本发明属于生物技术领域，涉及一种检测并鉴别两种血清型禽腺病毒的检测方法，具体涉及一种用于检测并鉴别fadv-4(禽腺病毒血清4型)和fadv-8b(禽腺病毒血清8b型)的特异性引物及其应用。
背景技术：
禽腺病毒(fowladenovirus，fadv)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，为双股dna病毒，由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。禽腺病毒分为3个群，ⅰ群禽腺病毒是从鸡、火鸡、鹅、鸭的呼吸道感染分离出的禽腺病毒，分为12个血清型，分别为1-8a、8b-11，主要引起包涵体肝炎、轻度呼吸道疾病、心包积液综合症、肌胃糜烂及产蛋下降等。ⅱ群腺病毒主要是火鸡出血性肠炎病毒(hemorrhagicenteritis，hev)，主要引起火鸡出血性肠炎。ⅲ群腺病毒是减蛋综合症病毒(eggdropsyndrome，edsv)，主要引起减蛋综合症。
心包积液综合症(hydropericardiumsyndrome，hps)主要是由禽腺病毒血清4型(fowladenovirusserotype4，fadv-4)引起的，该病的典型症状为心包中出现淡黄色、凝胶样物质，死亡率30％～90％。1987年hps首次在巴基斯坦报道，之后在伊拉克、印度、俄罗斯、韩国、日本、墨西哥、美国和加拿大等国家陆续报道。自2015年6月开始，我国黑龙江、北京、山东、河南、安徽、湖北、江苏、新疆等地区的肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病。该病的传染速度很快，感染的宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种，并呈区域性流行，经鉴定，确定该病原为ⅰ群禽腺病毒。血清分型表明我国已报道的省份流行的禽腺病毒主要是fadv-4型和fadv-8b型，因此造成鸡群的死亡率较高，发病急、传播快，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。
荧光定量pcr染料法技术原理是，荧光染料sybr可以结合到双链dna上面，当体系中的模板被扩增时，sybr可以有效结合到新和成的双链上面，随着pcr进行，结合的染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号也越来越强，从而达到定量目的。当荧光定量扩增反应完成后，为判定产物是否相对专一，会对产物逐渐加温，pcr产物随温度增高会逐渐变成单链，从而不能和sybr结合，当产物达到pcr产物的tm值时，产物解离成指数增多，系统检测荧光信号会突然减少，从而达到检测产物tm值的目的。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的特异性引物。该特异性引物具有快速、方便、高效、灵敏度高、特异性强等特点。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述特异性引物或试剂盒的应用。
本发明的再一目的在于提供一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的双重荧光定量pcr方法。该方法可以快速、灵敏、准确的检测并鉴别fadv-4和fadv-8b，极大的缩短了检测时间。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的特异性引物，包括如下序列：
rt-fadv-4-f：5′-ttggtttcgtcggctttg-3′；
rt-fadv-4-r：5′-tttcgccttctttgtggg-3′；
rt-fadv-8b-f：5′-gtgaacgggtcgtatcgg-3′；
rt-fadv-8b-r：5′-tgctggcagaggtatgagg-3′；
rt-fadv-4-f/r扩增的目的片段大小为138bp，rt-fadv-8b-f/r扩增的目的片段大小为122bp。
本发明还提供一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的试剂盒，包括上述特异性引物。
上述特异性引物或试剂盒可以用于检测疑似感染fadv-4和fadv-8b病毒的临床样品或者已分离的病毒。
本发明还提供一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的双重荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
(1)用常规方法或试剂盒提取病料或病料分离物的dna；
(2)所述实时荧光pcr的反应体系为：
(3)所述实时荧光pcr的反应程序为：stage1：预变性，repa：1，95℃30秒；stage2：pcr反应，repa：40，95℃5秒，56℃34秒；stage3：dissociationstage，repa：1，95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒，60℃15秒；
(4)最后根据荧光定量获得的tm值来区分fadv-4与fadv-8b；其中，tm值为81.5℃，检测结果则为fadv-4；tm值为87.3℃，检测结果则为fadv-8b。
本发明进一步提供了一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的双重实时定量pcr方法在特异性方面的验证。本发明对禽常见病毒如禽流感病毒(h5n6，h9n2)、新城疫病毒(ndv)、禽白血病毒(alv)、鸡传染性法氏囊病毒(ibdv)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、鸡传染性喉气管炎病毒(iltv)的检测均为阴性。但对禽腺病毒fadv-4和fadv-8b的检测均为阳性。
本发明进一步提供了一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的双重实时定量pcr方法在检测临床样品或已分离的病毒时的应用。根据本实验室收集的52份已知病料(其中，47份腺病毒阳性样品，5份腺病毒阴性样品，所用的阴性样品用来检测该方法的特异性及敏感性，如果引物特异性不好，阴性样品可能会起峰)，用试剂盒提取dna后，使用本发明的方法对该批样品进行检测。检测结果表明共47份病料检测阳性，其中38份病料仅检测到fadv-4，4病料仅检测到fadv-8b，5份病料既检测到了fadv-4又检测到fadv-8b，5份阴性样品检测结果为阴性。该检测结果与该52份已知样品的实际信息100％吻合，说明该检测结果真实可靠。
本发明的机理是：
本检测方法原理根据fadv-4的保守基因orf14a，与fadv-8b的保守基因dnapolymerase的gc％含量不同而设计了两对特异性引物，然后由于该引物扩增的两条目的片段的gc％含量不同，从而产物的解链温度不同，因此生成的产物的熔融曲线的tm值不同，最后根据tm值对fadv-4及fadv-8b进行区分。
本检测方法，相比常规pcr检测方法而言，操作简便、无污染，不仅检测灵敏、可以快速得到结果，而且还可以对pcr产物进行定量，因此大大节省了临床诊断fadv-4和fadv-8b的时间，给养鸡业带来了巨大经济效益。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明根据fadv-4和fadv-8b的保守序列分别设计了两对特异性扩增引物，该两对引物扩增的片段大小分别为138bp、122bp；gc％含量分别为44.2％，66.0％；解链温度分别为81.5℃、87.3℃，本发明可以根据荧光定量扩增曲线及溶解曲线对fadv-4和fadv-8b进行区分。特异性实验表明，本发明对其它家禽常见病毒aiv(h5n6，h9n2)、ndv、ibv、ibdv、alv、iltv等无交叉反应。通过临床应用证实，该方法可以快速灵敏的检测fadv-4和fadv-8b，并能快速获知fadv-4和fadv-8b的混合感染情况。本发明方法简便、高效，可以用于临床及实验室的fadv-4和fadv-8b的检测。
附图说明
图1是fadv-4av211代表毒株实时荧光定量扩增的熔融曲线。
图2是fadv-8bibh1401代表毒株实时荧光定量扩增的熔融曲线。
图3是fadv-4av211和fadv-8bibh1401代表毒株实时荧光定量扩增的熔融曲线。
图4是检测临床常见病毒的实时荧光定量扩增的熔融曲线(双峰为阳性对照)。
图5是检测临床样品的实时荧光定量扩增的熔融曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例所用的生物材料的来源如下：
文献(1)：biologicalcharacterizationsofh5nxavianinfluenzavirusesembodyingdifferentneuraminidases.frontiersinmicrobiology,2017,8.
文献(2)：pb2-588vpromotesthemammalianadaptationofh10n8,h7n9andh9n2avianinfluenzaviruses.scientificreports,2016,6:19474.
文献(3)：theconstructionandapplicationofacelllineresistanttonovelsubgroupavianleukosisvirus(alv-k)infection.archivesofvirology,2018,163(1):89-98.
实施例1
(一)引物设计：参照genbank中的fadv-4代表序列与fadv-8b代表序列的全基因组，用mega6.0软件找到fadv-4与fadv-8b两个毒株gc％含量差异大的两个保守基因，并根据该保守基因分别设计了两对特异性引物，各引物及引物序列如下：
rt-fadv-4-f：5′-ttggtttcgtcggctttg-3′；
rt-fadv-4-r：5′-tttcgccttctttgtggg-3′；
rt-fadv-8b-f：5′-gtgaacgggtcgtatcgg-3′；
rt-fadv-8b-r：5′-tgctggcagaggtatgagg-3′；
(二)病料及病料分离物中病毒dna的提取：
提取方法参照美吉生物病毒dna/rna提取试剂盒，首先将待检的临床病料或已分离的腺病毒，反复冻融三次，混合后离心取上清液备用；其次取上述上清液取0.2ml用dna提取试剂盒提取dna；最后将dna溶于30μl超纯水中-20℃保存备用。具体步骤如下：
(1)称取5g左右的疑似感染fadv-4或fadv-8b的病鸡的肝脏和脾脏放到已消毒的研钵中进行充分研磨。
(2)在已研磨充分的匀浆中加入2ml含终浓度1000ui双抗的pbs进行混匀。并分装于2ml的ep管中。
(3)将上述病料反复冻融三次，最后一次放到涡旋器上涡旋3分钟。
(4)将该病料4℃6000r/min离心10min，收集上清液。
(5)吸取20μl的proteinasek到1.5ml离心管中。
(6)吸取250μl上面处理好的上清液至装有proteinasek的离心管中，振荡混匀10秒。
(7)加入500μlbuffergrp到样品中，涡旋混匀30秒，室温静置10分钟。
(8)把hipurernacolumna过滤柱装在2ml收集管中，12,000r/min离心60秒。
(9)弃去2ml离心管内的滤液，加入500μlbuffergw1(已经用乙醇稀释)到柱子中，12000r/min离心60秒。
(10)弃去滤液，把柱子重新装回收集管中，加入650μlbufferrw2(已经用乙醇稀释)至柱子中，12000r/min离心60秒。
(11)弃去滤液，把柱子重新套回收集管，12000r/min离心120秒，然后离干柱子。
(12)重新装入新的1.5ml离心管，加入30μlnucleasefreewater至柱子中，室温下静置2min，12000r/min离心60秒。
(13)弃去柱子，把dna保存于-80℃备用。
(三)实时荧光定量对样品进行检测：
(1)实时荧光pcr的反应体系为：
(2)进一步，所述实时荧光pcr的反应程序为：stage1：预变性，repa：1，95℃30秒；stage2：pcr反应，repa：40，95℃5秒，56℃34秒；stage3：dissociationstage，repa：1，95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒，60℃15秒。
(四)结果分析：
禽腺病毒血清4型与禽腺病毒血清8b型的双重荧光定量pcr扩增曲线良好，扩增结果参看图1～图3，当样品中仅有fadv-4时，熔融曲线仅有一个峰值，tm值为81.5℃，当样品中仅有fadv-8b时，熔融曲线也仅有一个峰值tm值为87.3℃，当样品中同时具有fadv-4和fadv-8b时，熔融曲线具有两个峰值，分别在tm值为81.5℃和tm值为87.3℃处各有一个峰值。
(五)临床应用
根据本发明提供的检测方法，通过对已知结果的52份临床样品(其中，47份腺病毒阳性样品，5份腺病毒阴性样品)进行检测后证实(图5)，使用本发明的方法对该批样品进行检测，检测结果表明共47份病料检测阳性，其中38份病料仅检测到fadv-4，4病料仅检测到fadv-8b，5份病料既检测到了fadv-4又检测到fadv-8b，5份阴性样品检测结果为阴性。该方法检测结果与已知样品实际结果符合率为100％，说明该检测结果真实可靠；说明该方法可快速灵敏、准确地检测fadv-4，fadv-8b，以及fadv-4与fadv-8b混合感染的情况，极大地缩短了检测时间；该方法检测特异性强，对禽常见病毒如禽流感病毒(h5n6，h9n2)、新城疫病毒(ndv)、禽白血病毒(alv)、鸡传染性法氏囊病毒(ibdv)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、鸡传染性喉气管炎病毒(iltv)的检测均为阴性；但对禽腺病毒fadv-4和fadv-8b的检测均为阳性(图4)。因此，避免了临床上禽常见病毒aiv(h5n6，h9n2)、ndv、ibv、ibdv、alv、iltv等对检测结果的干扰。因此，本发明建立的fadv-4与fadv-8检测技术具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于fav样品的临床及实验室检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>一种用于检测并鉴别fadv-4和fadv-8b的特异性引物及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>rt-fadv-4-f
<400>1
ttggtttcgtcggctttg18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>rt-fadv-4-r
<400>2
tttcgccttctttgtggg18
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>rt-fadv-8b-f
<400>3
gtgaacgggtcgtatcgg18
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>rt-fadv-8b-r
<400>4
tgctggcagaggtatgagg19