氨酰胺浓缩液(100×)，用磁力搅拌器充分混匀后，于0.22μm的滤器过滤除菌，分装于20/50ml的瓶中，4℃保存，每次使用前依次加入lif，bfgf，egf，gdnf，终浓度为20ng/ml。在2d赛天然基质上碱性磷酸酶阳性克隆可以更好的维持其未分化状态(图2)，
对培养不同代次的猪精原干细胞标记pgp9.5进行检测，根据genebank中的猪的pgp9.5cdna序列，用primer设计pgp9.5引物序列为：
上游引物：gatgctgaacaaagtgttgg
下游引物：gagtttccgatggtctgctt
1.1.1.pcr反应程序为：
发现其表达良好(图3)。
3、不同化学小分子组合的筛选：
在2d赛天然基质上可将猪的精原干细胞培养至三个月并且维持较好特性，在此基础上，筛选了不同的化学小分子组合(图4)，结合吉姆萨染色可以更好的观察猪精原干细胞形态。
4、猪精原干细胞的特性鉴定。
进一步对添加了化学小分子的不同细胞组进行细胞活力检测(图5)，利用cck-8cellcountingkit检测试剂盒，参照其说明书具体操作如下：
(1)细胞接种：按照说明书要求96孔板中每组接种5个重复，每孔接种5000个细胞，37℃培养箱中静置培养。另外准备空白孔调零用。
(2)小分子刺激：接种细胞过夜贴壁后，加入含有不同小分子的完全培养基，处理24h。
(3)染色液配制：按照每孔加入100μldm/f12完全培养基+10μlcck-8预混染色液。
(4)cck-8孵育：弃旧培养基，pbs洗1次，每孔加入110μl染色液，放回37℃培养箱中孵育1h。
(5)od值测定：在450nm波长下测定各孔吸光值。每个处理的重复孔取其平均值。
(6)细胞活力计算：细胞活力＝(处理组细胞od-空白组od)/(对照组细胞od-空白组od)×100％。
5、细胞免疫荧光检测猪精原干细胞特征。
48孔板培养的各处理组细胞弃培养基，pbs清洗1次，每孔加入250μl4％多聚甲醛固定液室温固定15min。弃固定液，pbs清洗3次，加入250μl0.1％tritonx-100室温细胞膜打孔10min(若检测靶蛋白在细胞膜定位则跳过此步骤)。pbs清洗3次，加入250μl1％bsa室温封闭30min。弃封闭液，加入100μl稀释好的一抗，4℃孵育过夜。弃一抗，pbs清洗3次，根据一抗来源加入100μl与之对应的稀释好的荧光标记二抗，37℃孵育1h。弃二抗，pbs清洗3次，加入250μl1μg/mlhoechst33342染液，室温避光5min。pbs清洗3次，荧光显微镜下照相记录。具体结果如图六所示，添加化学小分子物质chir99021，repsox，以及脂质复合物之后培养三个月，猪精原干细胞依旧可以表达标记物如cd90，cd49f，pgp9.5等。
6、磷脂双分子层结合染料pkh26标记长期培养的猪精原干细胞。
通过将猪的精原干细胞移植到小鼠曲细精管中探索其潜在的发育分化潜能。主要移植了两组细胞，分别为刚分离纯化的猪精原干细胞与培养三个月的猪精原干细胞(添加chir99021，repsox，lipid组)。在将细胞注入睾丸前，为了显示受体曲细精管中供体细胞的定位，我们采用了用红色荧光染料(pkh26；sigma)标记猪的精原干细胞，标记结果如(图7)所示，pkh26标记猪精原干细胞操作过程为胰蛋白酶消化细胞，将2×107个细胞加入15ml离心管中，以400×g离心5分钟。去除上清液，保证细胞块中剩余的液体少于25μl。加入1ml稀释液c，标记前，准备4×10-6m的pkh26染料(用稀释剂c稀释)并置于离心管中。然后尽快将1ml细胞加入到1ml染料中，并立即将样品进行吹打混合，之后于25℃孵育2分钟，加入等体积血清终止反应，孵育1分钟，细胞400×g，25℃离心10分钟，随后将细胞转移至新管中并洗涤三次，保证无多余染料残留，离心，重新悬浮。用载玻片，滴加一滴于荧光显微镜下检测标记效率。
7、曲细精管移植及冰冻切片结果观察
实验小鼠体重均在25g至30g之间，经白消安处理四周造模之后，将用pkh26标记的pssc注射到生精小管中，每只小鼠移植20万细胞，每组有7个重复，八周后，进行采样。新鲜的睾丸样品用4％的pfa固定，30％的蔗糖脱水48h，于-25℃用包埋剂包埋，在冰冻切片机内切片，贴附于粘附载玻片，室温放置3分钟后，pbs清洗3次，每次5分钟。hoechest33342染细胞核约3分钟，pbs清洗2次，每次5分钟，封片，于荧光显微镜下观察(图8)。
8、异种移植后特性检测
收样后，进行了石蜡切片免疫荧光检测，具体过程如下：
经60℃烘片4-8小时，二甲苯ⅰ脱蜡8分钟(加热至40-60℃)，二甲苯ⅱ脱蜡8分钟。梯度酒精复水：100％酒精6分钟，95％酒精6分钟，75％酒精6分钟，蒸馏水2分钟。进行抗原修复：将切片置于0.1mol/l且ph＝6.0的柠檬酸抗原修复液中，用微波炉中火加热10分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。用pbs2分钟×2次，用滤纸擦去标本外的pbs。滴加1％bsa在湿盒中37℃封闭30分钟。用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜，再用pbs3分钟×5次，洗去一抗，用滤纸擦去标本外的pbs。滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1-1.5小时。用pbs3分钟×3次，洗去二抗，用滤纸擦去标本外的pbs。滴加hoechst33342避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光。用pbs1分钟×3次洗去hoechst33342，用滤纸擦去标本外的pbs。最后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，并在荧光显微镜下立即观察。
免疫荧光结果显示，移植猪的精原干细胞后，小鼠的曲细精管中的细胞排列与正常小鼠管腔截然不同，已经丧失了正常的各级生精细胞有序排列的结构，并且无法观察到精子存在。大部分供体细胞均为生殖细胞标记vasa蛋白阳性，可观察到明显的细胞串，表现出分化的精原细胞形态(图9)。