一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用。

背景技术：

我国水禽产业包括肉鸭、蛋鸭、肉鹅等产业，每年为消费者提供大量的安全、优质、健康的肉蛋等其他附属品。危害水禽业的主要疫病包括鸭瘟、鸭病毒肝炎、鸭副黏病毒、流感、坦布苏病毒、细小病毒病等。鸭副黏病毒病又叫鸭新城疫（newcastlediseasevirus，ndv），是由鸭ⅰ型副黏病毒引起的，可导致鸭发生消化道和呼吸道症状的传染病。鸭肠炎病毒（duckenteritisvirus，dev）属于疱疹病毒科疱疹病毒属，病毒粒子呈球形，直径为120～180nm，有囊膜，病毒核酸型为dna。dev可引起鸭、鹅等水禽的急性败血性传染病，发病率和死亡率都甚高，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。鸭病毒性肝炎(duckviralhepatitis)的病原有两种：鸭甲肝病毒（duckhepatitisavirus，dhav）和星状病毒，其中dhav分为3个血清亚型，星状病毒分为2个亚型；其中dhav的三个血清型相互独立，无交叉免疫性。

ndv、dev和dhav是水禽的危害性很高的病原，经常单独或混合感染水禽，因此快速准确检测具有重要意义。现有技术中，未见制备该类病毒的标准品的相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的空白，本发明提供了一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法。

本发明还提供了一种上述制备方法制备的标准品在定量确定病禽待检品中病毒的含量的试剂盒中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法，包括以下步骤：

（1）病毒核酸的提取和反转录:

（2）进行pcr反应，然后阳性pcr产物回收后连接pmd-18t载体，转化感受态dh5α，随后进行阳性转化菌的检测，使用qiagen质粒提取试剂盒提取阳性重组菌质粒，测定质粒浓度，以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线，标准质粒拷贝数计算公式如下：copynumber=质量/分子量×6.02×10²³=x6.02×10²³/(载体长度+片段长度)/bp×10⁹×660；

（3）标准品建立的标准曲线

构建的阳性质粒进行10倍稀释，qpcr扩增反应后，将阳性重组质粒进行10倍系列稀释，三种质粒终浓度调整为4.39×10⁹～4.39×10copies/μl、4.20×10⁹～4.20×10copies/μl、2.91×10⁹～2.91×10copies/μl，共9个稀释度，以ddh2o为阴性对照，建立标准曲线，每个稀释度均设5个重复。

进一步的，步骤（2）中，所述pcr反应的具体步骤如下：反应体系为：2×pcrbuffer12.5μl、primerf(10μm)0.5μl、primerr(10μm)0.5μl、cdna或dna模板1-2μl、补充ddh2o至25μl；反应条件为：95℃30sec，随后95℃10sec、58℃10sec、72℃20sec进行40cycles，设ddh2o作为阴性对照。

进一步的，步骤（3）中，所述qpcr扩增反应为：dna1μl、2×pcrmix(qiagen)8μl、primerf/r各0.2μl、probe(50pm/μl)0.1μl、补充水至16μl，每个样品做三份平行重复检测，反应条件为：95℃2min，随后94℃10sec、59℃10sec、72℃40sec共进行40cycles，每个稀释度设5个重复。

进一步的，所述核酸的提取和反转录包括dev、dhav、ndv，所述pcr及qpcr反应体系中的引物及探针为：

dev-pf如seqidno:1所示；

dev-pr如seqidno:2所示；

dev-probe如seqidno:3所示；

dhav-pf如seqidno:4所示；

dhav-pr如seqidno:5所示；

dhav-probe如seqidno:6所示；

ndv-pf如seqidno:7所示；

ndv-pf如seqidno:8所示；

ndv-probe如seqidno:9所示；

具体如下表所示：

。

所述探针荧光标记物为fam和mgb。

进一步的，所述pcr反应体系中，病毒为dhav及ndv时，cdna模板为2μl；所述病毒为dev时，dna模板为1μl。

本发明在制备标准品过程中：当ndv模板为439copies/μl、dev的模板为420copies/μl、dhav的模板为291copies/μl时可以得到有效扩增，ndv建立的标准曲线：相关系数r2为0.999，斜率为-3.989，截距为42.045，从而得出拷贝数(x)与ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.989logx+42.045；dev建立的标准曲线：相关系数r2为0.998，斜率为-3.778，截距为40.289，从而得出拷贝数(x)与ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.778logx+40.289；dhav建立的标准曲线：相关系数r2为0.999，斜率为-3.954，截距为44.059，从而得出拷贝数(x)与ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.954logx+44.059。

本发明还提供了一种上述制备方法制备的标准品在定量确定病禽待检品中病毒的含量的试剂盒中的应用。

real-timepcr技术已成为一个成熟、稳定、可信的实验技术，为众多的研究者所运用。在病原的定量检测中，标准品的制备和应用必不可少；通过标准品的参照，才能得出待检测模板的浓度含量。

本发明的有益效果为：

（1）通过本发明制备的标准品，能够对水禽重要疫病定量检测，可计算待测样品模板的初始浓度，即样本中的病毒含量，适用于规模化饲养场水禽重大疫病的早期快速诊断，能给生产提供有效防治信息，及时降低上述疾病的发病率和死淘率，能够有效增加养殖户的增收，具有良好的经济效益和社会效益。

（2）本发明提供的引物探针组具备高灵敏度、高特异性、高重复性以及宽广的动态范围等特点，使其成为基础研究、应用研究等领域有用而强大的技术。

附图说明

图1为三种病原所构建的标准品的pcr鉴定结果。

图2为dhav阳性样本定量分析示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1

（1）引物和探针设计合成

根据genbankndv、dev、ⅰ型dhav流行毒株序列，根据保守区域序列，利用primerexpress2.0软件分别设计实时荧光定量pcr引物以及taqman探针，探针荧光标记物为fam和mgb。所有引物由华大基因合成，pageplus级别纯化。

表1扩增所用引物和探针引物

（2）核酸的提取和反转录:

dhav和ndv的rna提取按照博日生物simplernakit操作进行，最后用20μldepc水来溶解rna，随后进行反转录。反转录rt得到的cdna置于-20℃保存。dev的dna提取按照takaradnaiso试剂操作进行，最后用30μl超纯水来溶解dna。dna置于-20℃保存。

（3）标准品制备方法和浓度的计算

pcr反应体系和反应条件如下：2×pcrbuffer12.5μl、primerf(10μm)0.5μl、primerr(10μm)0.5μl、cdna模板2μl（dev为dna1μl）、补充ddh2o至25μl。反应体系为：95℃30sec，随后95℃10sec、58℃10sec、72℃20sec进行40cycles，设ddh2o作为阴性对照。反应结束后取5µl反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检验。以100bpdnaladder的marker作为参考，tae缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5v/cm）电泳50min，凝胶成像系统观察结果。阳性pcr产物回收后连接pmd-18t载体，转化感受态dh5α，随后进行阳性转化菌的检测，pcr检测结果如图1所示。阳性转化菌经华大基因测序，为本发明所需。使用qiagen质粒提取试剂盒提取阳性重组菌质粒，使用nanodropone测定质粒浓度。以所提取的质粒10倍稀释系列制作标准曲线。标准质粒拷贝数计算公式如下：copynumber=质量/分子量×6.02×10²³=x6.02×10²³/(载体长度+片段长度)/bp×10⁹×660。

引物及探针组进行扩增反应过程中，并不是任意的引物组都能扩增出目的条带，必须是针对目的病原的基因，因此引物是特定专一的，对其他的基因不能得到有效的扩增，探针两端分别加上了发光基团和淬灭基团，正常情况下是不发出信号的，只有当目的pcr扩增后，才会结合到目的基因上，发出荧光信号，因此，引物和探针的设计与合成并不是任意的，难度大，要求高，具有针对性。

注：每个碱基的平均分子量是330(每对碱基是660)，质粒原液xng/μl。最终计算得出ndv、dev、ⅰ型dhav的质粒浓度分别为4.39×10¹¹copies/μl、4.20×10¹⁰copies/μl、2.91×10¹⁰copies/μl。

（4）标准品建立的标准曲线

构建的阳性质粒进行10倍稀释，分别以如下反应进行标准曲线的建立：dna1μl、2×pcrmix(qiagen)8μl、primerf/r各0.2μl、probe(50pm/μl)0.1μl、补充水至16μl。每个样品做三份平行重复检测。最佳反应条件：95℃2min，随后94℃10sec、59℃10sec、72℃40sec共进行40cycles，每个稀释度设5个重复。上述qpcr扩增后系统自动分析软件进行标准曲线的分析建立。

将阳性重组质粒进行10倍系列稀释，三种质粒终浓度调整为4.39×10⁹～4.39×10copies/μl、4.20×10⁹～4.20×10copies/μl、2.91×10⁹～2.91×10copies/μl，共9个稀释度，以ddh2o为阴性对照，按优化的反应条件进行敏感性试验，同时建立的fq-pcr方法的标准曲线。每个稀释度均设5个重复。检测结果：当ndv模板为439copies/μl、dev的模板为420copies/μl、dhav的模板为291copies/μl时可以得到有效扩增。ndv建立的标准曲线，相关系数r2为0.999，斜率为-3.989，截距为42.045，从而得出拷贝数(x)与ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.989logx+42.045。dev建立的标准曲线，相关系数r2为0.998，斜率为-3.778，截距为40.289，从而得出拷贝数(x)与ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.778logx+40.289。dhav建立的标准曲线，相关系数r2为0.999，斜率为-3.954，截距为44.059，从而得出拷贝数(x)与ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.954logx+44.059。

（一）应用

dhav阳性样本准确定量见图2。已知样品的ct值，带入标准曲线，即可得出待测样品的病毒拷贝数。例如：当其在扩增曲线上的ct值为16.01，通过ct值与log10x(x为标准品系列浓度）的线性关系（y＝-3.954logx+44.059），计算出的dna拷贝数为1.23×10⁷copies/μl左右。

我们对近3年的54份疑似ndv、dhv和dev样品进行上述方法的检测，检测出了11份dhav阳性样品、9份dev阳性样品、5份ndv阳性样品。结果显示dev-dna含量检测范围为1×10³~1×10⁵copies/μl，阳性检出率可达16.67%（9/54）；dhav阳性样品含量检测范围为1×10⁴~1×10⁵copies/μl，阳性检出率可达20.37%（11/54）；ndv阳性样品含量大致范围为1×10⁴~1×10⁷copies/μl，阳性检出率可达9.26%（5/54）。由此，本研究研发的标准品可以定量确定病禽待检品中病毒的含量，这对于疾病的诊断尤其是早期快速诊断意义重大，可以极大地减少养禽业的经济损失。

核苷酸序列表

<110>山东省农业科学院家禽研究所

<120>一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用

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<212>dna

<213>人工合成

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