一种治疗小儿热性惊厥的药物组合物的制备方法与流程

本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种治疗小儿热性惊厥的药物组合物的制备方法。
背景技术：
热性惊厥是小儿时期最常见的惊厥性疾病，在小儿惊厥中占50％左右，在6岁以下儿童的发病率将近5％。热性惊厥易于复发，并因为复发次数较多，可造成不同程度的脑损伤，引起脑组织病理学变化，从而导致幼儿智力发育障碍，甚至癫痫的发生。研究表明，神经元损伤、兴奋性氨基酸递质与抑制性氨基酸递质失衡是热性惊厥产生的原因之一。因此，本发明依次为切入点开发出治疗小儿热性惊厥的新药。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种治疗小儿热性惊厥的药物组合物的制备方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种治疗小儿热性惊厥的药物的制备方法，该方法可以包括下列步骤：步骤a：0℃下，向7-氮杂吲哚的乙二醇二甲醚中分批加入85％间氯过氧苯甲酸，约30分钟加完，加完慢慢升室温反应16小时，反应完毕，加入正己烷，搅拌30分钟，过滤收集固体，将固体加入碳酸钾溶液，在冰水浴冷却下搅拌1小时，过滤，水洗，干燥得到产物7-氧代-7-氮杂吲哚；步骤b：0℃下，向7-氧代-7-氮杂吲哚和六甲基二硅氮烷的四氢呋喃溶液中滴加氯甲酸乙酯，加完升至室温反应过夜，反应完毕，减压浓缩，余物倒入甲醇中，加入2mol/l的氢氧化钠溶液，室温搅拌2小时，减压浓缩，余物乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。余物经硅胶柱进行色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚梯度10-20％洗脱，得到产物6-氯-7-氮杂吲哚；步骤c：室温下，向6-氯-7-氮杂吲哚中滴加浓氨水，加完封管加热至120℃下反应5小时。反应完毕，冷却，过滤得到褐色固体产物6-氨基-7-氮杂吲哚；步骤d：室温下，向6-氨基-7-氮杂吲哚的正丁醇中滴加50％氯乙醛水溶液。加完加热至120℃下反应5小时。反应完毕，减压浓缩，余物加水，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。余物经硅胶柱进行色谱纯化得到白色固体产物1h-咪唑并[1,2-a]吡咯并[3,2-e]吡啶。本发明还提供化合物在制备治疗小儿热性惊厥的药物中的用途，所述化合物具有下列结构：本发明药物的治疗机制是通过延长热性惊厥患者惊厥潜伏期，缩短惊厥持续时间，减轻惊厥严重程度，抑制海马神经元凋亡，并调节gaba与g1u水平，减轻热性惊厥患者脑损伤，最终达到治疗热性惊厥的目的。附图说明图1是各组大鼠海马神经元凋亡程度比较。图2是各组大鼠海马组织中caspase3活性及glu含量的比较。图3是各组大鼠海马组织中gaba蛋白表达的比较。a.模型组；b.本发明药物低剂量组；c.本发明药物中剂量组；d.本发明药物高剂量组。具体实施方式下面通过实施例详细说明本发明药物的治疗效果。实验例1本发明药物1h-咪唑并[1,2-a]吡咯并[3,2-e]吡啶的合成路线：步骤a：7-氧代-7-氮杂吲哚0℃下，向7-氮杂吲哚(5.00g，0.042mol)的乙二醇二甲醚(80ml)中分批加入85％间氯过氧苯甲酸(8.59g,0.042mol)，约30分钟加完。加完慢慢升室温反应16小时。反应完毕，加入正己烷(40ml)，搅拌30分钟，过滤收集固体。将固体加入2mol/l的碳酸钾溶液(25ml)，在冰水浴冷却下搅拌1小时。过滤，水洗，干燥得到产物(4.00g,70％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.54-6.57(m,1h),7.04-7.06(m,1h),7.43-7.45(m,1h),7.60-7.64(m,1h),8.09-8.11(m,1h),12.40(br,1h)。步骤b：6-氯-7-氮杂吲哚0℃下，向7-氧代-7-氮杂吲哚(4.00g，0.030mol)和六甲基二硅氮烷(8ml)的四氢呋喃溶液(50ml)中滴加氯甲酸乙酯(6.64g，0.030mol)。加完升至室温反应过夜。反应完毕，减压浓缩，余物倒入甲醇(50ml)中，加入2mol/l的氢氧化钠溶液(25ml)，室温搅拌2小时，减压浓缩，余物乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。余物经硅胶柱进行色谱纯化,用乙酸乙酯/石油醚梯度(10-20％)洗脱，得到产物(3.20g,70％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.50-6.53(m,1h),7.11(d,1h),7.33-7.35(m,1h),7.91(d,1h),10.50(br,1h)。步骤c：6-氨基-7-氮杂吲哚室温下，向6-氯-7-氮杂吲哚(3.20g，0.024mol)中滴加浓氨水(40ml)，加完封管加热至120℃下反应5小时。反应完毕，冷却，过滤得到褐色固体产物(2.00g,72％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.00(br,2h),6.35-6.39(m,2h),7.28-6.98-7.00(m,1h),7.70(d,1h),8.90(br,1h)。步骤d：1h-咪唑并[1,2-a]吡咯并[3,2-e]吡啶室温下，向6-氨基-7-氮杂吲哚(2.00g，0.015mol)的正丁醇(10ml)中滴加50％氯乙醛水溶液(1.18g，0.048mol)。加完加热至120℃下反应5小时。反应完毕，减压浓缩，余物加水，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。余物经硅胶柱进行色谱纯化得到白色固体产物(1.00g,42％)。。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ6.80-6.82(m,1h),7.28-7.31(m,2h),7.58-7.65(m,3h),12.00(br,1h)。实验例2本发明药物治疗小儿热性惊厥的效果热性惊厥大鼠模型建立、分组及观察指标参考文献(许先科，邵征洋，叶育双，等.防惊汤对热性惊厥大鼠惊厥复发的影响[j].中医杂志，2015.56(4)：332-334.)，进行热水浴试验，温度为47℃，在5min内大鼠发生惊厥即选为试验大鼠。将选出的40只合适的大鼠随机分为模型组及本发明药物低、中、高剂量组[5、10、20mg/(kg·d-1)]，于热性惊厥试验前灌胃，模型组灌胃生理盐水10ml/kg·d-1，本发明药物低、中、高剂量组分别灌胃实施例1药物5、10、20mg/kg·d-1，然后进行47℃热水浴试验，每天惊厥1次，共惊厥5d。观察每组大鼠惊厥潜伏期、惊厥持续时间、惊厥级别。惊厥潜伏期指大鼠放入热水中即刻至发生惊厥的时间，记录单位为秒(s)。惊厥持续时间指大鼠由刚开始发生惊厥至惊厥停止的时间，记录单位为秒(s)。惊厥级别能够反映惊厥发生的严重程度，具体标准为：0级，没有发生惊厥；ⅰ级，点头，眨眼等面部抽动行为；ⅱ级，有节律性的点头；ⅲ级，前肢阵挛，抽搐；ⅳ级，全身强直；ⅴ级，全身强直，跌倒。标本采集：大鼠用10％水合氯醛注射麻醉后，断头取脑，于冰浴上钝性分离大鼠双侧海马脑组织，在液氮罐中保持。caspase3(天冬氨酸水解酶)活性及glu(谷氨酸)含量测定：海马组织匀浆后，取上清液，分别根据试剂盒说明书进行测定。tunel法检测海马神经元凋亡取海马组织标本，按照tunel试剂盒说明书进行操作。每个标本海马组织切片，在200倍显微镜目镜下随机选取5个视野进行计数，其中阳性细胞呈棕色或棕褐色，分别计数细胞总数及阳性细胞数，取其平均值，细胞凋亡指数(ai)＝每个视野tunel染色后阳性的细胞数/每个视野细胞总数×100％。westernblot检测gaba蛋白表达取海马组织标本，按比例加入ripa(10μg/ml)裂解液和蛋白酶抑制剂裂解，每隔10min置于涡旋仪中震荡30s，40min后离心，吸取上清液，获得总蛋白。采用bca试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品热变性后上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2h，接着湿法转膜30～50min。5％脱脂奶粉进行封闭1h，一抗溶液(gaba，稀释浓度为1:100)孵育，4℃冰箱过夜；二抗室温摇床中孵育1h后，在凝胶成像系统中曝光。最后用“quantityone”软件统计各抗体条带灰度值。统计学分析采用spss17.0统计软件进行分析，计量资料用表示，两组间比较用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。各组大鼠惊厥潜伏期(s)、惊厥持续时间(s)比较与模型组比较，本发明药物低、中、高剂量组惊厥潜伏期显著延长，惊厥持续时间显著降低，差异均有统计学意义(p<0.01)。结果见下表。组别潜伏期持续时间模型组227±25126±12低剂量组240±36108±10中剂量组261±2799±8高剂量组272±2691±7各组大鼠惊厥程度(只)比较与模型组比较，本发明药物低、中、高剂量组中大鼠惊厥程度显著降低，差异均有统计学意义(p<0.01)。各组大鼠海马神经元凋亡程度比较与模型组比较，本发明药物低、中、高剂量组中神经元凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(p<0.01)。见图1。各组大鼠海马组织中caspase3活性及glu含量的比较与模型组比较，本发明药物低、中、高剂量组中caspase3活性及glu含量均显著降低，差异均有统计学意义(p<0.01)。见图2。各组大鼠海马组织中gaba蛋白表达的比较与模型组比较，本发明药物低、中、高剂量组中gaba表达量均显著提高，差异均有统计学意义(p<0.01)。见图3。当前第1页12