一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素及其制备方法与流程

本发明涉及天然食用色素技术领域，具体涉及一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素及其制备方法。

背景技术：

早在公元前1500年，天然色素就开始应用到人类的食品之中。尽管19世纪晚期，合成色素一度取代了天然色素的统治地位，但随着人们对合成色素潜在的慢毒性和致癌性等致命弱点的逐步认识，消费市场对无毒副作用的天然色素需求量越来越大。

在中国、日本、韩国等国家，真菌来源的天然色素，尤其是azaphilone类红曲色素在传统食品中广泛应用，如制作红米酒、红豆腐乳、红曲米等，已经有上百年的历史。迄今为止，无任何因食用红曲色素而出现的食品中毒事件，表明红曲色素的安全可靠。azaphilone色素是一类由真菌代谢产生的多聚乙酮次级代谢产物，由于具有大的共轭体系，呈现出多种颜色，如红色、橙色、绿色等，具有抗菌、抗病毒、抗癌、细胞毒性和抗炎活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素。本发明的另一目的在于提供一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素，所述色素的化学名称为2-((r)-7-乙酰氧基-5-氯-3-((s)1e,3e)-3,5-二甲基庚烷-1,3-二烯-1基)-7-甲基-6,8-二氧代-7,8-二氢异喹啉-2(6h)基)-4-甲基戊酸，分子式为c27h34clno6，命名为penazaphilonea，其结构式如式(1)所示：

化合物的理化性质和光谱性质如下：

红色粉末，hr-esi-ms:502.2018[m-h]^-，¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ7.92(1h,s,h-1),6.98(1h,s,h-4),6.87(1h,d,j＝15.4hz,h-10),6.15(1h,d,j＝15.4hz,h-9),5.66(1h,d,j＝9.7hz,h-12),4.84(1h,m,h-2′),2.45(1h,m,h-13),2.11(3h,s,h-20),2.10(1h,m,h-3′),1.91(1h,m,h-3′),1.82(3h,s,h-17),1.54(3h,s,h-18),1.51(1h,m,h-4′),1.30～1.40(2h,m,h-14),1.00(3h,d,j＝6.6hz,h-16),0.92(3h,d,j＝6.6hz,h-5′),0.88(3h,d,j＝6.6hz,h-6′),0.84(3h,t,j＝7.4hz,h-15)；¹³c-nmr(100mhz,cdcl3):δ193.6(c-8),184.9(c-6),170.7(c-19),170.1(c-1′),150.1(c-4a),148.4(c-12),146.2(c-10),145.6(c-3),139.1(c-1),132.0(c-11),115.7(c-9),115.2(c-8a),112.9(c-4),102.8(c-5),84.8(c-7),61.9(c-2′),40.7(c-3′),35.2(c-13),30.2(c-14),24.9(c-4′),23.4(c-18),22.8(c-5′),21.7(c-6′),20.4(c-20),20.4(c-16),12.8(c-17),12.1(c-15).

本发明提供式(1)所述的色素在功能性食品制备中的应用。

进一步的，本发明提供一种食品，含有式(1)所述化合物或式(1)所述化合物食品上可接受的盐、酯或溶剂合物。

此外，本发明还提供一种生产具有抗炎活性的红色食用真菌色素的真菌菌株，所述菌株为青霉属(penicilliumsp.)cib411，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14993。该菌株的its序列如下所示：

cggaaggatcattaccgagtgagggccctttgggtccaacctcccacccgtgtttattttaccttgttgcttcggcgggcccgcctttactggccgccggggggctcacgcccccgggtccgcgcccgccgaagacaccctcgaactctgtctgaagattgaagtctgagtgaaaatataaattatttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcaaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggccccgtcctccgattccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctccgtaggcccggccggcgcttgccgatcaacccaaatttttatccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcata。

进一步的，本发明还包括一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

s1、将菌株cib411接种于发酵培养基，于25-30℃避光静置培养20-40天，得到发酵产物；

s2、将s1得到的发酵产物，加入乙酸乙酯混合，进行超声破碎，收集提取液，即为浸提液；

s3、将s2得到的浸提液进行旋转蒸发，得到粗浸膏；

s4、将s3得到的粗浸膏，进行经硅胶柱层析，以石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱液进行梯度洗脱，洗脱过程中石油醚和丙酮的体积比为20:1～1:1，收集石油醚和丙酮的体积比为1:1的洗脱液，旋转蒸发后得到干物质a；

s5、将s4得到的干物质a经用分子筛分离纯化，后经高效液相色谱制备得到式i结构的化合物。

更进一步的，所述步骤s1中发酵培养基的制备方法：100g大米加水浸泡24h，滤干水分，置于500ml三角瓶，加入0.3g蛋白胨，混合均匀。、

所述的硅胶柱层析的条件：采用的填料为200～300目柱层析硅胶。所述的萃取液经浓缩后得到的提取物与硅胶按照1：1～3的比例拌和后，与硅胶柱层析填料的重量比为1：10～20。

所述的高效液相色谱分离条件：采用的填料为odsc-18柱层析硅胶，采用的流动相分别为含甲醇体积百分数55％的水溶液组成的洗脱溶剂。

此外，本发明还包括上述菌株在生产式(1)真菌色素中的应用。

本发明的有益效果是：(1)本发明式i结构的化合物，无细胞毒性，且具有显著抗炎活性，是一种色泽鲜艳、着色力强、性能稳定、色价高又具抗炎活性的天然保健红色素。对本发明式i结构的具有抗炎活性的化合物进行抗炎活性测试，检测结果表明penazaphilonea能够显著降低lps诱导的no产生水平，其ic50达到15.28μm，具有抗炎活性，且无明显细胞毒性。(2)本发明提供的新化合物由真菌经固体发酵产生，可通过对发酵产物进行乙酸乙酯提取后，再用硅胶柱层析和反相色谱分离纯化，易于操作和实施，易于工业化大规模生产，具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明具有式i结构的化合物的1hnmr图谱；

图2为本发明具有式i结构的化合物的13cnmr图谱；

图3为本发明具有式i结构的化合物的红外图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1菌株cib411的分离鉴定

一、菌株的分离

称取大曲样品，装入到有小玻璃珠的三角瓶中，再加入无菌水，大曲样品与无菌水的质量比为1:9，30℃、160rpm振荡30分钟，静置20～30秒，即成10^-1稀释液；用1ml无菌吸管吸取10^-1稀释液1ml，移入装有含无菌水的试管中，配成10^-2稀释液；以此类推，连续多次稀释，制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6一系列稀释液。取各种稀释度菌液1ml放入无菌培养皿内，分离培养基熔化后冷却至50℃，迅速倒入平皿中，混合均匀，凝固后放入30℃培养箱培养至7天，挑取单菌落通过划线分离获得一株产红色色素的纯培养菌株，编号为cib411。

二、菌株的鉴定

菌株cib411在10-35℃均可生长，以28℃左右最适，产生红色色素。菌丝有横隔，分生孢子梗由气生菌丝生出，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，分生孢子梗经过多次分枝，形成扫帚状的分枝轮。分生孢子成链，球形，呈蓝绿色。对其菌株cib411进行基因测序，得到菌株cib411的its序列如下所示：

cggaaggatcattaccgagtgagggccctttgggtccaacctcccacccgtgtttattttaccttgttgcttcggcgggcccgcctttactggccgccggggggctcacgcccccgggtccgcgcccgccgaagacaccctcgaactctgtctgaagattgaagtctgagtgaaaatataaattatttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcaaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggccccgtcctccgattccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctccgtaggcccggccggcgcttgccgatcaacccaaatttttatccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcata

综合形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定的结果，菌株cib411属于青霉属(penicilliumsp.)。

三、菌株的保藏

菌株cib411已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.14993。

实施例2式i所示化合物的制备

一、菌种的发酵

1、预培养

将菌株cib411接种到pda培养基斜面上，28℃避光培养7天，菌丝长满整个斜面。

2、将步骤1得到的菌丝体转接到种子培养基中，28℃、180rpm避光培养4天，得到种子培养液。

种子培养基：溶剂为土豆汁(土豆汁的制法：200g土豆，加水约1000ml，煮沸30min，过滤，滤液补足1000ml)，溶质及其含量如下：葡萄糖20.0g/l、蛋白胨3g/l、kh2po42g/l。

3、将10ml种子培养液接种至发酵培养基中，28℃避光静置培养30天。

发酵培养基的制备方法：取100g大米，加水浸泡24h，滤干水分，放入500ml三角瓶，加入0.3g蛋白胨，混合均匀，灭菌(121℃，30min)。

二、式ⅰ所示化合物的提取分离

1、将200ml乙酸乙酯加入发酵好的三角瓶中，60℃下水浴4h，过滤得到浸提液。分别浸提3次，合并滤液，真空减压浓缩得到浸膏。

2、总浸膏与硅胶拌合均匀后，干法上样，进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯/石油醚(20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，纯乙酸乙酯)和氯仿甲醇(15:1，5:1)过中压柱得到粗提物37g。

3、用40g硅胶拌样，500克硅胶装柱，石油醚丙酮(10:1，5:1，2:1，纯丙酮)过正相柱，得到5个组分。继续用分子筛(氯仿：甲醇1:1)分离，得到含有目标产物的混合物950mg，在以高效液相色谱法制备，得到式i所示化合物(180mg)。

三、式ⅰ所示化合物的结构确证数据

红色粉末，hr-esi-ms:502.2018[m-h]^-，¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ7.92(1h,s,h-1),6.98(1h,s,h-4),6.87(1h,d,j＝15.4hz,h-10),6.15(1h,d,j＝15.4hz,h-9),5.66(1h,d,j＝9.7hz,h-12),4.84(1h,m,h-2′),2.45(1h,m,h-13),2.11(3h,s,h-20),2.10(1h,m,h-3′),1.91(1h,m,h-3′),1.82(3h,s,h-17),1.54(3h,s,h-18),1.51(1h,m,h-4′),1.30～1.40(2h,m,h-14),1.00(3h,d,j＝6.6hz,h-16),0.92(3h,d,j＝6.6hz,h-5′),0.88(3h,d,j＝6.6hz,h-6′),0.84(3h,t,j＝7.4hz,h-15)；¹³c-nmr(100mhz,cdcl3):δ193.6(c-8),184.9(c-6),170.7(c-19),170.1(c-1′),150.1(c-4a),148.4(c-12),146.2(c-10),145.6(c-3),139.1(c-1),132.0(c-11),115.7(c-9),115.2(c-8a),112.9(c-4),102.8(c-5),84.8(c-7),61.9(c-2′),40.7(c-3′),35.2(c-13),30.2(c-14),24.9(c-4′),23.4(c-18),22.8(c-5′),21.7(c-6′),20.4(c-20),20.4(c-16),12.8(c-17),12.1(c-15).

实施例3式i所示化合物的抗炎活性及细胞毒性实验

一、抗炎活性

将单体化合物作用于脂多糖(lsp)诱导的raw264.7小鼠巨噬细胞，通过检测raw264.7细胞中一氧化氮(no)的产生水平来检测其抗炎活性。

1、药物溶液的配制

(1)将单体化合物用dmso配制成100μm溶液，置于-4℃保存；

(2)脂多糖(lipopolysaccharidefromescherichiacolie0127:b8-purifiedbyphenolextraction，lps)，购自sigma-aldrich公司，用重蒸水配制成100μg/ml溶液，-20℃保存。

2、细胞株：raw264.7小鼠巨噬细胞，由中国科学研究院上海分院提供。

3、试验方法:

按常规复苏细胞并且传代培养，使用dmem+10％pbs+1％双抗(青霉素、链霉素)的完全培养基，接种细胞到24孔细胞培养板，细胞数为1.5×10⁵个，培养过夜。然后以不同浓度梯度的处理细胞1小时，加入lps(终浓度为1.0μg/ml)，诱导24小时，每个浓度设3个重复。再用griess反应检测细胞细胞培养基中的一氧化氮(no)浓度。

4、抗炎活性结果

一氧化氮(no)的产生水平与炎症反应的强弱密切相关。实验表明式i所示化合物能显著降低lps诱导的no产生水平，其ic50达到15.28μm。

二、细胞毒性实验

按常规复苏细胞并且传代培养，使用dmem+10％pbs+1％双抗(青霉素、链霉素)的完全培养基，接种细胞到96孔细胞培养板，细胞数为4×10⁴个，37℃，5％co2培养箱中培养过夜。然后以一系列不同浓度梯度的penazaphilonea处理细胞24小时，每个浓度设3个重复，用alamar-blue法检测细胞存活率。结果表明，在50μm的浓度下，式i所示化合物没有显著抑制细胞的增殖，说明该化合物无显著细胞毒活性。

实施例4式i所示化合物的食品染色实验

将式i化合物溶解于食用酒精中，配成0.1％的溶液，将其按照一定的比例添加至米酒、果酒等饮品中，饮品呈现从浅红至深红不同程度悦目诱人的颜色，通过评析发现，添加i化合物的饮品能显著增加消费者的消费欲望和心情。同时该化合物的添加赋予了该饮品抗炎保健作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一种具有抗炎活性的红色食用真菌色素及其制备方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>554

<212>dna

<213>青霉属(penicilliumsp.)

<400>1

cggaaggatcattaccgagtgagggccctttgggtccaacctcccacccgtgtttatttt60

accttgttgcttcggcgggcccgcctttactggccgccggggggctcacgcccccgggtc120

cgcgcccgccgaagacaccctcgaactctgtctgaagattgaagtctgagtgaaaatata180

aattatttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcg240

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