本发明属于无机材料合成及应用技术领域，具体涉及一种简便制备罗丹明b衍生物荧光传感材料的合成方法及其应用。
背景技术：
锌离子是生物体内必需的微量元素之一，在人体中主要存在于大脑、胰腺及精细胞中，它在基因表达、细胞凋亡、酶的调节和神经传递等方面起着非常重要的生理作用。缺少锌离子将会导致包括神经损伤、癫痫症、暂时性全脑缺血、老年痴呆症等在内的很多疾病，同时锌离子还是一种重金属离子，锌矿开采、冶炼加工、机械制造以及镀锌等工业都会对环境造成极大的污染，因此寻找能够快速非侵入性识别和评价生物体内或环境中锌离子浓度的方法和技术具有非常大的研究意义。测定锌离子的方法很多，如原子吸收法、高效液相色谱法、电感耦合等离子体质谱法、化学发光法和电化学法等。相比较而言，荧光传感分析法不仅操作简单，而且在灵敏度、选择性、响应时间、实时在线测定、远距离检测和不破坏样品等方面有突出优势。近年来，基于喹啉、联吡啶、芘等基团的分子探针用作光学传感器识别或检测微量生物体内和环境中的锌离子已有大量文献报道，但是这些分子探针要么结构较为复杂、合成原料价格昂贵，要么合成步骤较为复杂，识别灵敏度也不高。
罗丹明基荧光染料是以氧杂蒽为母体的碱性染料,由于其具有较高的荧光量子产率、长波吸收、短波发射、优良的水溶性和生物相容性，受到了广大分析科研工作者的关注。罗丹明衍生物内部含有“开-关”平衡的内酯螺环结构，并在不同环境下可实现醌式和内脂式互变异构，因此最近已经发展成为有应用潜力的荧光分子开关。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有的生物体内或环境中锌离子识别和检测方法复杂、仪器昂贵、过程繁琐、识别响应灵敏度不高、选择性差等缺陷，而利用荧光传感的基本原理，通过两步反应、温和的反应条件、价廉易得的原料功能导向性设计合成光学性能好、结构新颖的罗丹明b衍生物并采用设备简单的荧光分析法来高灵敏度特异选择性地识别检测锌离子。
本发明一种可用于锌离子荧光识别和检测的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼的制备方法，具体包括以下步骤：首先将罗丹明b溶于适量乙醇中，搅拌后加入水合肼，加热回流还原反应一定时间后浓缩溶剂，得到黄色粗产物，再分别采用浓盐酸和一定浓度的氢氧化钠调节反应介质酸度至近中性后，析出大量沉淀，过滤、干燥后获得淡粉色罗丹明b酰肼中间产物粉末；接着将罗丹明b酰肼与5-氯水杨醛共同溶解于适量甲醇中，并加热回流反应，析出白色固体，冷却至室温后，抽滤、洗涤、真空干燥，最终用无水乙醇重结晶两次后获得n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼浅肤色产物(其合成路线如下式所示)。
上述罗丹明b衍生物可以作为荧光分子探针在锌离子荧光识别中加以应用。
本发明所使用的罗丹明b衍生物采用溶液合成法制备，参考相关材料(zengx,wuc,dongl,mul,xuesf,taoz.anewtripodalrhodaminebderivativeasahighlyselectiveandsensitivefluorescencechemosensorforcopper(ii).scichinaserb-chem.2009,52(4):523-528.)
本发明的科学原理：
采用具有良好开关效应、量子产率高、长波吸收、短波发射、水溶性好和生物毒性低的罗丹明b化合物，与含有水杨基低毒性生物配体的氨基衍生物连接单元缩合反应后制备出结构新颖的、配位能力强、稳定性好、水溶性优良，并具有优良光电性能的席夫碱基罗丹明衍生物荧光分子探针，并研究其对锌离子的荧光响应，结果发现，锌离子加入后可使该分子探针溶液的荧光迅速增强，而且其它可能共存的离子不干扰响应，抗干扰性好，甚至可实现微量检测。
本发明与其它锌离子荧光传感分子探针材料的合成方法和应用相比，具有以下技术效果：
1.合成过程简单，原材料用量较少，反应条件温和，反应时间短，节能减耗；
2.合成产物稳定性强，光学活性较高；
3.分子探针的水溶性和生物相容性好；
4.分子探针对锌离子有高的灵敏响应(5s之内)；
5.分子探针对锌离子识别选择性好，不受其它金属离子的干扰；
6.可用于锌离子的微量测定(检测限达3.6μm)。
附图说明
图1为本发明实施例3制备的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液与锌离子作用后的benesi-hildebrand图(图中l为n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼)。
图2为本发明实施例3制备的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液与锌离子作用后的job’s图(图中hcprh为n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼的缩写名称)。
图3为本发明实施例3制备的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液加入锌离子后再加入其它离子后的荧光光谱柱形图。
图4为本发明实施例3制备的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液中逐渐加入不同量锌离子后的荧光滴定光谱图。
图5为本发明实施例3制备的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液中逐渐加入不同量锌离子后的荧光强度差值与锌离子浓度(10-250μm)之间的线性校正图。
具体实施方式
本发明的实质特点和显著效果可以从下述的实施例中得以体现，但它们并不对本发明作任何限制，本领域的技术人员根据本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属于本发明的保护范围。下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，其中实施例中反应产物的核磁数据测试表征使用的是德国bruker公司的型号为avance-iii400mhz的核磁共振仪(tms为内标)；红外光谱测试表征采用美国nicolet/nexus-870ft-ir型红外光谱仪(kbr压片)；使用美国perkinelmerls55型荧光光谱仪和美国winaspectplus2000型紫外光谱仪分别测定荧光和紫外可见吸收光谱。
一、本发明罗丹明b衍生物的合成
实施例1
(1)将罗丹明b1.2g(2.5mmol)溶于乙醇溶剂，加入80％水合肼2ml，在80℃条件下加热回流3小时后，浓缩溶剂，析出黄色产物，抽滤、干燥后置于小烧杯中，不断滴加浓盐酸使产物完全溶解成紫红色溶液，再用40％氢氧化钠水溶液调节体系ph值至7.0左右，析出大量淡粉色固体，抽滤、干燥后获得淡粉色罗丹明b酰肼中间产物粉末；
(2)将步骤(1)的中间产物0.456g(1mmol)溶于甲醇后加入5-氯水杨醛0.133g(0.8mmol)，在50℃下回流28小时后，析出白色固体，冷却至室温后，抽滤、洗涤，40℃下真空干燥12小时，最终用无水乙醇重结晶两次后获得n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼浅肤色产物。
实施例2
(1)将罗丹明b1.2g(2.5mmol)溶于乙醇溶剂，加入80％水合肼4ml，在90℃条件下加热回流1小时后，浓缩溶剂，析出黄色产物，抽滤、干燥后置于小烧杯中，不断滴加浓盐酸使产物完全溶解成紫红色溶液，再用40％氢氧化钠水溶液调节体系ph值至7.0左右，析出大量淡粉色固体，抽滤、干燥后获得淡粉色罗丹明b酰肼中间产物粉末；
(2)将步骤(1)的中间产物0.456g(1mmol)溶于甲醇后加入5-氯水杨醛0.199g(1.2mmol)，在70℃下回流20小时后，析出白色固体，冷却至室温后，抽滤、洗涤，50℃下真空干燥8小时，最终用无水乙醇重结晶两次后获得n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼浅肤色产物。
实施例3
(1)将罗丹明b1.2g(2.5mmol)溶于乙醇溶剂，加入80％水合肼3ml，在85℃条件下加热回流2小时后，浓缩溶剂，析出黄色产物，抽滤、干燥后置于小烧杯中，不断滴加浓盐酸使产物完全溶解成紫红色溶液，再用40％氢氧化钠水溶液调节体系ph值至7.0左右，析出大量淡粉色固体，抽滤、干燥后获得淡粉色罗丹明b酰肼中间产物粉末；
(2)将步骤(1)的中间产物0.456g(1mmol)溶于甲醇后加入5-氯水杨醛0.166g(1.0mmol)，在60℃下回流24小时后，析出白色固体，冷却至室温后，抽滤、洗涤，45℃下真空干燥10小时，最终用无水乙醇重结晶两次后获得n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼浅肤色产物。
实施例4
(1)将罗丹明b1.2g(2.5mmol)溶于乙醇溶剂，加入80％水合肼2.5ml，在80℃条件下加热回流3小时后，浓缩溶剂，析出黄色产物，抽滤、干燥后置于小烧杯中，不断滴加浓盐酸使产物完全溶解成紫红色溶液，再用40％氢氧化钠水溶液调节体系ph值至7.0左右，析出大量淡粉色固体，抽滤、干燥后获得淡粉色罗丹明b酰肼中间产物粉末；
(2)将步骤(1)的中间产物0.456g(1mmol)溶于甲醇后加入5-氯水杨醛0.149g(0.9mmol)，在65℃下回流22小时后，析出白色固体，冷却至室温后，抽滤、洗涤，40℃下真空干燥12小时，最终用无水乙醇重结晶两次后获得n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼浅肤色产物。
实施例5
(1)将罗丹明b1.2g(2.5mmol)溶于乙醇溶剂，加入80％水合肼3.5ml，在85℃条件下加热回流3小时后，浓缩溶剂，析出黄色产物，抽滤、干燥后置于小烧杯中，不断滴加浓盐酸使产物完全溶解成紫红色溶液，再用40％氢氧化钠水溶液调节体系ph值至7.0左右，析出大量淡粉色固体，抽滤、干燥后获得淡粉色罗丹明b酰肼中间产物粉末；
(2)将步骤(1)的中间产物0.456g(1mmol)溶于甲醇后加入5-氯水杨醛0.166g(1mmol)，在70℃下回流20小时后，析出白色固体，冷却至室温后，抽滤、洗涤，50℃下真空干燥8小时，最终用无水乙醇重结晶两次后获得n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼浅肤色产物。
目标产物表征：产率:55％。1hnmr(400mhz，dmso-d6):10.48(s，1h)，9.05(s，1h)，7.92-7.90(d，j＝8hz，1h)，7.65-7.56(m，j＝36hz，2h)，7.39-7.38(d，j＝4hz，1h)，7.24-7.20(m，j＝24hz，1h)，7.13-7.11(d，j＝8hz,1h)，6.81-6.79(d,j＝8hz,1h),6.43-6.32(m,j＝44hz,6h),3.33-3.28(m,j＝20hz,8h),1.08-1.05(m,j＝12hz,12h)；ir(kbr,cm-1):3498(-oh)，1700(-c＝o)，1590(c＝n)，1592(c＝c)。二、本发明罗丹明b衍生物对锌离子的荧光识别和检测效果评价
以最佳实施例3制备的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼为分子探针，研究对锌离子的荧光传感响应效果。
(1)研究发现向n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼的二甲基甲酰胺溶液中加入锌离子，在365nm紫外灯下观察可以看出暗色的n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液5s之内迅速增强为亮黄色荧光。荧光强度显著增强的原因可能是由于n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼与锌离子作用后使得原有分子探针的c＝n异构化受阻或者促进了分子内电荷转移所致。
(2)根据荧光光谱数据并结合修正后的benesi-hildebrand方程(singhts,paulpc,pramanikhar.fluorescentchemosensorbasedonsensitiveschiffbaseforselectivedetectionofzn2+.spectrochim.actaa.2014,121:520-526.)((如图1所示，图中纵坐标1/f-f0表示荧光强度差值的倒数)计算出分子探针与锌离子的配位结合常数为6.90×103m-1，表明n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼对锌离子有很强的结合能力。进一步采用job曲线(liz,zhouy,yink,yuz,liy.j.ren.anewfluorescence“turn-on”typechemosensorforfe3+basedonnaphthalimideandcoumarin.dyespigments,2014,105:7-11)分析了n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼与锌离子之间的结合比，如图2所示，当锌离子的摩尔分数达0.5时，荧光强度变化值达到最大，证明n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼与锌离子之间以1:1的摩尔比配位。
(3)采用荧光光谱仪进一步研究了其它可能共存的离子对n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液的影响，如图3所示。在n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液中加入除了锌离子之外的各种离子如铬离子、铜离子、三价铁离子、钠离子、钾离子、镉离子、铝离子、二价铁离子、镍离子和钴离子后，该化合物荧光强度几乎无显著变化，而且荧光颜色也没有改变，表明该分子探针对锌离子的识别选择性较高。另外还测试了n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼与锌离子混合体系加入金属离子后的影响，结果发现其它离子对荧光探针识别锌离子的过程无明显干扰(图略)。
(4)通过荧光滴定的方法，发现n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼二甲基甲酰胺溶液中连续不断地加入锌离子，n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼的荧光强度也会随之不断增强，当加入300μmol锌离子后，荧光强度达到最大，之后几乎不再变化(如图4)。计算后还发现，锌离子浓度在10～250μm之间时与n-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明b酰肼荧光强度变化值之间呈良好的线性关系(如图5)，相关系数为0.9970，检测限达3.6μm，可以实现对锌离子的微量测定。