本发明涉及的是一种新型离子交换功能的整体凝胶复合材料的绿色制备方法及用于高效分离人血清中蛋白质和小分子物质，属于功能整体材料的制备及生物样品前处理领域。
技术背景
具有三维（3d）结构的凝胶聚合物整体材料具有特殊性质，例如大且互通的孔（10-100μm），高孔隙率、良好的弹性和渗透性，能在不同模具中成型等。然而它们也表现出一些重要的缺陷，比如，需在零度以下才能聚合反应，缺乏活性高且水溶性好的功能单体或交联剂用于制备性能优异的凝胶，比表面积低导致吸附量低等，从而限制了更广泛的应用。为了克服这些缺陷，大多数改进的新方法中，不可避免地使用大量的有机溶剂，操作复杂或繁琐，反应条件苛刻等。此类方法不仅不能满足绿色化学的发展需要，更不适合进一步用于实施绿色分析化学（gac）的原则来建立绿色的样品前处理方法。
目前，不论是在学术研究还是实际的应用中，在检测血清中的药物、代谢物或癌症标记物等一些小分子物质时，基质中大分子蛋白质等干扰物的分离都是必不可少的环节。而蛋白沉淀则是使用最广泛的生物样品前处理方法，常常用于分离样品中的蛋白质和小分子物质。然而，这种方法不仅使用有机溶剂，污染环境和危害人类健康，而且如果蛋白质沉淀不完全，则会产生仪器污染、色谱柱损坏和信号干扰等一系列问题。因此，为了解决这些问题并遵守实施绿色分析化学（gac）的原则，研究者们根据不同的分析物，建立了各种各样的生物样品前处理方法，如固相微萃取（spme）。然而，在制备spme材料过程中，遵守实施绿色化学的原则也同等重要，不能被忽略。因此，将gac与绿色化学原则相结合，绿色法制备功能化凝胶并作为固相萃取剂建立一种绿色的样品前处理方法，用于高效分离血清中的蛋白质和小分子物质，同时减少其他基质的干扰，以期代替传统的蛋白质沉淀法是一项十分重要且具挑战性的技术。
技术实现要素：
鉴于上述，本发明的目的在于提供一种新型离子交换功能的整体凝胶复合材料的绿色制备方法。
本发明的另一目的是整体凝胶复合材料用于高效分离人血清中的蛋白质和小分子物质。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现。
一种新型离子交换功能的整体凝胶复合材料的绿色制备方法，其步骤是：
以2.0ml的离心管为模具，以水为溶剂，以2-羟基乙基甲基丙烯酸酯为基本单体，以有季铵基的二烯丙基二甲基氯化铵为交联剂，单体和交联剂两者质量之和占总质量的8%，单体和交联剂摩尔比为3:1，将溶剂、单体和交联剂混合均匀，氮气鼓泡除氧10分钟，用移液枪均匀移取0.3ml混合液于模具中，再分别加入10μl体积比为10%四甲基乙二胺和10μl质量分数比为5%过硫酸铵水溶液，随后在零下20℃的冰箱中进行自由基聚合反应24h；反应完毕，混合溶液变成含有季铵基的整体凝胶材料，室温下解冻，凝胶内部的冰晶融化成水，凝胶形成三维互通的大孔，二次水清洗，制备出凝胶ⅰ；然后，将整体凝胶ⅰ依次分别放入0.5mg/ml含有羧基的氧化石墨烯go和质量分数为2.5%含有胺基的聚乙烯亚胺b-pei水溶液中自组装，对凝胶ⅰ的大孔表面修饰，超声30min后用二次水洗去未组装的go或b-pei，重复自组装两次，制备出整体凝胶复合材料ⅱ；最后，凝胶ⅱ置于1mnaoh水溶液中，利用凝胶ⅱ上的胺基与0.8m2-溴-n,n-二乙基乙胺氢溴酸盐de-br在60℃下反应30min，反应结束，材料用10mmph7.4磷酸缓冲溶液和二次水清洗，制备出整体凝胶复合材料pdc/go-de。
整体凝胶复合材料用于高效分离人血清中蛋白质和小分子物质，其步骤是：
在注射器的底部放置一块筛板，防止萃取过程中凝胶移动，将凝胶pdc/go-de作为萃取吸附剂装入注射器中，填装好的注射器安装在固相萃取真空装置上；0.1ml已解冻人血清，0.1ml2μg/ml标准小分子物质溶液，0.8ml10mmph7.4pbs溶液，三者混合均匀，制备出1.0ml200ng/ml加标人血清样品；0.1ml已解冻人血清，0.9ml10mmph7.4pbs溶液，两者混合均匀，制备出空白人血清样品；将制备好的样品上载到上述注射器中进行动态萃取分离，时间为10min，流出液用考马斯亮蓝显色，并用紫外光谱仪在595nm处检测血清中蛋白的萃取率；对于加标样品，回收的小分子物质溶液用氮吹浓缩后用于lc-ms检测分析并计算小分子物质回收率。
本发明的优点和产生的有益效果：
一、在绿色制备新型整体凝胶复合材料pdc/go-de方面：
（1）首次利用廉价的2ml的塑料离心管为模具，用移液枪移取相同体积的反应液进行批量化制备，以解决冷冻凝胶制备后再剪切可能破坏凝胶的问题；（2）首次以高活性且水溶性良好的二烯丙基二甲基氯化铵为新型交联剂，制备出具有阴离子交换功能的凝胶ⅰ；（3）首次利用静电作用自组装，简便的将氧化石墨烯和聚乙烯亚胺修饰在凝胶ⅰ上，成功制备出整体凝胶复合材料ⅱ；（4）首次制备出同时具有阴、阳离子交换功能的整体凝胶复合材料pdc/go-de，且该凝胶具有类似三维氧化石墨烯的大孔结构和混合的亲疏水性；（5）整个制备过程中，只以水为溶剂，不会对环境产生污染，也不会危害人类的健康。（6）整个反应条件温和、无需高温、高压及反复除氧；（7）整体材料，无需反复干燥和离心，实现低能耗、低成本，满足绿色化学发展的需求。
二、在整体凝胶复合材料pdc/go-de用于分离人血清中蛋白质和小分子物质方面：
（1）将凝胶pdc/go-de填装在注射器中进行动态萃取分离，简化操作，克服了粉体材料需反复离心的缺陷；（2）人血清样品在生理条件（ph7.4）下进行萃取，无需再调节ph；（3）仅稀释10倍的人血清样品，10分钟内可将大于95％的蛋白质一次性吸附，萃取时间短稀释倍数低；（4）凝胶重复使用3次后，血清中蛋白质的吸收率仍高于90％，具有良好重复使用性和生物相容性；（5）凝胶可有效去除人血清样品中黄色脂类基质及降低基质在质谱上的信号，提高了质谱的灵敏度；（6）向血清样品中添加4种典型的小分子标准物（200ng/ml），分离后小分子标准物的回收率与蛋白沉淀法的进行了比较，结果较满意，均高于65％。本发明法不仅实现了高效分离人血清中蛋白质和小分子物质，而且避免了使用有机试剂，建立了一种绿色高效的样品前处理方法。
附图说明
图1为本发明绿色制备新型离子交换功能的凝胶整体复合材料及用于高效分离人血清中蛋白质和小分子物质的示意图，其中反应条件a：-20℃，24h；b：凝胶ⅰ分别在go和b-pei水溶液超声自组装30min；c：凝胶ⅱ与0.8mde-hbr和1mnaoh反应30min；d：凝胶pdc/go-de装入注射器中用于高效分离人血清中蛋白质和小分子物质。
图2为本发明中单体he与新交联剂dc的不同摩尔比对制备凝胶ⅰ影响的实物照片图。
图3为本发明中对比不同的摩尔比（he:dc=9:1,5:1,3:1）所制备的凝胶ⅰ萃取牛血清白蛋白（bsa）性能。
图4为本发明中对比凝胶ⅰ、凝胶ⅱ和凝胶pdc/go-de萃取bsa的性能。其中，go和b-pei的自组装次数是三次。
图5为本发明中go和b-pei自组装次数对凝胶pdc/go-de萃取bsa性能的影响。
图6为本发明中凝胶pdc/go-de萃取bsa的时间影响。
图7为本发明中新型离子交换功能的凝胶整体复合材料的实物照片图，其中a：凝胶ⅰ(左)；凝胶pdc/go-de(右)；b：凝胶pdc/go-de剖视图。
图8为本发明中新型离子交换功能的凝胶整体复合材料的sem谱图，其中a：凝胶ⅰ；b：凝胶pdc/go-de；c：凝胶pdc/go-de上的氧化石墨烯go。
图9为本发明中所用go的表征，其中a：tem图；b：go水溶液（左）和纯水（右）在环烯共聚物板上的接触角；c：xrd图。
图10为本发明中go，凝胶ⅰ和凝胶pdc/go-de的ftir光谱（a）和tga（b）图。
图11为本发明中所用的10种小分子物质的化学结构。
图12为本发明中以bsa为蛋白模型，以喜树碱（cpt）为小分子模型，凝胶pdc/go-de对其混合物的竞争性萃取性能。其中（a）bsa和cpt的混合物在不同时间下的竞争性萃取；（b）选择性萃取和洗脱的uv光谱图。
图13为本发明中将凝胶pdc/go-de填装到注射器中吸附人血清中蛋白质的uv光谱图（a）和sds-page图（b），其中（a）的插图是不同的血清样品与考马斯亮蓝溶液显色后的实物照片图，a：未经处理的血清；b：蛋白质沉淀法处理后的血清；c：本发明法处理后的血清；d：考马斯亮蓝原溶液。而在（b）中，lane1：稀释10的原始血清；lane2：蛋白沉淀法处理后的血清；lane3：凝胶被第三次洗脱后的蛋白溶液；lane4：凝胶被第二次洗脱后的蛋白溶液；lane5：凝胶被第一次洗脱后的蛋白溶液；lane6：本发明法处理后的血清。
图14为本发明中将凝胶pdc/go-de填装到注射器中萃取人血清中蛋白质的重复使用性。
图15为本发明中使用本发明法（a）和蛋白沉淀法（b）处理掉空白人血清样品中蛋白质后其他干扰基质分析图，其中（a）图里的插图是不同的血清样品的实物照片图，a：原始空白血清；b：蛋白质沉淀法处理后的血清；c：稀释10倍的血清；d：本发明法处理后的血清。
图16为本发明中对本发明法和蛋白质沉淀法用于分析血清中加标小分子物质的lc-ms色谱图，其中1：标准物；2：蛋白质沉淀法；3：本发明法。a：喜树碱；b：利巴韦林；c：1-甲基-3-苯基丙胺；d：氧氟沙星。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明技术方案再做进一步说明：
实施例1
图1a-c为本发明绿色制备新型离子交换功能的整体凝胶复合材料的示意图，以2.0ml的离心管为模具，以水为溶剂（3.265ml），以0.19ml2-羟基乙基甲基丙烯酸酯为基本单体，以0.145ml有季铵基的二烯丙基二甲基氯化铵为交联剂，单体和交联剂两者质量之和占总质量的8%，单体和交联剂摩尔比为3:1，将溶剂、单体和交联剂混合均匀，氮气鼓泡除氧10分钟，用移液枪均匀移取0.3ml混合液于模具中，再分别加入10μl体积比为10%的四甲基乙二胺和10μl质量分数比为5%的过硫酸铵水溶液，随后在零下20℃的冰箱中进行自由基聚合反应24h（图1a）；反应完毕，混合溶液变成含有季铵基的整体凝胶材料，室温下解冻，凝胶内部的冰晶融化成水，凝胶形成三维互通的大孔，二次水清洗，制备出凝胶ⅰ。其次，如图1（b）所示，根据静电作用原理，将整体凝胶ⅰ依次分别放入0.5mg/ml含有羧基的氧化石墨烯go和质量分数为2.5%含有胺基的聚乙烯亚胺b-pei水溶液中自组装，对凝胶ⅰ的大孔表面修饰，超声30min后用二次水洗去未组装的go或b-pei，重复自组装两次，制备出整体凝胶复合材料ⅱ。最后，如图1（c）所示，将凝胶ⅱ置于1mnaoh的水溶液中，利用凝胶上的胺基与0.8m的2-溴-n,n-二乙基乙胺氢溴酸盐de-br在60℃下反应30min，反应结束，材料用10mmph7.4磷酸缓冲溶液和二次水清洗，制备出整体凝胶复合材料pdc/go-de。凝胶pdc/go-de上含有大量的季铵基、伯胺基、仲胺基、叔胺基和二乙胺基乙基有阴离子交换能力，而其羧基有阳离子交换能力。如图1d所示，以绿色凝胶pdc/go-de为固相萃取剂建立一种新的绿色样品前处理方法，用于高效分离血清中的蛋白质和小分子物质，同时减少其他基质的干扰。在2.5ml注射器的底部放置一块筛板，防止萃取过程中凝胶移动，并将凝胶pdc/go-de作为萃取吸附剂装入注射器中，填装好的注射器安装在固相萃取真空装置上；0.1ml已解冻人血清，0.1ml2μg/ml标准小分子物质溶液，0.8ml10mm，ph7.4pbs溶液，三者混合均匀，制备出1.0ml200ng/ml加标人血清样品；0.1ml已解冻人血清，0.9ml10mmph7.4pbs溶液，两者混合均匀，制备出空白人血清样品；将制备好的样品上载到上述注射器中进行动态萃取分离，时间为10min，流出液用考马斯亮蓝显色，并用紫外光谱仪在595nm处检测血清中蛋白的萃取率；对于加标样品，回收的小分子溶液用氮吹浓缩后用于lc-ms检测分析并计算小分子回收率。其分离机理为：（1）整体凝胶复合材料pdc/go-de在ph7.4条件下同时具有阴、阳离子交换能力，可与血清中带不同电荷的蛋白质进行离子交换，进而将蛋白质萃取到凝胶材料上；（2）而凝胶上的氧化石墨烯与蛋白质之间的π-π和疏水作用；（3）凝胶的大孔结构有助于其选择性尺寸分离。
①下面进一步具体说明本发明中整体凝胶复合材料pdc/go-de制备条件的优化。
以静态形式萃取，首先优化新型冷冻凝胶的制备条件，如单体与交联剂的摩尔比（he：dc）及go和b-pei的自组装次数，随后进一步利用最优的凝胶考察对bsa的萃取时间。由于白蛋白占人血清总蛋白质含量的50％，因此选择bsa作为模型蛋白进行研究。即将一块凝胶放在3mlbsa（0.6mg/ml，9.0×10-6m）磷酸盐缓冲液（pbs，10mm，ph7.4）中，室温下震荡30分钟。凝胶萃取到的bsa用1ml的1mnacl的pbs溶液进行洗脱，并重复三次。其结果通过紫外-可见分光光度计法，在波长278nm下测定分析。蛋白萃取和洗脱率分别由以下公式计算：
(1)萃取率：
(2)洗脱率：
其中，a为凝胶萃取到的蛋白质量；a'：洗脱液中的蛋白质量；as：萃取前蛋白标准的初始量。绿色制备新型凝胶的最优条件如下所示：
ⅰ单体he与新交联剂dc的摩尔比
表1单体he与新交联剂dc的不同摩尔比对制备凝胶ⅰ的影响
图2和表1为本发明中单体he与新交联剂dc的不同摩尔比对制备凝胶ⅰ的影响。只有当he与dc的摩尔比大于等于1:1时，凝胶才能成稳定形状，而只有当he与dc的摩尔比大于等于3:1时，凝胶有良好的弹性和机械性能，其孔隙率均在大于60%。对比当he与dc的摩尔比大于等于3:1所制备的凝胶萃取bsa的性能如图3所示。图3中显示，随着dc用量的增加，所制备的凝胶ⅰ萃取性能越好。最优的是he：dc=3:1，其所制备的凝胶萃取率约63％，这主要是由于新型交联剂dc带有季铵盐阳离子官能团，在ph7.4的缓冲溶液中，与带负电荷的bsa进行阴离子交换，从而萃取到bsa。而三种材料bsa的洗脱率均超过90％，这表明新型凝胶具有很好可逆吸附性能和生物相容性，可重复使用。综合考虑，以he与dc的摩尔比为3:1制备凝胶ⅰ为最佳方案。
ⅱ比凝胶ⅰ、凝胶ⅱ和凝胶pdc/go-de对bsa萃取的性能
为进一步提高凝胶ⅰ对bsa的萃取性能，对凝胶ⅰ进行了不同修饰并考察对bsa的萃取性能如图4所示，萃取性能：凝胶pdc/go-de>凝胶ⅱ>凝胶ⅰ。这是由于凝胶ⅱ上引入氧化石墨烯和b-pei后，其go和bsa之间具有良好的疏水和π-π相互作用，而b-pei上的伯胺基、仲胺基和叔胺基在ph7.4时可与bsa进行阴离子交换，从而提高了萃取bsa的性能。由于凝胶pdc/go-de引入de-br，在ph7.4时可与bsa进行阴离子交换，所以进一步提高了萃取性能，萃取性能最高，大于90%。所有凝胶均获得了令人满意的洗脱率，这表明凝胶材料仍具有可逆吸附性能，可重复使用。
ⅲgo的自组装次数
进一步研究go和b-pei自组装次数对凝胶pdc/go-de萃取bsa性能的影响，如图5所示。当自组装两次时，凝胶pdc/go-de对bsa的萃取率达到最大，继续增加自组装次数并不能明显的提高bsa的萃取率，表明go和b-pei自组装在凝胶ⅰ上的量已达到饱和。
ⅳ萃取bsa时间
研究凝胶pdc/go-de对bsa的静态萃取时间，结果如图6所示。凝胶对bsa的萃取如此快速，在5分钟时萃取率已接近100%，达到平衡。因此，凝胶pdc/go-de完全可以用于动态萃取。
②本发明通过下面的扫描电镜sem、ftir、tga、元素分析和比表面积分析对制备的新型离子交换功能的凝胶整体复合材料进行了表征，证明该材料制备成功。
ⅰ新型凝胶实物图
新型凝胶实物图如图7所示，白色的凝胶ⅰ经氧化石墨烯修饰后，制备出内外均已成黑色的类似三维氧化石墨烯的凝胶pdc/go-de，说明go成功地自组装到凝胶ⅰ三维孔洞的表面，且凝胶的弹性能均良好。
ⅱsem分析
图8为扫描电镜sem显示的新型凝胶复合材料的微观结构。从图8（a）凝胶ⅰ具有连续且互通的三维大孔聚合物网络，孔径约为10至100μm之间不等。而从图8（b-c）可以看出，凝胶pdc/go-de的孔洞内壁表面出现片状的氧化石墨烯，进一步证明go的成功上载。而本发明中所用的氧化石墨烯是通过二次氧化制备而成。所制备的go为单层、呈单晶态且具有很好的亲水性，这些特点都有利于go成功自组装到凝胶ⅰ上，如图9所示。
ⅲ比表面积分析
凝胶复合材料的比表面积，如表2所示：
表2为本发明中制备的新型凝胶的比表面积分析。
表2表明，凝胶pdc/go-de的bet的比表面积是凝胶ⅰ的两倍，而对比其bjh比表面积则是八倍。显然，凝胶pdc/go-de增加的比表面积进一步证明了go成功自组装在凝胶ⅰ。
ⅳftir、元素分析和tga分析
利用ftir和元素分析进一步确认新型凝胶整体复合材料的成功制备。如图10（a）所示，在ftir光谱中，出现3434cm-1（-oh伸缩振动），2943cm-1和2886cm-1（甲基振动），1729cm-1（羰基），1451cm-1（ch不对称变形振动n-ch3）和1026cm-1（季铵基团）的吸收峰，结果表明成功制备出具有季铵盐官能团的凝胶ⅰ。而在go和凝胶pdc/go-de的红外谱图中，在1661cm-1处出现具有代表性的c=c（芳香族）伸缩振动吸收峰，表明go在凝胶ⅰ上成功自组装。为进一步证明聚乙烯亚胺（b-pei）和2-溴-n,n-二乙基乙胺氢溴酸盐（de-br）成功嫁接到凝胶上，利用元素分析（表3）作进一步分析。
表3为本发明中所制备的不同凝胶的元素分析（n，c和h）。
凝胶ⅰ经含有大量胺基的b-pei自组装后所制备的凝胶ⅱ，其n（wt％）含量增加约1.8倍，而进一步被含有二乙胺基乙基的de-br修饰后，其n（wt％）含量增加约2.8倍，进一步说明了凝胶pdc/go-de的成功制备。从图10（b）的tga的结果分析，凝胶ⅰ在205℃时质量已损失6.7%，而凝胶pdc/go-de在231.3℃时质量才损失7.3%，表明凝胶pdc/go-de比凝胶ⅰ具有更好的热稳定性，这主要源于go具有良好的热稳定性，进一步证明了go的成功上载。
③本发明以5种不同的蛋白质为模型蛋白，评估凝胶pdc/go-de的对蛋白质的动态萃取性能及验证萃取蛋白质的机理。
选择不同亲疏水性且在ph7.4条件下带不同电荷（不带电，负电和正电荷）的五种蛋白，将3.0ml的每种蛋白质的pbs溶液（ph7.4，0.6mg/ml）上载到如图1d所示的注射器中进行动态萃取，萃取时间为10min。凝胶萃取到的bsa用1ml的1mnacl的pbs溶液进行洗脱，并重复三次。其结果通过紫外-可见分光光度计法，在波长278nm下测定分析。蛋白萃取和洗脱率的分别按照上述公式（1）和公式（2）计算。五种蛋白质化学性质及凝胶pdc/go-de对其动态萃取的结果如表4所示。
表4五种蛋白质的化学性质及凝胶pdc/go-de对其动态萃取的结果。
从表4可以看出：（ph7.4）如bsa和转铁蛋白（分子量范围为77.0-66.4kda）都获得了较好的萃取率和洗脱率，这主要是由于制备的凝胶具有阴离子交换功能。对于血清样品中第二丰富蛋白，γ-球蛋白或igg的萃取和洗脱率均高于75％。由于部分该蛋白在ph7.4条件下部分呈不带电荷状态，所以萃取性能相对较低。此外，ph值为7.4时带正电荷的碱性蛋白溶菌酶的萃取率为33.6％，这是凝胶pdc/go-de对其物理吸附，以及凝胶上的go的羧基与溶菌酶进行阳离子交换作用引起的。所有结果表明，凝胶pdc/go-de的萃取蛋白的机理主要是阴/阳离子交换以及亲水/疏水相互作用。因此，本发明中所制备的新型凝胶有望真正用于实际样品血清分离中，无需调节ph，一次性萃取不同蛋白，解决了血清中蛋白的复杂性和各异性，从而使小分子可以保留在溶液中，以达到分离蛋白质和小分子物质的目的。
④本发明以10种不同的小分子物质为模型小分子，评估凝胶pdc/go-de对小分子物质的动态萃取性能及验证萃取小分子的机理。
为进一步评估凝胶pdc/go-de在动态萃取血清样品中的蛋白质时对小分子的影响，并阐明其作用机理，选择不同亲疏水性且在ph7.4条件下带不同电荷（不带电，负电和正电荷）的10种小分子物质进行动态萃取。它们的化学结构和其他化学性质分别列于图11和表5中。将3.0ml的每种小分子物质的pbs溶液（ph7.4，100μg/ml）上载到如图1d所示的注射器中进行动态萃取，萃取时间为10min。凝胶萃取到的小分子用1ml合适的解析溶剂进行洗脱，并重复三次。其结果通过紫外-可见分光光度计法，在相应波长下测定分析。小分子的萃取和回收率的分别按照上述实施例2中（1）和（2）公式计算。
表5为本发明中所用十种小分子物质的化学性质、解析溶剂和紫外检测波长。
表6为本发明中所用十种小分子的化学性质及凝胶pdc/go-de对其动态萃取结果。
表6表明使用该方法难以将蛋白质和高亲水性并带负电的小分子物质进行分离。而在ph7.4条件下不带零电荷的小分子物质，除喜树碱外，其萃取率都会随着疏水性的增加而增加。当小分子物质带电时，无论是带正电还是负电，萃取率都会随亲水性增加而增加。因而相对亲水的不带电荷的利巴韦林的萃取率最低（13.5％）。这些结果清楚地表明，对小分子的萃取机理较复杂，小分子的带电荷性和亲疏水性对其萃取性能有重要影响。因此，有必要进一步考察凝胶pdc/go-de对蛋白质和小分子物质的动态竞争萃取性能。
⑤本发明以bsa为模型蛋白，以喜树碱为模型小分子，评估凝胶pdc/go-de对混合物的动态竞争萃取性能。
为了更好地将凝胶pdc/go-de应用于实际样品人血清中，进一步评估该凝胶对蛋白质和小分子物质的动态竞争萃取性能。选择（0.6mg/ml，9.0×10-6m）bsa为模型蛋白质，喜树碱cpt（5μg/ml，14×10-6m）为小分子模型，将3.0mlbsa和cpt的混合pbs溶液（10mm，ph7.4）上载到如图1d所示的注射器中进行动态萃取，萃取时间为10min。凝胶萃取到的物质进行不同顺序的洗脱，洗脱液、洗脱时间5min和洗脱次数三次与之前相同。其结果通过紫外-可见分光光度计法，在相应波长下测定分析。萃取和回收率仍分别按照上述实施例2中公式（1）和公式（2）计算。
bsa与cpt的竞争萃取结果图12所示，当蛋白bsa被完全萃取时，小分子cpt只有45.2％左右被萃取，表明凝胶pdc/go-de对bsa的吸附能力比cpt高，具有分离蛋白质和小分子物质的潜力。对凝胶萃取到的混合物进行选择性洗脱。首先洗脱bsa，bsa能够被完全洗脱，随后凝胶上的cpt也能够被完全的洗脱下来，实现了选择性洗脱，cpt的回收率为83.2％。因此，理论上，凝胶pdc/go-de可以应用于实际样品血清中，用于选择性分离其蛋白质和小分子物质。而实验结果也得到了进一步的验证，如下所示。
⑥本发明以人血清为实际样品，评估凝胶pdc/go-de的动态萃取分离蛋白质和小分子物质的性能。
本发明法，样品：100μl已解冻人血清，100μl标准小分子物质溶液（2μg/ml），800μlpbs溶液（10mm，ph7.4），三者混合均匀（200ng/ml）。将制备好的样品上载到如图1d所示的注射器中进行动态萃取，时间为10min。流出液用考马斯亮蓝显色，并用紫外光谱仪在595nm处检测血清中蛋白的萃取率；对于加标样品，回收的小分子物质溶液用氮吹浓缩后用于lc-ms检测分析并计算小分子物质的回收率。
蛋白沉淀法，样品：100μl已解冻人血清，100μl标准小分子物质溶液（2μg/ml），800μl甲醇溶液，三者混合均匀（200ng/ml）。将制备好的样品在25℃恒温摇床振荡10min后，15000r/min离15min后，将上清液转移到另一个离心管中。上清液用考马斯亮蓝显色，并用紫外光谱仪在595nm处检测血清中蛋白的萃取率；对于加标样品，回收的小分子物质溶液用氮吹浓缩后用于lc-ms检测分析并计算小分子物质的回收率。
从图13（a）的插图，肉眼可见的观察到本发明法和蛋白质沉淀法处理人血清后的溶液，与考马斯亮蓝溶液显色后的颜色和考马斯亮蓝原溶液的颜色基本一样，说明两种方法的蛋白质去除率基本相同。进一步用紫外数据进行验证，从图13（a）的紫外检测结果可知，仅稀释10倍的人血清样品，本发明法10分钟内可将大于95％的蛋白质一次性快速吸附，与蛋白质沉淀法对比，结果基本相同，而本发明法避免了使用有机溶剂，更加绿色。对比图13（b）的sds-page图中的lane2和lane6的条带，基本一样，进一步说明本发明法与蛋白沉淀法去除蛋白的效果基本一样。如图14所示，对凝胶的重复使用性进行考察，凝胶反复的萃取人血清样品中的蛋白质并随后进行洗脱，在循环3次使用后凝胶仍表现出优异的萃取性能，其萃取率高于90％，表明凝胶具有良好重复使用性和生物相容性。
进一步对比分析两种方法分离掉空白血清样品中的蛋白质后其他干扰基质情况，如图15所示。从（a）的插图中，肉眼可见的观察到本发明法处理后的血清样品呈无色透明，而蛋白沉淀法处理后的血清样品基本保持了稀释原血清后的淡黄颜色，说明凝胶pdc/go-de还可以减少血清样本中脂类物质基质的干扰。进一步用质谱对比分析，使用本发明法其他干扰基质的质谱信号仅是使用蛋白沉淀法的十分之一，说明凝胶pdc/go-de可以降低人血清中其他干扰基质质谱信号，提高质谱对标准小分子物质的质谱的灵敏度。因此，若利用hplc法对血清中某些外源性药物的进行分析，利用凝胶pdc/go-de分离人血清中的蛋白质和小分子物质，对色谱柱和质谱仪非常有利。
为了进一步证明上述结论，将四种典型的小分子标准物质加入空白血清中，并用两种方法分别进行处理，对比其标准小分子物质的回收率。从图16的lc-ms色谱峰中可知，对于加入利巴韦林的血清样品，用本发明法处理后，血清中的基质干扰峰被有效消除。四种标准小分子物质的回收率如表6所示。
表7为本发明中对比两种方法加标小分子物质的回收率。
表5中，喜树碱、利巴韦林及1-甲基-3-苯基丙胺均表现出良好的回收率。虽然用本发明法处理的血清样品中氧氟沙星的回收率相对较低，但也达到了65.6％。所以，实验结果证明了该方法是一种潜在的、可代替蛋白沉淀法的绿色样品前处理方法，不仅可以在生理条件下选择分离人血清样品中复杂各异的蛋白质和小分子物质，而且可以减少血清其他基质的干扰。