本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法。
背景技术：
脂肪酶(lipase，ec3.1.1.3)，是一类十分重要的生物催化剂，能分解底物产生各种天然油脂。作为一种生物催化剂，脂肪酶具有催化效率高、专一性强、副产物少、反应条件温和的特点，被广泛地应用到手性化合物的拆分、生物柴油的制备、食品加工和日用化工等行业。但是，由于游离酶本身存在的稳定性差、分离回收困难和难以实现反复连续利用等缺陷，很大程度上限制了其在工业生产中的实际应用。为了解决游离酶存在的以上缺点，真正将酶制剂应用到工业生产中去，人们开展了酶的固定化研究。
酶的固定化方法有多种，较为常用的有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。共价结合法固定化酶是把酶的非活性侧链基团和载体中的活性官能团共价键合，固定化得到的酶通常具有良好的稳定性，在连续使用的过程中酶活损失较小，是目前较为受青睐的一种固定化方法。利用共价键固定化的官能团载体有很多种，较为常用的有羧基类、氨基类和环氧基类。由于环氧基团具有很高的活性和可塑性，在常温下就可以与酶蛋白表面的氨基酸残基(-nh2、-cooh、-hs等)发生温和的开环共价结合，从而将酶分子固定在载体表面。并且，由于一些合成的树脂载体在较长的生产周期内具有很强的耐微生物、耐碱腐蚀作用和较强的机械性能，所以利用含有环氧基团的树脂来固定化酶，在通常情况下可以得到稳定性较好、机械性能较强的固定化酶，能够较好地适应复杂的工业操作环境。
目前，用于工业酶固定化的环氧树脂主要是eupergitc等国外公司生产的环氧树脂，但是国外进口的环氧树脂价格较为昂贵，从国外进口需要花费大量的外汇资源。因此，开发基于国产环氧树脂进行工业酶的固定化方法，以减少对国外公司生产的昂贵的环氧树脂的依赖，很有必要。而目前基于环氧树脂载体的固定化脂肪酶的报道较少。
技术实现要素：
本发明的目的是为了减少对国外公司生产的昂贵的环氧树脂的依赖，利用国产的环氧树脂替代进口的环氧树脂，通过优化固定化过程，得到性能更为优异的环氧树脂固定化脂肪酶，提供一种经济实用的固定化脂肪酶及其制备方法。
本发明通过对国产的环氧树脂进行筛选，使用国产环氧树脂lxep-120固定化脂肪酶，研究了影响固定化效果的多个重要参数，确定了最佳的固定化工艺，并分析了制备的环氧树脂固定化脂肪酶的酶学性质以及稳定性。
本发明的第一个目的是提供一种固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
将脂肪酶溶于ph5.5～8.5的缓冲液中，10000r/min离心得到脂肪酶酶液，按照环氧树脂：脂肪酶酶液为0.5～7g：4ml的比例将环氧树脂放入酶液中，在18～28℃条件下固定化12～24h；然后洗涤、抽滤、干燥。
优选，所述的环氧树脂为环氧树脂lxep-120、lx-1000ep、es-1、es-3、es-5或es-7。
更优选的，所述的环氧树脂为环氧树脂lxep-120。
优选，所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、tris-hcl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
优选，所述的缓冲液为浓度为1.0mol/l的ph6.0的磷酸钾缓冲液。
优选，所述的酶液浓度为2mg/ml，环氧树脂：脂肪酶酶液的比例为5g：4ml。
优选，所述的固定化温度为22℃、固定化时间为12h。
优选，所述的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/ml的酶液，10000r/min离心12min后得到澄清酶液，按照5g：4ml的比例将型号为lxep-120的环氧树脂置于酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶。
本发明的第二个目的是提供利用上述的任意一项固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶。
本发明的第三个目的是提供所述的固定化脂肪酶在催化酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应中的应用。
本发明制备的固定化脂肪酶的酶活为400u/g，酶活回收率为92.79％，最适反应ph为8.0，最适反应温度为45℃，具有很好的ph耐受性、热稳定性和操作稳定性；且具有较好的储存稳定性，在4℃条件下储存一个月后仍保持80％左右的酶活。此外，该固定化脂肪酶具有较高的重复利用率，重复操作10次后，固定化脂肪酶的酶活力保留原来的70％左右。
附图说明
图1是缓冲液类型对脂肪酶固定化的影响；
图2是缓冲液ph对脂肪酶固定化的影响；
图3是缓冲液浓度对脂肪酶固定化的影响；
图4是树脂投放量对脂肪酶固定化的影响；
图5是固定化温度对脂肪酶固定化的影响；
图6是固定化时间对脂肪酶固定化的影响；
图7是游离酶和固定化脂肪酶的最适反应ph；
图8是游离酶和固定化脂肪酶的最适反应温度；
图9是游离酶和固定化脂肪酶的ph耐受性；
图10是游离酶和固定化脂肪酶的温度耐受性；
图11是固定化脂肪酶的操作稳定性；
图12是固定化脂肪酶的储存稳定性。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例中所采用的脂肪酶(acs号：001-62-1，植物来源脂肪酶)，购自深圳恒生生物有限公司。该脂肪酶可以水解甘油三酯等酯类生产甘油和脂肪酸，在食品、农业、制药和环保等领域具有重要的工业应用价值，可以催化甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。
脂肪酶活力测定：①依次在试管中加入1.0ml橄榄油底物乳化液，1.25ml磷酸缓冲液(ph＝8.0)，于40℃恒温水浴5min。②迅速加入0.25ml40℃预热5min的1mg/ml或2mg/ml脂肪酶溶液(或，在测定固定化脂肪酶酶活时，加入0.05g固定化脂肪酶)，置于摇床中反应15min，反应条件为40℃，200r/min。③反应15min后迅速加入6mol/l的盐酸溶液0.5ml，95％的乙醇3ml终止反应，混合均匀后加入1.5ml异辛烷溶液，在涡旋振荡器上震荡90s，60℃水浴条件下静置10min，然后常温水浴中冷却5min。④移取0.5ml上层异辛烷溶液，加入异辛烷2ml，铜盐显色剂0.5ml，于涡旋振荡器震荡90s，然后室温静置直到上层溶液澄清。⑤取上层澄清溶液100ul于酶标仪在714nm波长条件下测定吸光度。对照实验为底物反应15min后加入乙醇和盐酸溶液后，再加入相同体积的酶液，其它操作皆与实验组相同。
所述的橄榄油底物乳化液的配置：称取40gpva(聚合度为1750+50)，加入800ml去离子水，置于沸水浴中搅拌加热，直到全部溶解，除去少数不溶物质后冷却，然后定容到1000ml，得到4％的pva溶液。取30ml制备好的4％的pva溶液，加入10ml橄榄油，摇匀后用超声破碎仪分散10min。超声工作条件为：功率36％，工作6s，暂停4s。重复3次操作，得到乳白色的橄榄油底物乳化液。
实施例1：固定化脂肪酶的获得
1.1不同环氧树脂对脂肪酶固定化的影响
分别取1g不同的环氧树脂(环氧树脂lxep-120、lx-1000ep、es-1、es-3、es-5、es-7)，加入4ml酶液(ph＝7.0的50mmol/l磷酸钠缓冲液溶解，酶液浓度2mg/ml，10000r/min离心12min)，放入25℃摇床中，150rpm条件下固定12h。由表1可知环氧树脂lxep-120的固定效果最好，酶活回收率达到12.21％。
表1不同环氧树脂的固定化效果
1.2不同固定化缓冲液对脂肪酶固定化的影响
分别配置ph为8.0的磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、tris-hcl缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，用不同缓冲液溶解酶粉制备成浓度为2mg/ml的酶液，然后分别取4ml加入1g环氧树脂lxep-120，放入25℃摇床中，150rpm条件下固定12h。由图1可知在保持其它固定化条件不变的情况下，选择磷酸钾缓冲液和gly-naoh缓冲液固定脂肪酶时，固定化脂肪酶的酶活回收率最好，试验选择磷酸钾缓冲液进行后续优化试验(与酶活测定时缓冲液保持一致)。
1.3缓冲液ph对脂肪酶固定化的影响
分别配置50mmol/l的ph为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的磷酸钾缓冲液，用此缓冲液溶解酶粉制备成浓度为2mg/ml的酶液，分别取4ml加入1g环氧树脂lxep-120，放入25℃摇床中，150rpm条件下固定12h。由图2可知，当固定化缓冲液ph为6.0时，脂肪酶的固定效果最好，而当缓冲液逐渐偏碱性时，酶活回收率不断降低。
1.4缓冲液浓度对脂肪酶固定化的影响
配置浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.3mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液，用此缓冲液溶解酶粉制备成浓度为2mg/ml的酶液，分别取4ml加入1g环氧树脂lxep-120，放入25℃摇床中，150rpm条件下固定12h。由图3可知，随着缓冲液浓度的不断增大，酶的固定化效果逐渐变好，当浓度为1.0mol/l时，酶活回收率达到最大值34.17％。而后随着浓度的增大，固定效率反而下降。
1.5环氧树脂投放量对脂肪酶固定化的影响
配置1mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液，用其溶解酶粉制备成浓度为2mg/ml的酶液。分别取0.5、1、2、3、4、5、6、7g环氧树脂lxep-120，加入4ml上述酶液，放入25℃摇床中，150rpm条件下固定12h。由图4可知，在其他条件不变的情况下，随着树脂投放量的不断增加，固定化脂肪酶的酶活回收率随之上升，当树脂质量为5.0g时酶活回收率达到最大82.46％，树脂与酶的结合达到饱和，之后随着树脂投放量的增加，回收率不再提高。
1.6固定化温度对脂肪酶固定化的影响
配置1mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液，用其溶解酶粉制备成浓度为2mg/ml的酶液，取上述酶液4ml于50ml离心管中，准确称取5g环氧树脂lxep-120于其中，分别在18、20、22、24、26、28℃摇床中，150rpm条件下固定12h。由图5可知，固定化脂肪酶的酶活回收率随着温度上升而升高，在22℃时有最大值。之后温度升高，酶活回收率反而下降。
1.7固定化时间对脂肪酶固定化的影响
配置1mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液，用其溶解酶粉制备成浓度为2mg/ml的酶液，取上述酶液4ml于50ml离心管中，准确称取5g环氧树脂lxep-120于其中，在22℃摇床中，150rpm条件下固定24h。由图6可知，在1～4h阶段，固定化脂肪酶的酶活随着固定时间的增加而升高，在4h时达到酶活最大值。但这个时候的酶分子与树脂之间只是简单的吸附，只有很少一部分发生了共价结合。在4～12h酶活有轻微下降，这应该是酶与载体形成单点共价键所导致的。在后续的试验中，选择12h作为脂肪酶的固定化时间。
实施例2：环氧树脂固定化脂肪酶与游离酶的酶学性质比较
本实施例中环氧树脂固定化脂肪酶采用以下方法制备：
利用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/ml的酶液，10000r/min离心后得到上清液为酶液，准确称取5.0g型号为lxep-120的环氧树脂置于4ml酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶。制备得到的固定化脂肪酶的酶活约为400u/g，酶活回收率达到92.79％。
2.1固定化脂肪酶与游离脂肪酶的最适反应ph
40℃条件下，采用不同ph(6.0～10.0)的缓冲液测定游离酶(其中游离酶用ph＝6的0.05m磷酸钠缓冲液配制，浓度为1mg/ml酶液的离心后的酶液)和固定化脂肪酶的酶活，研究ph对其酶活力大小的影响。由图7可知，该脂肪酶的游离酶与固定化脂肪酶的最适反应ph都是8.0，说明脂肪酶被吸附固定到环氧树脂lxep-120后其最适反应ph不受影响。当ph在6.0～7.0之间时，游离酶和固定化脂肪酶的相对酶活力相当；但当ph大于8.0之后，固定化脂肪酶的相对酶活力显著大于游离酶，随着缓冲液碱性的增强，游离酶酶活急剧下降，而固定化脂肪酶则呈现相对较为缓慢的下降趋势，当ph达到10.0时，仍保持35％左右的相对酶活，说明固定化脂肪酶对反应缓冲液ph的敏感度较低，具有比游离酶更为广泛的ph适用范围。
2.2固定化脂肪酶与游离脂肪酶的最适反应温度
设定缓冲液的ph＝6.0，分别在20～60℃条件下测定游离酶(其中游离酶是用ph＝6的0.05m磷酸钠缓冲液配置，浓度为1mg/ml酶液离心后的酶液)和固定化脂肪酶的酶活，研究温度对其酶活力大小的影响。由图8可知，脂肪酶被固定化后最适反应温度由原来的40℃上升到45℃，这应该是环氧树脂对酶分子提供了一定的保护。当温度大于45℃之后，游离酶与固定化脂肪酶的酶活都随着温度的升高而降低，但游离酶的下降趋势明显大于固定化脂肪酶。在60℃高温条件下，固定化脂肪酶仍能发挥70％左右的酶活，而游离酶仅存15％左右。说明脂肪酶被固定于环氧树脂lxep-120后，对反应温度的敏感性降低，能在较高温度下保持较好的酶活，适用的范围比较广。
2.3固定化脂肪酶与游离脂肪酶的ph耐受性
分别将固定化脂肪酶与游离酶放置在ph为4、5、6、7、8、9、10的0.5m的缓冲液中，室温处理6h，然后在最适反应条件下测定剩余酶活，对照组不做处理，其中游离酶是浓度为1mg/ml的离心后的酶液。由图9可知，脂肪酶经固定化后，在碱性缓冲液中，比游离酶表现出更好的耐受性。在ph大于7后，随着溶液碱性的增强，游离酶的酶活快速下降，而固定化脂肪酶的下降趋势相对平缓。固定化脂肪酶在ph＝10的条件下处理6h后，仍保存最初酶活的80％以上，游离酶在此条件下只剩下60％的相对酶活。
2.4固定化脂肪酶与游离脂肪酶的温度稳定性
称取一定质量的固定化脂肪酶，在40～80℃(间隔5℃)条件下处理6h，然后测定残余酶活，对照组是放置在4℃的固定化脂肪酶；用ph＝6的0.05m磷酸钠缓冲液配制浓度为1mg/ml酶液，离心后在40～80℃(间隔5℃)条件下处理6h，然后测定残余酶活。由图10可知，在40～50℃时，固定化脂肪酶和游离酶处理6h后剩余的残余相对酶活基本相同；当温度大于50℃后，游离酶的酶活迅速下降，在70℃左右基本处于完全失活状态，而固定化脂肪酶在高温条件下(80℃)处理6h后仍能保持50％左右的酶活，显示出良好的耐热性能。
2.5固定化脂肪酶的工作稳定性
称取一定质量的固定化脂肪酶，在40℃，ph＝7.0条件下连续不间断反应10次，以第一次反应测得的酶活为100％。由图11可知，在重复操作10批次后，固定化脂肪酶的底物催化活性为最初的70％左右，这是由于在反应过程中，固定化脂肪酶受到了搅拌剪切力的作用，部分结合不牢固的酶分子从载体上脱落导致的。脂肪酶固定到环氧树脂上后，实现了重复回收利用，且在连续反应试验中具有较好的稳定性，可以在工业生产中进行推广。
2.6固定化脂肪酶的储存稳定性
将抽滤干燥后的固定化脂肪酶密封保存在4℃冰箱中，每隔一段时间测定其酶活(45℃、ph＝8.0)，以第一次反应测得的酶活为100％。由图12可知，该固定化脂肪酶稳定性较好，易于储存，在4℃条件下储存一个月后仍保持80％左右的酶活。