本发明涉及抗体、尤其是抗体175及其片段，其与egf受体、尤其是扩增或过表达的表皮生长因子受体(egfr)和egfr的de2-7egfr截短体结合。这些抗体可用于诊断和治疗癌症。本发明的抗体也可用于与化疗剂或抗癌剂和/或与其他抗体或其片段联合治疗。
背景技术：
：增生性疾病、尤其是癌症的化学治疗通常依赖于利用人体或动物体内靶标增殖细胞和其他正常细胞的差别。例如，许多化学制剂设计成被迅速复制的dna吸收，由此破坏dna的复制和细胞分裂的过程。另一种方法是鉴定在已发育的人体组织中正常不表达的肿瘤细胞或其他异常细胞表面的抗原，例如肿瘤抗原或胚胎抗原。此类抗原可用结合蛋白例如抗体靶向，其可以阻断或中和该抗原。此外，所述结合蛋白、包括抗体及其片段可递送毒性剂或可以在肿瘤位点直接或间接的激活毒性剂的其他物质。egfr是肿瘤靶向抗体治疗的很有吸引力的靶标，因为它在许多上皮肿瘤类型中过表达(voldborg，b.r.，等(1997)annoncol8：1197-206；deneynde，b.andscott，a.m.(1998)tumorantigens.in：p.j.delvesandi.m.roitt(eds.)，encyclopediaofimmunology，secondeditionedition，pp.2424-31.london：academicpress)。此外，egfr的表达与许多肿瘤类型中的不良预后有关，包括胃瘤、结肠瘤、膀胱瘤、乳瘤、前列腺瘤、子宫内膜瘤、肾瘤和脑瘤(例如神经胶质瘤)。因此，文献报道了许多egfr抗体，某些正在进行临床评价(baselga，j.，等(2000)jclinoncol.18：904；faillot，t.，等(1996)neurosurgery39：478-83；seymour，l.(1999)cancertreatrev25：301-12)。在头颈癌、鳞状上皮细胞肺癌、脑神经胶质瘤和恶性星形细胞瘤患者中使用egfr单抗研究的结果是令人鼓舞的。大多数egfr抗体的抗肿瘤活性通过其阻断配体结合的能力得到提升(sturgis，e.m.，等(1994)otolaryngolheadnecksurg111：633-43；goldstein，n.i.，等(1995)clincancerres1：1311-8)。此类抗体可通过调节细胞增殖和抗体依赖性的免疫功能(例如补体激活)起作用。然而，这些抗体的使用可能受到具有高内源性egfr水平的器官例如肝和皮肤的吸收限制(baselga，j.，等(2000)jc1inoncol.18：904；faillot，t.，等(1996)neurosurgery39：478-83)。相当一部分含有egfr基因扩增(即多个egfr基因拷贝)的肿瘤同时共表达该受体的截短形式(wikstrand，c.j.，等(1998)jneurovirol4：148-58)，称为de2-7egfr、δegfr或δ2-7(本文中可交换使用的术语)(olapade-olaopa，e.o.，等(2000)brjcancer82：186-94)。de2-7egfr中该可见的重排产生缺少801个核苷酸的框架内成熟mrna，其跨越外显子2-7(wong，a.j.，等(1992)procnatlacadsciusa89：2965-9；yamazaki，h.，等(1990)jpnjcancerres81：773-9；yamazaki，h，等(1998)molcellbiol8：1816-20；sugawa，n.，等(1990)procnatlacadsciusa87：8602-6)。相应的egfr蛋白具有包括胞外结构域残基6-273的267个氨基酸的缺失，和在融合接头处的新的甘氨酸残基(sugawa，n.，等(1990)procnatlacadsciusa87：8602-6)。该缺失以及甘氨酸残基的插入在缺失接口处产生了独特的接合肽。de2-7egfr在多种肿瘤类型中报道，包括神经胶质瘤、乳瘤、肺瘤、卵巢瘤和前列腺瘤(wikstrand，c.j.，等(1997)cancerres.57：4130-40；olapade-olaopa，e.o.，等(2000)brjcancer82：186-94；wikstrand，c.j.，等(1995)cancerres55：3140-8；garciadepalazzo，i.e.，等(1993)cancerres53：3217-20)。尽管该截短的受体不结合配体，其具有低组成性活性，为在裸小鼠中作为肿瘤异种移植物生长的神经胶质瘤细胞提供了显著的生长有利条件(nishikawa，r.，等(1994)procnatlacadsciusa91：7727-31，1994.)，并且能够转化nih3t3细胞和mcf-7细胞(batra，s.k.，等(1995)cellgrowthdiffer6：1251-9)。de2-7egfr在神经胶质瘤细胞中利用的细胞机制未完全确定，但有报道包括减少的细胞凋亡和小幅增强的增殖(nagane，m.，等(1996)cancerres56：5079-86)。由于该截短受体的表达局限于肿瘤细胞，其代表了抗体治疗的高特异性靶点。因此，许多实验室报道了对该独特的de2-7egfr肽特异性的多克隆和单克隆抗体的制备(wikstrand，c.j.，等(1998)jneurovirol4：148-58；humphrey，p.a.，等(1990)procnatlacadsciusa87：4207-11；okamoto，s.，等(1996)brjcancer73：1366-72；hills，d.，等(1995)intjcancer63：537-43)。经用该独特的de2-7肽免疫后分离的一系列小鼠单抗均显示对该截短受体的选择性和特异性，以及靶向裸小鼠中生长的de2-7egfr阳性异种移植物(wikstrand，c.j.，等(1995)cancerres55：3140-8；reist，c.j.，等(1997)cancerres57：1510-5；reist，c.j.，等(1995)cancerres55：4375-82)。然而，de2-7egfr抗体的一个潜在的缺点是仅部分显示egfr基因扩增的肿瘤同时表达de2-7egfr。因此，de2-7egfr特异性抗体仅在一部分egfr阳性肿瘤中有效。因此尽管egfr抗体活性的现有证据是令人鼓舞的，其仍然具有上述反映的应用范围和效能的观察到的限制。因而需要开发具有广泛肿瘤效能的抗体和类似制剂，这也是本发明所要实现的目标。此外，不存在扩增、过表达或突变时不靶向正常组织和egfr的抗体尤其有用。wo02092771和wo05081854已描述了一个这样的抗体——单克隆抗体mab806。其他此类抗体是需要和期望的。本文中参考文献的引用不应被解释为承认其构成本发明的现有技术。技术实现要素：本发明的抗体抗体175及其片段或单体、重组体或来源于其的杂合抗体识别这样的egfr表位，其发现于致瘤、过度增殖或异常细胞，在正常或野生型细胞中则检测不到。本发明的抗体进一步用本文所述抗体mab175加以说明。本发明描述了靶向与前文所述单克隆抗体(mab)806(描述于wo02092771和wo05081854中)同种egf受体表位的抗体。mab175的互补决定区(cdrs)、抗原结合的最重要氨基酸与806抗体高度同源，仅有几个氨基酸的区别。抗体与其靶抗原的结合由其重链和轻链的互补决定区(cdrs)介导。有3个cdr区cdr1、cdr2和cdr3，因此，基于mab175重链或轻链、优选两者的cdr区的抗体是用于诊断和治疗(包括体内治疗)的有效抗体。基于所鉴定的mab175抗体cdr的抗体可有效用于靶向含扩增的egfr的肿瘤，而与其de2-7egfr状态无关。由于mab175不与正常、野生型受体显著结合，其在正常组织中将没有显著吸收，这就避免了现有研发的egfr抗体的限制。已测定了靶向egf受体的单克隆抗体175序列，该抗体的cdr区具有图1所示的氨基酸序列。这里提供了各轻链和重链的cdr。ab175轻链cdr相应于cdr1(seqidno：1)、cdr2(seqidno：2)和cdr3(seqidno：3)。ab175重链cdr相应于cdr1(seqidno：4)、cdr2(seqidno：5)和cdr3(seqidno：6)。类似于抗体806，本发明的175抗体同时识别扩增的野生型egfr和de2-7egfr，还结合与de2-7egfr突变的独特接合肽不同的表位(接合肽leekkgnyvvtdh(seqidno：13))。mab175结合a431细胞表面，其具有egfr基因的扩增但不表达de2-7egfr。重要的是，mab175像mab186一样不显著结合正常组织例如肝和皮肤，其表达高水平的内源性野生型(wt)egfr，但其中的egfr无异常表达或扩增。虽然在表位结合，免疫组化染色等方面与mab806具有非常类似的性质，mab175显示在治疗表达de2-7egf受体的人神经胶质瘤异种移植物中具有比mab806更高的效力。一方面，本发明提供了能结合抗原的抗体，其中所述抗体包含多肽结合结构域，其包含基本上如ab175轻链的cdr(包括cdr1、cdr2和/或cdr3)所列出的，包括如seqidnos：1-3中所示的氨基酸序列。另一方面，本发明提供了能结合抗原的抗体，其中所述抗体包含多肽结合结构域，其包含基本上如ab175重链的cdr(包括cdr1、cdr2和/或cdr3)所列出的，包括如seqidnos：4-6中所示的氨基酸序列。因此，本发明涉及重组、人源化、嵌合、镶盖(veneered)或其他此类抗体或抗体肽，包括包含ab175重链和/或轻链cdr的结构域肽。这些抗体的轻链可包括如seqidnos：1-3所示的序列，重链可包括如seqidnos：4-6所示的序列。在一个优选的实施方案中，结合结构域为人抗体框架携带。在其他方面，本发明提供了分离的核酸，其包含编码上述定义抗体的序列，以及制备本发明抗体的方法，其包括在一定条件下表达所述核酸以表达所述结合成员，以及回收该结合成员。本发明的又一个方面是此类抗体与其他抗体，例如结合egfr的抗体，优选与之结合的抑制性配体，的组合物。这些组合物可为“一罐”鸡尾酒、试剂盒等，优选配制成易于施用的形式。根据本发明的抗体或其片段可用于治疗或诊断人或动物体的方法中，例如治疗人类患者肿瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的本发明抗体。本发明还涉及重组dna分子或克隆的基因，或其简并变体，其编码本发明的抗体。优选核酸分子，尤其是编码图1所示抗体vhcdr1、2和/或3结构域(seqidnos：4-6)的重组dna分子或克隆的基因。在另一个实施方案中，本发明还涉及重组的dna分子或克隆的基因，或其简并变体，优选核酸分子，尤其是编码图1所示抗体vlcdr1、2和/或3结构域(seqidnos：1-3)的重组dna分子或克隆的基因。在本发明的另一个实施方案中，编码本文中提供序列的重组dna分子或克隆基因的全dna序列可与表达控制序列可操作地连接，其可以被引入适当的宿主中。本发明因此延伸至用所述克隆基因或重组dna分子转化的单细胞宿主，所述克隆基因或重组dna分子包含编码本抗体vh和/或vlcdr或其部分的dna序列，更具体而言，包含编码上示和图1所示和seqidnos：1、2、3、4、5和/或6的vh和/或vlcdr的dna序列。本发明自然涉及若干制备抗体及其活性片段的方法，包括本文中说明的已知的重组技术。本发明因此预期在其范围内覆盖这些合成或嵌合抗体制剂。本文中公开的核酸和氨基酸序列的分离促进了通过此类重组技术对本发明抗体的复制，因此，本发明延伸至用于在宿主系统中通过重组dna技术表达的制备的表达载体，以及生成的转化的宿主。本发明提供了药物或其他实体，包括抗体例如抗独特型抗体，其能够结合抗体由此调节、抑制或加强抗体活性。这些抗独特型抗体在开发特异性结合抗体例如mab175或其表位或加强其活性的药物中是有用的。本发明的诊断用途延伸至本发明抗体在鉴定肿瘤或细胞样品或筛选肿瘤或癌症的测定中的用途，包括体外和体内诊断测定。在免疫测定中，制备控制量的抗体或类似物，用酶、特异性结合伴侣和/或放射性元素标记，随后引入细胞样品中。在所标记的物质或其结合伴侣有机会与样品中的位点反应后，通过已知技术(根据所用标记的性质而不同)检测所得物质。本发明的抗体可携带可检测或功能性的标记。特异性结合成员可携带放射性标记，例如同位素3h、14c、32p、35s、36cl、51cr、57co、58co、59fe、90y、121i、124i、125i、131i、111in、211at、198au、67cu、225ac、213bi、99tc和186re。当使用放射性标记时，可使用已知的现有计数方法鉴别和量化抗体。在所述标记为酶时，可通过本领域中已知的任何正在使用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流测定法或气体定量技术完成检测。放射标记的抗体及其片段在体外诊断技术和体内放射显影技术中是有用的。在本发明的另一个方面，放射标记的抗体及其片段、尤其是放射免疫缀合物在放射免疫疗法中是有用的，尤其是作为癌症治疗的放射标记抗体。在又一个方面，放射标记的抗体及其片段在放射免疫引导手术技术中是有用的，其中它们能在手术前，手术期间或手术后鉴定和指示癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞的存在和/或位置，以除去这些细胞。本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白，还包括但不限于与化学烧蚀剂、毒素、免疫调节物、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂或药物缀合的结合成员，其中本发明的抗体及其片段缀合或连接于其他分子或试剂。本发明包括测定系统，其可制成检测试剂盒的形式，用于诸如扩增的egfr或de2-7egfr存在程度的定量分析。该系统或检测试剂盒可包含由本文中讨论的一种放射性和/或酶技术制备的标记成分，偶联标记与抗体，以及一种或更多种附加的免疫化学试剂，至少其中一种是要测定的自由或固定的成分或其结合伙伴。在另一个实施方案中，本发明涉及某些治疗方法，其基于抗体或其活性片段的活性，或已确定具有同种活性试剂或其他药物。第一治疗方法与癌症的预防或治疗有关，包括但不限于头颈癌、乳癌、前列腺癌和神经胶质瘤。具体而言，本发明的抗体(在一个具体实施方案中为175抗体或其活性片段和来源于其的嵌合(双特异性)或合成抗体，所述175抗体cdr结构域区序列如本文中的图1和seqidno：1-6所示)可制成包括适当赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物，用于适于治疗，例如治疗癌症时的施用。这些药物组合物还可包括通过本领域已知的方法调节抗体或片段半衰期的方法，例如peg化。这些药物组合物还可包括其他抗体或治疗剂。因此，本发明的组合物可单独或与其他治疗、治疗剂或试剂联合，同时或连续施用，其依赖于所治疗的状况。此外，本发明涉及并包括包含本文所述抗体或其片段，以及其他试剂或治疗剂例如抗癌剂或治疗剂、抗egfr剂或抗体，或免疫调节剂的组合物。更普遍的，这些抗癌剂可以是酪氨酸激酶抑制剂或磷酸化级联抑制剂、翻译后调节剂、细胞生长或分裂抑制剂(例如抗有丝分裂剂)、pdgfr抑制剂或信号转导抑制剂。其他治疗或治疗剂可包括施用适当剂量的疼痛舒缓药物，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或麻醉剂例如吗啡，或抗催吐剂。因此，这些试剂可以是抗egfr特异性的试剂，诸如ag1478，或可以是更普遍的抗癌和抗肿瘤剂。非限制性的实例包括阿霉素、卡铂和顺铂。此外，所述组合物可与免疫调节剂一起施用，例如白介素、肿瘤坏死因子(tnf)或其他生长因子、细胞因子或激素例如地塞米松，其刺激免疫应答和癌细胞或肿瘤减少或消失。所述组合物还可与其他抗egfr抗体一起施用，或可包括与其他抗egfr抗体的组合，所述抗egfr抗体包括但不限于抗egfr抗体mab806、抗体528、225、sc-03、108(atcchb9764)，美国专利号6,217,866、14e1(美国专利号5,942,602)、dh8.3、l8a4、y10、humax-egfr(genmab/medarex)、icr62和abx-egf(abgenix)。本发明还包括抗体及其片段，其共价连接或与其他分子或试剂缔合。这些其他分子或试剂包括但不限于：具有显著识别特征的分子(包括抗体或抗体片段)、毒素、配体和化学治疗剂。通过参照随后的示范性附图和所附的权利要求阅读随后的详细说明后，其他目的和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。附图简述图1：mab806和mab175的cdr氨基酸序列比对。两种抗体间的序列差异用粗体表示。图2：使用mab175免疫组化染色细胞系和正常人肝。a：使用生物素化的mab175染色从含a431细胞(过表达wtegfr)、u87mg.δ2-7细胞(表达δ2-7egfr)和u87mg细胞(以中等水平表达wtegfr)的块制备的切片。b：使用mab175(左侧)、同种型对照(中间)和第二抗体对照(右侧)染色正常人肝(400x)。未观察到特别的窦状或肝细胞染色。图3：mab806和mab175与展示在酵母上的egfr片段的反应性。a：代表性的流式细胞计量柱状图，其描述了标记酵母展示的egfr片段的mab806和mab175的平均荧光信号。通过酵母展示，一定百分比的细胞未在表面表达蛋白，产生2个柱状峰。由于所有的片段含线性c末端c-myc标记，使用9e10抗体作为阳性对照。b：与不同egfr片段结合的抗体概述。c：加热酵母粒至80℃30分钟，变性egfr片段。所有实例中c-myc标记依然被9e10抗myc抗体识别，表明热处理并不能损害酵母表面展示的蛋白。使用构象敏感性egfr抗体mab225证实变性。图4：mab175对脑和前列腺癌异种移植物的抗肿瘤效应。a：给具有u87mg.δ2-7异种移植物的小鼠(n＝5)腹腔注射pbs、1mgmab175或mab806(阳性对照)，每周三次，两周，在第6、8、10、13、15和17天注射，起始肿瘤体积为100mm3。数据以平均肿瘤体积±se表示。b：细胞用两种无关的抗体(蓝色、实心和绿色、中空)、总egfr的mab528(粉色，实心)、mab806(浅蓝色，中空)和mab175(橙色，中空)染色，随后用facs分析。c：裂解du145细胞，利用mab528、mab806、mab175或两种独立的不相关抗体进行ip，随后对egfr免疫印迹。d：给具有du145异种移植物的小鼠(n＝5)腹腔注射pbs、1mgmab175或mab806，在第18-22、25-29和39-43天每天注射，起始肿瘤体积为85mm3。数据用平均肿瘤体积±se表示。图5：结合fab片段的egfr肽287-302的晶体结构(a)fab806的草图，轻链：红色；重链：蓝色；结合肽：黄色；egfr的egfr287-302重叠区：紫色。(b)fab175的草图，轻链：黄色；重链：绿色；结合肽：淡紫色；egfr(d1-3)的egfr287-302：紫色。(c)(b)的详细情况显示受体中的egfr287-302与结合fab175的肽类似。肽骨架以cα带表示，相互作用的侧链以棒表示。o原子染成红色；n：蓝色；s：橙色；c作为主链。(d)egfr与fab175：肽复合物的叠合图，显示空间重叠。按(c)中染色，egfr187-286的表面染为蓝绿色。(e)(d)的正交视图，egfr187-286为不透明蓝色，轻链(橙色)和重链(绿色)表面为透明的。(f)175fab复合物按抗原结合部位方向查看的详细立体视图，按(c)中染色，侧链氢键以黑色虚线表示。复合物形成时包埋的水分子以红色球表示。图6：271-283半胱氨酸键对mab806和egfr结合的影响。a：用wtegfr、egfr-c271a、egfr-c283a或c271a/c283a突变体转染的细胞用mab528(实心粉色柱状图)、mab806(蓝线)或仅第二抗体(紫色)染色，随后用facs分析。使用类型匹配的无关抗体获得结果。b：在mtt测试中测定了表达egfr-c271a或c271/283aegfr的baf3细胞对egf的响应，如方法中所述。使用数据点的bolzman拟合获得ec50。数据表示三组重复测量的平均值和标准差。c：il-3和血清饥饿培养表达wt或egfr-c271a/c283a的baf3细胞，随后暴露于egf或赋形剂对照中。通过sds-page分离全细胞裂解物，用抗磷酸酪氨酸抗体(上面)或抗egfr抗体(下面)免疫印迹。d：用递增浓度的egf在无抗体(开口标记)、mab528(灰色圆圈)或mab806(灰色三角)存在下刺激表达wt(左图)或c271a/c283a(右图)egfr的baf3细胞，所述抗体浓度均为10μg/ml。数据用三组重复测量的平均值和标准差表示。图7：a)声带转移性鳞状上皮细胞癌患者中111in-ch806生物分布的全身γ成像，显示在右颈(箭头)处肿瘤的定量高吸收。同时可见血池活性和自由111in在肝中的次要分解代谢。b)该患者颈部的单光子计算体层摄影(spect)图像，显示活体肿瘤中的111in-ch806吸收(箭头)，表示坏死的中枢吸收下降。c)颈部相应的ct扫描显示中心性坏死的巨大右颈肿瘤块(箭头)。图8：不受束缚的egfr1-621结构的立体模型。受体骨架以蓝色跟踪，配体tgf-α为红色。mab806/175表位画成蓝绿色，二硫键为黄色。将表位系回受体的二硫键的原子以空间填充形式显示。该模型通过将受束缚构象的egfr-ecdcr2结构域(13)对接到其配体存在情况下不受束缚的egfr单体的结构上(14)构建。图9：mab806与egfr片段的反应性。将用表达可溶性1-501egfr片段或gh/egfr片段融合蛋白(gh-274-501、gh-282-501、gh-290-501和gh-298-501)的载体转染的293t细胞裂解物进行sds-page解析，转移至膜上，用mab806(左图)或抗myc抗体9b11(右图)免疫印迹分析。具体实施方式根据本发明，可使用本领域技术之内的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。这些技术在文献中有详尽的描述，参见例如sambrook等，″molecularcloning：alaboratorymanual″(1989)；″currentprotocolsinmolecularbiology″volumesi-iii[ausubel，r.m.，ed.(1994)]；″cellbiology：alaboratoryhandbook″volumesi-iii[j.e.celis，ed.(1994))]；″currentprotocolsinimmunology″volumesi-iii[coligan，j.e.，ed.(1994)]；″oligonucleotidesynthesis″(mj.gaited.1984)；″nucleicacidhybridization″[b.d.hames&s.j.higginseds.(1985)]；″transcriptionandtranslation″[b.d.hames&s.j.higgins，eds.(1984)]；″animalcellculture″[r.i.freshney，ed.(1986)]；″immobilizedcellsandenzymes″[irlpress，(1986)]；b.perbal，″apracticalguidetomolecularcloning″(1984)。因此，如果在本文出现，本文中下列术语具有下文中所给出的定义。a.术语各种语法形式的术语“异常表达”表示和包括蛋白在组织中任何增强或改变的表达或过表达，例如由包括增强表达或翻译、蛋白启动子或调节物的调节，蛋白基因的扩增或增加的半衰期或稳定性的任何方法引起的蛋白量的增加，由此相对于非过表达状态更多的蛋白存在或可在任一时间检测。异常表达包括并涉及任何方案或改变，其中细胞中的蛋白表达或翻译后修饰机制由于增强的蛋白表达或蛋白水平或量的增加而重度负荷或受损，包括其中表达改变的蛋白，例如由于序列改变、缺失或插入或折叠改变而突变的蛋白或变体。应当着重理解的是，本文中特别选择的术语“异常表达”包括这样的状态：其中存在异常(通常是增加)量/水平的蛋白，而不考虑该异常量或水平的有效原因。因此，异常量的蛋白可在无基因扩增情况下由蛋白的过表达产生，其例如在癌症受试者的头和颈部获取的许多细胞/组织样本中存在；而其他样本则具有可归因于基因扩增的异常蛋白水平。在后一种关系中，本文中给出了本发明人们的某些工作以说明本发明，其包括分析其中某些具有由efgr扩增导致的异常蛋白水平的样品。这因此解释了本文中参考扩增的实验结果以及术语“扩增/扩增的”等在描述efgr的异常水平的使用。然而，由于蛋白的异常数量或水平的观察定义了预期凭借本发明结合成员临床干预的环境或情况，本说明书认为术语“异常表达”更宽泛的包括引起efgr水平相应异常的原因环境。因此，虽然各种语法形式的术语“过表达”和“扩增”理解为具有不同的技术含义，但在本发明的背景下表示具有异常efgr蛋白水平的状态时，它们被认为是等价的。因此，选择了术语“异常表达”，因为它被认为用于本文目的时在它的范围内包含术语“过表达”和“扩增”，因此所有的术语当用于本文中时均认为是等价的。术语“抗体”描述了天然或部分或全部合成的免疫球蛋白。该术语也包括任何具有抗体结合结构域或与之同源的结合结构域的多肽或蛋白。cdr移植的抗体同样包括在该术语内。由于抗体可以多种方式修饰，术语“抗体”应当解释为包括任何具有具有所需特异性的结合结构域的特异性结合成员或物质。因此，该术语覆盖了抗体片段、衍生物、功能等价物和抗体的同系物，包括任何包含免疫球蛋白结合结构域的天然或全部或部分合成的多肽。包含与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子也因此包括在内。嵌合抗体的克隆和表达描述于ep-a-0120694和ep-a-0125023和美国专利号4,816,397和4,816,567中。已显示全抗体的片段可行使结合抗原的功能。结合片段的实例有(i)由vl、vh、cl和ch1结构域组成的fab片段；(ii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iii)由单个抗体的vl和vh结构域组成的fv片段；(iv)dab片段(ward，e.s.等，nature341，544-546(1989))，其由vh结构域组成；(v)分离的cdr区；(vi)f(ab′)2片段，包含两个相连的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过肽接头连接，其使得这两个结构域一起形成抗原结合位点(bird等，science，242，423-426，1988；huston等，pnasusa，85，5879-5883，1988)；(viii)多价抗体片段(scfv二聚体、三聚体和/或四聚体(powerandhudson，jimmunol.methods242：193-2049(2000))；(ix)双特异性单链fv二聚体(pct/us92/09965)和(x)“双抗体(diabody)”，由基因融合构建的多价或多特异性片段(wo94/13804；p.holliger等proc.natl.acad.sci.usa906444-6448，(1993))。“抗体结合位点”是抗体分子的结构部分，其组成为特异性结合抗原的轻链或重和轻链可变和高变区。本文中，各种语法形式的术语“抗体分子”包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。示范性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子，基本完整的免疫球蛋白分子和含有互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域已知的为例如fab、fab′、f(ab′)2和f(v)的那些部分，这些部分优选用于本文中所述的治疗方法中。抗体也可以是双特异性的，其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员，另一个结合结构域具有不同的特异性，例如募集(recruit)效应器(effector)功能等。本发明的双特异性抗体包括这样的抗体，其中所述抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员，包括其片段，另一个结合结构域是不同的抗体或其片段，包括不同的抗egfr抗体、例如抗体528(美国专利号4,943,533)，嵌合和人源化225抗体(美国专利号4,943,533和wo/9640210)，抗de2-7抗体例如dh8.3(hills，d.等(1995)int.j.cancer63(4)：537-543)，抗体l8a4和y10(reist，cj等(1995)cancerres.55(19)：4375-4382；fouloncf等(2000)cancerres.60(16)：4453-4460)，icr62(modjtahedih等(1993)cellbiophys.jan-jun；22(1-3)：129-46；modjtahedi等(2002)p.a.a.c.r.55(14)：3140-3148，或wiksttrand等的抗体(wikstrandc.等(1995)cancerres.55(14)：3140-3148)。另一个结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，例如神经或神经胶质细胞特异性抗体。在本发明的双特异性抗体中，本发明抗体的一个结合结构域可与识别特定细胞受体和/或调节特定类型细胞的其他结合结构域或分子组合，例如免疫调节物(例如白介素、生长调节物或细胞因子(例如肿瘤坏死因子(tnf)，尤其是2002年2月13目提交的u.s.s.n.60/355,838中所述的tnf双特异性形式，其整体引入本文)或毒素(例如蓖麻毒素)或抗有丝分裂或细胞凋亡剂或因子。抗体分子的fab和f(ab′)2部分可通过用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别水解基本完整的抗体分子制备，其采用的方法是公知的，例如参见授予theofilopolous等人的美国专利号4,342,566。fab′抗体分子部分也是公知的，其从f(ab′)2部分制备，首先用例如巯基乙醇还原连接两条重链部分的二硫键，随后用诸如碘乙酰胺的试剂烷基化所得的蛋白硫醇。本文中优选含有完整抗体分子的抗体。各种语法形式的术语“单克隆抗体”是指仅具有一种能与特定抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体。单克隆抗体因此通常具有对与之免疫反应的任何抗原的单结合亲合力。单克隆抗体还可以含有具有复数个抗体结合位点的抗体分子，每个位点对不同的抗原免疫特异性。例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。术语“抗原结合结构域”描述了这样的抗体部分，其包括特异性结合并与抗原的部分或全部互补的区域。当抗原巨大时，抗体可仅结合该抗原的特定部分，该部分被称为表位。抗原结合结构域可由一个或更多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。“翻译后修饰”可包括任意修饰或其组合，包括共价修饰，蛋白在翻译完成后和从核糖体释放后或共翻译地在新生多肽上进行其。翻译后修饰包括但不限于磷酸化、十四烷基化、遍在蛋白化、糖基化、辅酶连接、甲基化和乙酰化。翻译后修饰可调节或影响蛋白的活性，其胞内或胞外的目标(destination)，其稳定性或半衰期和/或其被配体、受体或其他蛋白的识别。细胞器内、核内或细胞质内或细胞外可能发生翻译后修饰。术语“特异性”可用于指特异性结合对中的一个成员不显著结合其特异性结合伙伴外的任何分子。该术语也可用于例如抗原结合结构域对多种抗原具有的特定表位特异性时，在该情形下，具有该抗原结合结构域的特异性结合成员能够结合具有该表位的各种抗原。术语“包含”通常用于包括的含义，即允许一个或更多个特征或成分的存在。术语“基本上由......组成”是指一种产品，尤其是具有确定数目残基的肽序列，其不与更大的产品共价连接。在上文提及的本发明肽的情况下，然而本领域技术人员将会理解，对所述肽n-或c-末端的微小修饰也包括在内，例如化学修饰末端添加保护基团等，例如c末端的酰胺化。根据本发明，术语“分离的”是指本发明抗体、或编码所述抗体或其cdr的核酸所处的状态。抗体与核酸不含或基本不含与其天然相关的物质，例如在其天然环境下或通过体内或体外重组dna技术制备的制备环境(例如细胞培养物)下发现的共存的其他多肽或核酸。抗体与核酸可与稀释剂或佐剂配制，进一步分离以供实践——例如当免疫测定中用于覆盖微量滴定板时，所述成员通常与明胶或其他载体混合；或当用于诊断或治疗时与可药用载体或稀释剂混合。抗体可以是天然糖基化的或由异源真核细胞的系统糖基化，或者其可以是未糖基化的(例如通过在原核细胞中表达产生时)。同样，本文中术语“糖基化”和“糖基化的”包括通过添加寡糖的蛋白翻译后修饰，所述蛋白称为糖蛋白。寡糖添加到糖蛋白的糖基化位点，尤其包括n-连接寡糖和o-连接寡糖。n-连接寡糖加入到asn残基，尤其是当所述asn残基位于序列n-x-s/t中时，是糖蛋白中发现的最常见形式，其中x不能是pro或asp。在n-连接糖蛋白的生物合成中，高甘露糖型寡糖(通常包括多萜醇、n-乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖，首先在内质网(er)中形成)。所述高甘露糖型糖蛋白随后从er转运至高尔基体，进行进一步的寡糖加工和修饰。o-连接寡糖加入到ser或thr残基的羟基基团。在o-连接的寡糖中，n-乙酰葡萄糖胺首先通过er中的n-乙酰葡萄糖胺基转移酶转移到ser或thr残基上。所述蛋白随后转移至高尔基体，进一步修饰和链延伸。可在那些ser或thr位点简单添加单独og1cnac单糖进行o-连接修饰，所述位点也可在不同的条件下磷酸化而非糖基化。本文中“pg”表示皮克，“ng”表示纳克，“ug”或“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“ul”或“μl”表示微升，“ml”表示毫升，“l”表示升。术语“抗体175”、“175抗体”、“mab175”以及此处未特别列出的任何变体在本文中可交换地使用，用于整个本申请和权利要求中时，指包括单个或多个蛋白的蛋白质性材料，并且包括那些具有本文中所述氨基酸序列数据的蛋白，如图1所示，具有或包括如seqidnos：1、2、3、4、5和/或6所示的氨基酸序列，以及具有本文中和权利要求中所述的活性特征。因此，具有基本等价或改变活性的蛋白也包括在内。这些修饰是故意的，例如通过定向诱变获得的修饰，或者是意外的，例如通过生产复合物或其指明的亚单位的宿主内突变获得的修饰。同样，术语“抗体175”、“175抗体”和“mab175”意图在其范围内包括本文中特别引用的蛋白及其所有的基本同源类似物和等位基因变异。本文中描述的氨基酸残基优选为“l”异构型。然而，“d”异构型的残基可取代任何l-氨基酸残基，只要该多肽保留了需要的免疫球蛋白结合功能。nh2是指多肽氨基末端存在的自由氨基基团。cooh是指多肽羧基末端存在的自由羧基基团。根据标准多肽命名法，j.biol.chem.，243：3552-59(1969)，以下对应表给出了氨基酸残基的缩写：对应表应当注意的是，本文中所有氨基酸残基序列以从左到右的方向为常规的氨基端到羧基端的方向的规则表示。此外，应当注意氨基酸残基序列起始或末端处的横线表示与一个或更多个氨基酸残基的其他序列间的肽键。上表将三字母和一字母表示法关联起来，其在本文中可交替出现。“复制子”是任何作为体内dna复制自主单元起作用的遗传成分(例如质粒、染色体、病毒)，即能够在其自身控制下复制。“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其可以连接另一个dna片段，从而复制所连接的片段。“dna分子”是指单链或双链螺旋的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，不限于任何特定的三级结构。因此，该术语包括尤其在线状dna分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链dna。在讨论特定双链dna分子的结构时，本文中以常规沿dna非转录链(即具有与mrna同源序列的链)的5’-3’方向描述序列。“复制起点”是指参与dna合成的那些dna序列。dna“编码序列”是双链dna序列，其在合适的调控序列控制下时于体内转录并翻译成多肽。编码序列的范围由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mrna的cdna，来自真核(例如哺乳动物)dna的基因组dna序列，以及甚至合成的dna序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。转录和翻译控制序列是dna调控序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等，其提供编码序列在宿主细胞内的表达。“启动子序列”是能在细胞内结合rna聚合酶，起始下游(3’方向)编码序列转录的dna调控区。为定义本发明，所述启动子序列范围为其3’末端为转录起始位点，向上游(5’方向)延伸以包括起始超出背景可检测水平转录必需的最少碱基或元件数。在启动子序列内有转录起始位点(用核酸酶si作图方便地定义)以及负责rna聚合酶结合的蛋白结合结构域(一致序列)。真核启动子通常但不总是含有“tata”盒和“cat”盒。原核启动子除-10和-35一致序列外，还含有sd序列。“表达调控序列”是控制和调节另一dna序列转录和翻译的dna序列。当rna聚合酶将编码序列转录为mrna时，编码序列“受控”于细胞内的转录和翻译控制序列，所述mrna随后翻译成该编码序列编码的蛋白质。在编码序列前可包括“信号序列”。该序列编码多肽n-末端的信号肽，其与宿主细胞通信，将多肽定位至细胞表面，或分泌多肽进入介质中。该信号肽在蛋白离开细胞前由宿主细胞切除。多种原核生物和真核生物的天然蛋白均伴随信号序列。在本文中指本发明的探针时，术语“寡核苷酸”定义为由两个或更多个、优选超过3个核糖核苷酸组成的分子。其确切的大小依赖于许多因素，这些因素依赖于所述寡核苷酸的最终功能和用途。术语“引物”在本文中是指在纯化的限制性酶切消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，其能够在诱导合成与一条核酸链互补的引物延伸产物的条件下，即，在核苷酸和诱导剂例如dna聚合酶的存在下，在适当的温度和ph下，作为合成的起始点。引物可以是单链或双链的，必须足够的长以在诱导剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于多种因素，包括温度、引物来源和使用方法。例如当用于诊断时，依赖于靶标序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多个核苷酸，尽管其也可以含有更少的核苷酸。引物被选择以“基本”与特定靶标dna序列的不同链互补。这表示引物必须与相应的链足够互补以便与之杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可在引物的5’端连接非互补的核苷酸片段，剩余的引物序列与所述链互补。或者，可在引物中散布非互补性的碱基或较长的序列，只要该引物序列与其要杂交的链的序列具有足够的互补性，由此形成合成延伸产物的模板。本文中，术语“限制性内切酶”和“限制性酶”是指细菌酶，其在特定的核苷酸序列或其附近切割双链dna。当外源性或异源性dna被引入细胞时，细胞被所述dna“转化“。转化dna可以整合(共价连接)/不整合至染色体dna中，构成细胞的基因组。例如在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化dna可维持于附加体元件例如质粒中。对于真核细胞，稳定转化的细胞是这样的，其中转化dna被整合到染色体中，由此通过染色体复制被子细胞遗传。稳定性通过真核细胞建立细胞系或克隆的能力证明，所述细胞系或克隆由含有转化dna的子细胞群组成。“克隆”是通过有丝分裂来源自单细胞或共同祖先的细胞群。“细胞系”是原代细胞的克隆，其在体外能稳定生长许多代。当在给定的dna序列长度内，核苷酸匹配至少为约75％(优选至少约80％，最优选至少为约90或95％)时，两条dna序列被称为“基本同源的”。基本同源的序列可通过使用序列数据库中的标准软件比较序列鉴定，或在southern杂交实验中，例如在该特定系统中定义的严格条件下鉴定。本领域技术人员可以定义适当的杂交条件。例如参见maniatis等，上文；dnacloning，vols.i&ii，上文；nucleicacidhybridization，上文。应当理解，编码本发明抗体的dna序列也包括在本发明的范围内，其编码例如具有包含或具有与seqidno：1、2、3、4、5或6相同但简并的氨基酸序列的可变区结构域的抗体。“简并”指使用不同的三字母密码子表示特定的氨基酸。以下密码子可交换地用于编码每个特定的氨基酸，这在本领域是公知的：应当理解，上述给出的密码子适用于rna序列，dna的相应密码子用t替换u。编码本文中抗体结构域的核酸序列可进行突变，这样一个特定的密码子转变为编码不同氨基酸的密码子。所述突变通常通过改变最少可能的核苷酸进行。这一类替换突变可以非保守的方式(即，通过使属于一类具有特定大小或性质的氨基酸的密码子改变为属于另一类氨基酸的密码子)或以保守的方式(即，通过使属于一类具有特定大小或性质的氨基酸的密码子改变为属于同一类氨基酸的密码子)改变所得蛋白质中的氨基酸。这样的保守性改变通常导致所得的蛋白结构和功能变化较少。非保守的改变更可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。本发明应当认为包括含保守性改变的序列，其未显著改变所得蛋白的活性或结合性质。以下是各种氨基酸分类的一个实例：含非极性r基团的氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸含不带电极性r基团的氨基酸甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺含带电极性r基团的氨基酸(ph6.0时为负电)天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸(ph6.0时为正电)赖氨酸、精氨酸、组氨酸(ph6.0时)另一种分类是那些含苯基的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。另一种分类可根据分子量(即r基团的大小)：尤其优选的替换是：-lys替换arg，反之亦然，以维持正电荷；-glu替换asp，反之亦然，以维持负电荷；-ser替换thr，以维持自由-oh；以及-gln替换asn，以维持自由nh2。还可引入氨基酸替换以替换具有特别优选性质的氨基酸。例如，可将cys引入可能与其他cys生成二硫键的位点。可引入his作为特别的“催化”位点(即，his可作为酸或碱起作用，是生化催化中的最常用氨基酸)。pro可由于其特殊的平面结构而引入，其诱导蛋白结构中的β-转角。当两条氨基酸序列至少有约70％的氨基酸残基(优选至少约80％、最优选至少约90或95％)相同或代表保守性替换时，这两条氨基酸序列是“基本同源的”。dna构建体的“异源”区是较大dna分子内的可识别dna片段，其并非天然与该较大的分子相关。因此，当该异源区编码哺乳动物基因时，该基因侧翼通常为在来源生物体基因组中哺乳动物基因组dna侧翼不含的dna。另一个异源编码序列的例子是编码序列本身未天然发现的构建体(例如，cdna，其中基因组编码序列含有内含子，或具有不同于天然基因密码子的合成序列)。等位基因变异或天然发生的突变事件并不能产生本文所定义的dna异源区。术语“可药用的”是指生理学上可耐受的分子实体和组合物，当施用于人体时通常不产生过敏或类似的不良反应，例如心嘈、头晕等。术语“治疗有效量”在本文中表示足以预防、优选减少至少约30％、优选至少50％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％靶细胞物，癌细胞群或肿瘤的生长或进展或有丝分裂活性，或其他病理学特征的临床显著变化的量。例如，可减少egfr活化程度或egfr阳性细胞尤其是抗体或结合成员反应性或阳性细胞的活性或量或数目。当表达调控序列控制和调节dna序列的转录和翻译时，该dna序列“可操作地连接”表达调控序列。术语“可操作地连接”包括在要表达的dna序列前具有适当的起始信号(例如atg)，以及维持正确读框允许所述dna序列在表达调控序列的控制下表达，产生该dna序列编码的所需产品。如果需要插入重组dna分子的基因不包含适当的起始信号，可在该基因前插入这样的起始信号。术语“标准杂交条件”是指基本等同于5xssc和65℃杂交和洗涤的盐和温度条件。然而，本领域技术人员将会理解，这样的“标准杂交条件”依赖于特定的条件，包括缓冲液中钠和镁的浓度，核苷酸序列长度和浓度，错配百分比、甲酰胺百分比等。在确定“标准杂交条件”时同样重要的是所杂交的两条序列是rna-rna、dna-dna还是rna-dna。这样的标准杂交条件可由本领域技术人员根据公知的规则容易地确定，其中杂交通常低于预测或测定的tm10-20℃，如果需要的话，采用更高的严格度洗涤。b.发明详述本发明提供了一种新型抗体175或其片段，包括免疫原性片段。其识别egfr表位、尤其是egfr肽(287cgadsyemeedgvrkc302(seqidno：14))，其暴露于该表位增强、显露或明显的肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中，但在正常或野生型细胞中检测不到。在特定的非限制性实施方案中，该抗体识别这样的egfr表位，所述表位在简单糖修饰或早期糖基化时增强或变明显，在复合糖修饰或糖基化存在下减弱或不明显。在不存在过表达、扩增或肿瘤发生事件时，抗体或其片段不结合或识别含有正常或野生型egfr表位的正常或野生型细胞。如前所述，在本发明的一个具体方面，本发明人们发现了新型单克隆抗体175，其特异性识别扩增的野生型egfr和de2-7egfr，还结合不同于de2-7egfr突变独特接合肽的表位。此外，尽管mab175不识别神经胶质瘤细胞表面表达的正常、野生型的egfr，其结合固定于elisa板表面的egfr胞外结构域，表明了具有多肽外观的构象性表位。重要的是，mab175不显著结合正常组织，诸如肝和皮肤，其内源性wtegfr的表达水平要高于大多数其他正常组织，但其中egfr未过表达或扩增。因此，mab175表现出新的有用的特异性，其识别de2-7egfr和扩增的egfr，而不识别正常的野生型egfr或作为de2-7egfr特征的独特接合肽。在一个优选的方面，本发明的抗体175包括图1和seqidnos：1、2、3、4、5和6所示的vh和vlcdr结构域氨基酸序列。另一方面，本发明提供了能在特定条件下竞争175抗体的抗体，其中至少10％的具有175抗体的vh和vl序列的抗体在elisa测试中通过与所述抗体竞争被阻断与de2-7egfr的结合。如前所述，这里也包括抗独特型抗体。诊断和治疗用途本发明175抗体或其片段的独特特异性提供了鉴定、表征、靶向和治疗、减少或消除多种肿瘤发生细胞类型和肿瘤类型，例如头颈、乳、肺、膀胱或前列腺肿瘤和神经胶质瘤的诊断和治疗用途，而没有之前已知的egfr抗体所见的与正常组织吸收相关的问题。因此，可利用本发明的175抗体或其片段识别、分离、表征、靶向和治疗或消除过表达egfr(例如通过egfr突变体或变体扩增或表达)的细胞，尤其是表现出异常的翻译后修饰的细胞。本发明的抗体因此可通过染色或另外地识别存在egfr过表达、尤其是扩增和/或egfr突变，尤其是de2-7egfr的那些肿瘤或细胞对egfr肿瘤或肿瘤发生细胞的性质进行特异性归类。此外，本发明的175抗体表现出针对含扩增的egfr肿瘤和de2-7egfr阳性异种移植物显著的体内抗肿瘤活性。在本发明的另一方面，提供了治疗肿瘤、癌性状况、癌前状况以及任何与过度增殖细胞生长相关或由其导致的状况的方法，包括施用本发明的抗体175。本发明的抗体被设计用于诊断和治疗人或动物受试者肿瘤、尤其是上皮肿瘤的方法。这些肿瘤可以是原发或续发的任何类型实体瘤，包括但不限于神经胶质瘤、乳、肺、前列腺、头颈肿瘤。抗体产生通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。永生的抗体产生细胞系也可通过除融合外的技术，如直接用致癌dna转化b淋巴细胞或用eb病毒转染建立。参见例如m.schreier等，″hybridomatechniques″(1980)；hammerling等，″monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas″(1981)；kennett等，″monoclonalantibodies″(1980)；还见u.s.专利号4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；4,493,890。产生的针对egfr的单克隆抗体组可对多种性质筛选：即，同种型、表位、亲和性等。特别感兴趣的是模拟egfr或其亚单位活性的单克隆抗体。这些单克隆抗体可在特异性结合成员活性测试中方便地鉴定。高亲和性抗体在免疫亲和纯化天然或重组特异性结合成员时也是有用地。用于实施本发明的单克隆抗体可从包含含有分泌具有适当抗原特异性的抗体分子的杂交瘤的营养培养基的单克隆杂交瘤培养物生产。该培养物维持在一定条件下一段时间，以供所述杂交瘤将抗体分子充分分泌至培养基内。随后收集含抗体的培养基。抗体分子可然后通过公知的技术进一步分离。产生单克隆抗egfr抗体的方法也是本领域公知的。参见niman等，proc.natl.acad.sci.usa，80：4949-4953(1983)。在之前描述的产生抗egfr单克隆抗体的方法中，通常使用单独或与免疫原性载体缀合的egfr或肽类似物作为免疫原。筛选杂交瘤产生与肿瘤发生、异常或过度增殖细胞中egfr免疫反应的抗体的能力。其他抗egfr抗体包括但不限于genmab/medarex的humax-egfr抗体，108抗体(atcchb9764)和美国专利号6,217,866，以及scheringag的抗体14e1(美国专利号5,942,602)。重组抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和片段通常，包括基本上如seqidnos：1、2、3、4、5和/或6的cdr区所示的氨基酸序列的cdr区位于这样的结构中，所述结构允许cdr区与肿瘤抗原的结合。“基本上如......所示”表示本发明的cdr区与给定的seqidnos：1、2、3、4、5和/或6的区域相同或高度同源。“高度同源”表示cdr中仅有少数替换，优选1-8、优选1-5、优选1-4或1-3或1或2个替换。含有本发明cdr的结构通常是抗体的重链或轻链序列或其基本部分，其中所述cdr区位于相应于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然形成的vh和vl抗体可变结构域的cdr区的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可参照下列确定：kabat，e.a.等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.4thedition.usdepartmentofhealthandhumanservices.1987及其更新版本，现可从英特网上获得(http://immuno.bme.nwu.edu))。优选地，基本上如seqidno：4、5和6所示的氨基酸序列作为人重链可变结构域或其基本部分中的cdr1、2和3，基本上如seqidno.1、2和3所示的氨基酸序列分别作为人轻链可变结构域或其基本部分中的cdr1-3。所述可变结构域可来源自任何种系或重排的人可变结构域，或可以是基于已知人可变结构域一致序列合成的可变结构域。前文所定义的本发明的cdr-来源的序列可使用重组dna技术引入缺乏cdr区的可变结构域集中。例如，marks等(bio/technology，1992，10：779-783)描述了产生抗体可变结构域集的方法，其中联合使用定向至可变结构域5’端或其邻近的通用引物和人vh基因第三框架区的通用引物产生缺乏一个或更多个cdr的vh可变结构域集。marks等进一步描述了该集如何与特定抗体的cdr组合。使用类似的技术，本发明的cdr-来源的序列可与缺乏一个或更多个cdr的vh或vl结构域集改组，改组的完整vh或vl结构域与同源vl或vh结构域组合提供本发明的抗体。该集随后在适当的宿主系统例如wo92/01047的噬菌体展示系统中展示，由此选择适宜的特异性结合成员。集可由任何104以上的单独成员组成，例如106至108或1010个成员。类似的改组或组合技术也由stemmer所公开(nature，1994，370：389-391)，其描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术，但发现该方法可用于产生抗体。另一个选择是使用随机诱变例如编码mab175vh或vlcdr的核酸产生结构域内突变来产生含本发明cdr-来源的序列的新型vh或vl区。gram等描述了这样的技术(1992，proc.natl.acad.scl，usa，89：3576-3580)，其使用了易错pcr。可采用的另一种方法是定点诱变vh或vl基因的cdr区。此类技术公开于barbas等，(1994，proc.natl.acad.sci.，usa，91：3809-3813)和schier等(1996，j.mol.biol.263：551-567)。所有上述的技术在现有技术中是已知的，其本身并不构成本发明的一部分。本领域技术人员能够使用这些技术以采用本领域的常规方法提供本发明的特异性结合成员。免疫球蛋白可变结构域的基本部分包括至少3个cdr区。可变结构域基本部分n末端或c末端的其他残基可以是与天然形成的可变结构域区非正常相关的那些。例如，通过重组dna技术制备的本发明抗体结构可引入由为利于克隆或其他操作步骤引入的接头编码的n-或c-末端残基。其他操作步骤包括引入接头以连接本发明的可变结构域和包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在制备双抗体(diabody)中)或蛋白标记的其他蛋白序列，其将在下文更详细地讨论。虽然在本发明一个优选的方面，优选包含一个或更多个基于基本上如seqidnos：1、2、3、4、5和/或6所示的序列的结合结构域的抗体，基于任一这些序列的单结合结构域构成了本发明的其他方面。在基于基本如seqidno：6所示序列的结合结构域，或seqidno：4-6的结构域情况下，这些结合结构域可用作用于肿瘤抗原的靶向试剂，因为已知免疫球蛋白vh结构域能以特定的方式结合靶抗原。在任一单链特异性结合结构域情况下，这些结构域可用于筛选能形成双结构域特异性结合成员的互补结构域，其体内性质与本文公开的mab175抗体一样好或与其等同。这可以使用美国专利5,969,108中公开的所谓分级双重组合方法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)通过噬菌体展示筛选方法完成，其中使用单个含有h或l链克隆的菌落感染编码另一条链(l或h)的完整克隆库，根据噬菌体展示技术选择所得的双链特异性结合成员，例如该参考文献中公开的那些。该技术同样公开于marks等的上文中。本发明的抗体还可包括抗体恒定区或其部分。例如，基于seqidnos：1-3的抗体可在其c末端连接抗体轻链恒定结构域，包括人cκ或cλ链。类似的，基于seqidnos：4-6的抗体可在其c末端连接全部或部分来源自任何抗体同种型的免疫球蛋白重链，例如igg、iga、ige、igd和igm以及任何同种型亚类，尤其是igg1、igg2b和igg4。分子工程在将鼠mab转化为嵌合mab(小鼠v区，人c区)和人源化物(其中仅mab互补决定区(cdr)是鼠源的)中的应用对单抗治疗的临床成功是关键的。工程化的mab具有显著下降或缺乏的免疫原性，增加的血清半衰期，并且单抗的人fc部分增加了募集补体和细胞毒性细胞免疫效应器的潜能。为研究临床施用mab的生物分布、药代动力学和任何免疫应答诱导，需要开发鉴别药用和内源性蛋白的分析方法。抗体或其任何片段也可缀合或重组性融合任何细胞毒素、细菌等，例如假单胞菌外毒素、蓖麻毒素或白喉毒素。使用的毒素部分可以是全毒素或该毒素的任何特定结构域。此类抗体-毒素分子已成功用于靶向和治疗不同种类的癌症，参见例如pastan，biochimbiophysacta.1997oct24；1333(2)：c1-6；kreitman等，nengljmed.2001jul26；345(4)：241-7；schnell等，leukemia.2000jan；14(1)：129-35；ghetie等，molbiotechnol.2001jul；18(3)：251-68。双和三特异性多聚体可通过缔合不同的scfv分子形成，已被设计为将t细胞募集到肿瘤内(免疫治疗)、病毒再靶向(基因治疗)的交联剂和红细胞凝集剂(免疫诊断学)，参见例如todorovska等，jimmunolmethods.2001feb1；248(1-2)：47-66；tomlinson等，methodsenzymol.2000；326：461-79；mccall等，jimmunol.2001may15；166(10)：6112-7。全人抗体可通过免疫携带大部分人免疫球蛋白重和轻链的转基因小鼠制备。这些小鼠在本领域是公知的，这样的小鼠的实例有xenomousetm(abgenix，inc.)(美国专利号6,075,181和6,150,584)，humab-mousetm(medarex，inc./genpharm)(美国专利5545806和5569825)，transchromomousetm(kirin)和kmmousetm(medarex/kirin)。抗体可随后通过例如标准杂交瘤技术或噬菌体展示制备。这些抗体将仅含完全的人氨基酸序列。全人抗体也可使用噬菌体展示从人库中产生。噬菌体展示可使用本领域技术人员公知的方法进行，例如hoogenboom等和marks等(hoogenboomhrandwinterg.(1992)jmolbiol.227(2)：381-8；marksjd等(1991)jmolbiol.222(3)：581-97；以及美国专利5885793和5969108)中所述。治疗性抗体和用途本发明抗体的体内性质，尤其是肿瘤：血液比和清除速率至少与mab175相当。给人或动物受试者施用后，所述特异性结合成员将显示＞1∶1的肿瘤血液峰值比，优选在这样的比例下所述特异性结合成员同时具有超过1∶1、优选超过2∶1、更优选超过5∶1的肿瘤器官比。优选地，在该比例下，所述特异性结合成员在远离肿瘤位点的器官内具有＜1∶1的器官血液比，这些比例不包括分解代谢和分泌所施用特异性结合成员的器官。本发明的抗体可用可检测的或功能性的标记物标记。可检测的标记物包括但不限于放射性标记，例如同位素3h，14c，32p，35s，36cl，51cr，57co，58co，59fe，90y，121i，124i，125i，131i，111in，211at，198au，67cu，225ac，213bi，99tc和186re，其可以使用抗体成像领域已知的常规化学手段连接到本发明的抗体上。所述标记物还可包括荧光标记物和本领域常规用于mri-ct成像的标记物。其还包括酶标记物例如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分例如生物素，其可通过结合特异性同源可检测部分例如标记的抗生物素蛋白检测。功能性标记物包括经设计靶向至肿瘤位点引起肿瘤组织破坏的物质。此类功能性标记物包括细胞毒药物例如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒素，以及酶类例如细菌羧肽酶或硝基还原酶，其能够在肿瘤位点将前药转化为活性药物。175抗体和/或其亚单位可能具有某些诊断用途，例如，可用于检测和/或测量诸如癌症、癌前病变的状况，与过度增殖细胞生长有关或其导致的状况等等。放射性标记的175抗体及其片段可用于体外诊断技术和体内放射成像技术以及放射免疫疗法中。在体内成像时，本发明的抗体可与显像剂而非放射性同位素缀合，包括但不限于磁性共振成像增强剂，其中例如用大量的顺磁离子通过螯合基团加载抗体分子。螯合基团的实例包括edta、卟啉、多胺冠醚和多肟(polyoximes)。顺磁离子的实例包括钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和ferbium。在本发明的另一方面，放射标记的175抗体及其片段、尤其是放射免疫缀合物可用于放射免疫疗法中，尤其是作为放射性标记的抗体治疗癌症。在另一个方面，放射标记的175抗体及其片段可用于放射免疫导向手术技术，其中它们能在手术前、手术期间或手术后鉴别和指示癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞的存在和/或位置，以便除去这些细胞。本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白(其中本发明的175抗体及其片段与其他分子或试剂缀合或连接)还包括但不限于与化学烧蚀剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂或药物缀合的175抗体.使用不同抗体免疫缀合物的放射免疫疗法(rait)已进入临床并证明了效果。131i标记的人源化抗癌胚抗原(抗-cea)抗体hmn-14已在结肠直肠癌中进行了评价(behrtm等(2002)cancer94(4suppl)：1373-81)，用90y标记的同一抗体在甲状腺髓样癌中进行了评价(steinr等(2002)cancer94(1)：51-61)。使用单克隆抗体的放射免疫疗法也针对非霍奇金淋巴瘤和胰腺癌进行了评价和报道(goldenbergdm(2001)critrevoncolhematol39(1-2)：195-201；golddv等(2001)critrevoncolhematol39(1-2)147-54)。使用特定抗体的放射免疫疗法也描述于美国专利6,306,393和6,331,175中。放射免疫导向手术(rigs)也已进入临床并证明了效果和有用性，包括使用抗-cea抗体和针对肿瘤相关抗原的抗体(kimjc等(2002)intjcancer97(4)：542-7；schneebaums等(2001)worldjsurg25(12)：1495-8；avitals等(2000)cancer89(8)：1692-8；mcintoshdg等(1997)cancerbiotherradiopharm12(4)：287-94)。本发明的抗体可通过任何适当的途径施用给需要治疗的患者，通常通过注射进入血流或csf，或直接进入肿瘤位点。精确的剂量依赖于多种因素，包括该抗体是用于诊断还是治疗，肿瘤的大小和位置，抗体的精确性质(是否为全抗体、片段、双抗体等)，以及连接所述抗体的可检测或功能性标记物的性质。使用放射性核素治疗时，适宜的最大单剂量为约45mci/m2至约250mci/m2的最大值。优选的剂量范围是15至40mci，更优选的剂量范围是20至30mci，或10至30mci。该治疗可能需要骨髓或干细胞替换。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的通常抗体剂量范围是0.5至40mg、优选1至4mgf(ab′)2形式的抗体。裸抗体优选施用剂量为20至1000mg蛋白/剂，或20至500mg蛋白/剂，或20至100mg蛋白/剂。这是成年患者单次治疗的剂量，其可以针对儿童和婴儿按比例调整，也可对其他抗体形式按分子量比例调整。治疗可按一日一次、一周两次、一周一次或一月一次的间隔重复，由医师判定。这些制剂可包括第二结合蛋白，例如前文所描述的egfr结合蛋白。在尤其优选的形式下，该第二结合蛋白是诸如528或225的单克隆抗体，如下文所讨论。药用和治疗组合物本发明的抗体通常以药物组合物的形式施用，其可包括除所述特异性结合成员外的至少一种成分。因此，根据本发明的药物组合物和用于根据本发明用途的药物组合物可包括除活性成分外的可药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他本领域技术人员公知的材料。这些材料应当是无毒的，并且不干扰所述活性成分的效果。载体或其他材料的精确性质依赖于施用的途径，其可以口服或注射，例如静脉注射。用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体的形式。片剂可以包含诸如明胶或佐剂的固相载体，液态药物组合物通常包含诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油的液相载体。还可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。用于静脉内注射或病变位点注射时，所述活性成分是肠胃外可接受的水溶液形式，其无热原并具有适宜的ph值、等渗性和稳定性。那些本领域相关的技术人员能使用例如诸如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液的等渗赋形剂制备合适的溶液。若需要可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。依赖于治疗的状况，组合物可单独或与其他疗法、治疗剂或试剂同时或顺序组合施用。此外，本发明涉及和包括包含本文中描述的结合成员、尤其是抗体或其片段，以及其他试剂或治疗剂，例如抗癌剂或治疗剂、激素、抗egfr剂或抗体或免疫调节剂的组合物。更一般而言，这些抗癌剂可以是酪氨酸激酶抑制剂或磷酸化级联抑制剂、翻译后调节剂、细胞生长或分裂抑制剂(例如抗有丝分裂剂)或信号转导抑制剂。其他疗法或治疗剂可包括施用适当剂量的疼痛舒缓药物，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或麻醉剂(例如吗啡)，或止吐药。所述组合物可与酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于ag1478和zd1839、sti571、osi-774、su-6668)、阿霉素、替莫唑胺、顺铂、卡铂、亚硝基脲、甲基苄肼、长春新碱、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡氮芥、环己亚硝脲和/或其他化疗剂组合(顺序(即之前或之后)或同时)施用。因此，这些试剂可以是抗-egfr特异性试剂，或诸如ag1478、zd1839、sti571、osi-774或su-6668的酪氨酸激酶抑制剂，或可以是更一般的抗癌和抗肿瘤剂，例如阿霉素、顺铂、替莫唑胺、亚硝基脲、甲基苄肼、长春新碱、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡氮芥或环己亚硝脲。此外，所述组合物可与诸如地塞米松的激素、诸如白介素、肿瘤坏死因子(tnf)或其他刺激免疫应答和癌细胞或肿瘤减少或消除的生长因子或细胞因子的免疫调节剂一起施用。诸如tnf的免疫调节剂可与双特异性抗体的形式的本发明的成员组合，识别806egfr表位的同时结合tnf受体。所述组合物也可与其他抗-egfr抗体一起施用或包括与其他抗egfr抗体的组合，包括但不限于抗-egfr抗体528、225、sc-03、dr8.3、l8a4、y10、icr62和abx-egf。先前诸如阿霉素和顺铂的试剂与抗-egfr抗体联合使用已产生了增强的抗肿瘤活性(fan等，1993；baselga等，1993)。阿霉素和mab528的组合导致已建立a431异种移植物的总体根除，而其中任一种试剂单独治疗仅引起暂时的体内生长抑制(baselga等，1993)。类似的，顺铂和mab528或225的组合也导致良好建立的a431异种移植物的根除，其在使用任一试剂治疗时并未观察到(fan等，1993)。常规放射疗法此外，本发明涉及和包括用于抗体组合常规放疗的治疗组合物。已表明用靶向egf受体的抗体治疗可提高常规放射疗法的效果(milas等，clincancerres.2000feb：6(2)：7018，huang等，clincancerres.2000jun：6(6)：216674)。175抗体或其片段与抗癌治疗剂的组合也是预期的，尤其是抗-egfr治疗剂，包括其他抗egfr抗体，证实能有效治疗异种移植瘤，尤其具有协同作用。ag1478和mab175的组合就是这样的示范性组合。ag1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)是egf受体激酶的有效选择性抑制剂，其特别描述于美国专利号5,457,105中，其整体通过援引引入本文(同样参见liu，w.等(1999)j.cellsci.112：2409；eguchi，s.等(1998)j.biol.chem.273：8890；levitsky，a.andgazit，a.(1995)science267：1782)。175抗体与其他抗-egfr抗体、尤其是528抗-egfr抗体的治疗协同作用被预期和考虑。本发明还涉及可用于实施本发明治疗方法的治疗组合物。治疗组合物的主题包括混合物中的可药用赋形剂(载体)和一种或更多种本文所述作为活性成分的抗体175或其片段。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括能调节本结合成员/抗体与靶细胞特异性结合的抗原。制备含有多肽、类似物或活性片段作为活性成分的治疗组合物的方法在本领域是公知的。通常，此类组合物制成可注射的液相溶液或混悬液。然而，也可以制备在注射前适于溶解或混悬于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。活性治疗成分通常与可药用并且与活性成分相容的赋形剂混合。适宜的赋形剂有，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或其组合。此外，如果需要的话，该组合物可含有少量的辅助性物质例如提高活性成分效果的湿润或乳化剂、ph缓冲剂。多肽、类似物或活性片段可制成中性可药用盐形式的治疗组合物。可药用的盐包括酸加成盐(通过多肽或抗体分子的自由氨基形成)，其使用例如诸如盐酸或磷酸的无机酸类，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸类形成。从自由羧基形成的盐还可来源自诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱，以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。含治疗性多肽、类似物或活性片段的组合物常规通过静脉例如注射单位剂量施用。术语“单位剂量”当用于涉及本发明的治疗组合物时是指适于人类单次给药的物理分离单位。每个单位含有经计算产生所需治疗效应的预定量的活性物质和需要的稀释剂：即载体或赋形剂。所述组合物以与剂型相容的方式按治疗有效量施用。施用的量取决于所治疗的受试者、所述受试者免疫系统利用该活性成分的能力以及所需的egfr结合能力程度。需要施用的活性成分的精确量取决于医生的判断，对每个个体都是独特的。然而，适宜的剂量范围为约0.1至20、优选约0.5至约10、更优选1至数毫克活性成分/千克个体体重/天，依赖于施用途径。适宜的起始施用和加强注射方案也是可变的，但通常为起始施用后以1或更多小时的间隔重复注射或以其他方式给药。或者，可考虑连续静脉输液以维持血浓度在10纳摩尔至10微摩尔。用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包括诸如明胶或佐剂的固相载体。液相药物组合物通常包括诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油的液相载体。还包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。用于静脉内注射或病变位点注射时，所述活性成分是肠胃外可接受的水溶液形式，其无热原并具有适宜的ph值、等渗性和稳定性。那些本领域相关的技术人员能使用例如诸如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液的等渗赋形剂制备合适的溶液。若需要可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。诊断性分析本发明还涉及多种诊断性应用，包括通过借助其被本175抗体识别的能力检测诸如异常表达的egfr的刺激物的存在的方法。本发明抗体的诊断性应用包括对于本领域技术人员来说是熟知和标准化的和基于本说明书的体外和体内应用。可利用体外评价和判定egfr状态、尤其是关于egfr的异常表达的诊断性分析和试剂盒诊断、评价和监测包括已知或疑似患有癌症、癌前状况、与过度增殖的细胞生长有关的状况或来自肿瘤样本的那些的患者样本。egfr状态的评价和判定同样可用于确定患者临床药物试验或特定化学治疗剂或特异性结合成员、尤其是本发明抗体，包括其组合，相对于不同试剂或抗体的施用的适合性。此类诊断监测和评价实践中已使用针对乳癌中her2蛋白的抗体(herceptest，dakocorporation)，其中该分析也使用herceptin用于评价进行抗体治疗的患者。体内应用包括肿瘤成像或评价个体的癌症状态，包括放射成像。如早先所讨论的，本发明的诊断方法包括通过分析手段检测细胞样品或培养基，所述分析包括有效量的针对efgr/蛋白的拮抗剂，例如抗egfr-抗体，优选本文提供的mab175。此外，本文中使用的抗-egfr抗体分子优选是fab、fab′、f(ab′)2或f(v)部分或全抗体分子的形式。如前面所讨论的，能从该方法中获益的患者包括患有癌症、癌前病变、病毒感染、由过度增殖细胞生长导致或与之有关的病理学或其他类似的病理学紊乱的那些患者。细胞内egfr的存在可通过常规的用于此类检测的体外或体内免疫学方法确定。已知许多有效的方法。这些方法与其应用是本领域技术人员熟知的，因此可在本发明的范围内利用。在这些方法中，egfr与一个或更多个抗体或结合伙伴形成复合物，该复合物的一个成员用可检测的标记物标记。复合物的形成及其数量(如果需要的话)可通过已知适用于检测标记的方法确定。大多数情况下用于这些研究的标记物是放射性元素、酶、暴露于紫外光下发出荧光的化学物等等。已知许多荧光材料可用于标记物。其包括，例如荧光素、玫瑰红、金胺、得克萨斯红、amca蓝和萤光黄。egfr或egfr抗体175也可用放射性元素或酶标记。放射性标记可通过任何现有的计数方法检测。优选的同位素可选自3h，14c，32p，35s，36cl，51cr，57co，58co，59fe，90y，121i，124i，125i，131i，111in，211at，198au，67cu，225ac，213bi，99tc和186re。酶标记物也是有用的，可通过任何现有的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流检测法或气体定量技术检测。酶与选定的颗粒通过与桥接分子诸如碳化二亚胺、二异氰酸盐、戊二醛等反应进行缀合。许多可用于这些方法中的酶是已知并可利用的。优选过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-d-葡萄糖苷酶、β-d-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶以及碱性磷酸酶。例如参考美国专利号3,654,090、3,850,752和4,016,043的备选标记材料和方法。在本发明的另一个实施方案中，可制备适于内科医师使用的商用检测试剂盒以确定疑似靶细胞中egfr异常表达的存在与否，包括但不限于扩增的egfr和/或egfr突变。根据上文讨论的检测技术，一类所述试剂盒将含有至少标记的egfr或其结合伙伴，例如其特异性抗体(抗体175)和说明书，当然其依赖于所选择的方法，例如“竞争性”、“三明治”、“dasp”等。所述试剂盒可还含有外周试剂，例如缓冲剂、稳定剂等。因此，可制备用于证实细胞的egfr异常表达或异常形式存在或能力(capability)的检测试剂盒，包括：(a)预定量的至少一种标记的免疫化学反应性组分，通过175抗体或其特异性结合伙伴直接或间接连接可检测标记物获得；(b)其他试剂；以及(c)所述试剂盒的使用说明。根据上文，可制备用于筛选有效调节egfr活性或egfr异常表达，和/或所述抗体(尤其是175抗体)活性或结合的潜在药物的测试系统。受体或抗体可引入检测系统，预期的药物也可引入所得的细胞培养物中，随后检测所述培养物，观察细胞s期活性的任何变化，其与单独加入所述预期药物或与已知试剂加入量的效果有关。核酸本发明还提供了编码本发明抗体175的分离的核酸。核酸包括dna和rna。在一个优选的方面，本发明提供了编码如前文所定义的本发明多肽的核酸，包括如seqidnos：1、2、3、4、5和/或6所示的多肽。本发明还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包括至少一种上述多核苷酸。本发明还提供了包含一种或更多种上述构建体的重组宿主细胞。所提供的编码任何抗体175的核酸其本身构成了本发明的一个方面，包括从其编码核酸的表达的产生该抗体的方法也是如此。表达可通过在合适的条件下培养含有该核酸的重组宿主细胞方便地完成。通过表达产生后，可使用任何适宜的技术分离和/或纯化特异性结合成员，随后适当时使用。根据本发明，抗体和编码核酸分子和载体可分离和/或纯化提供，例如从其天然环境中以基本纯或均质的形式提供，或在核酸的情况下，不含或基本不含除编码所需功能多肽的序列以外的核酸或基因来源。根据本发明，核酸可包括dna或rna，可以是全合成或部分合成的。多种不同宿主细胞中的多肽克隆和表达系统是公知的。适当的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、hela细胞、幼仓鼠肾细胞、nso小鼠黑色素瘤细胞和许多其他细胞。通常，优选的细菌宿主是大肠杆菌。抗体和抗体片段在原核细胞例如大肠杆菌中的表达已在本领域确立。综述可参见plückthun，a.bio/technology9：545-551(1991)。作为产生特异性结合成员的另一种选择，真核细胞培养物中的表达也是本领域技术人员已知的，近期综述可参见例如，raff，m.e.(1993)curr.opinionbiotech.4：573-576；trillj.j.等(1995)curr.opinionbiotech6：553-560。可选择或构建适当的载体，其含有合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和其他合适的序列。载体适当时可以是质粒、病毒例如噬菌体或嗜菌粒。更多详细情况参见例如molecularcloning：alaboratorymanual：2ndedition，sambrook等，1989，coldspringharborlaboratorypress。许多操作核酸的已知技术和方法，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将dna引入细胞和基因表达以及蛋白质分析等，详细描述于shortprotocolsinmolecularbiology，secondedition，ausubel等eds.，johnwiley&sons，1992。sambrook等和ausubel等的公开的内容通过援引引入本文。因此，本发明的另一方面提供了含有编码本文所公开抗体的核酸的宿主细胞。另一个方面提供了包括将所述核酸引入宿主细胞的方法。该引入可使用任何现有技术。引入后可引起或允许核酸的表达，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。在一个实施方案中，本发明的核酸被整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)内。根据标准技术，可加入促进与基因组重组的序列促进整合。本发明还提供了包括在表达系统中使用上述构建体以表达前述抗体或多肽的方法。如前所述，本发明还涉及重组dna分子或克隆的基因，或其简并的变体，其编码具有如seqidnos：1、2、3、4、5和/或6所示氨基酸序列的抗体175或其片段，优选是核酸分子。如本领域公知的，dna序列可通过与表达调控序列在适当的表达载体中可操作的连接并使用所述表达载体转化合适的单细胞宿主进行表达。在选择表达调控序列时，通常考虑多种因素。它们包括例如系统的相对强度、其可控性、与要表达的特定dna序列或基因的相容性，尤其是可能的二级结构。适宜的单细胞宿主将根据例如其与所选择载体的相容性、其分泌特性、其正确折叠蛋白的能力、其发酵需求，以及要表达的dna序列编码产物对宿主的毒性和表达产物纯化的难易程度进行选择。考虑到这些和其他因素，本领域技术人员将能够构建多种载体/表达调控序列/宿主组合，以发酵或大规模动物培养物的形式表达本发明的dna序列。诸如片段的类似物可通过例如胃蛋白酶消化抗体肽或材料产生。其他类似物，例如突变蛋白质可通过特异性结合成员编码序列的标准定点诱变产生。具有抗体175样活性的类似物，例如作为启动子或抑制剂起作用的小分子，可通过已知的体内和/或体外测试鉴定。编码175抗体的dna序列可合成而非克隆制备。全序列从使用标准方法制备的重叠寡核苷酸装配成全编码序列，参见例如edge，nature，292：756(1981)；nambair等，science，223：1299(1984)；jay等，j.biol.chem.，259：6311(1984)。合成的dna序列可方便地构建表达特异性结合成员类似物或“突变蛋白”的基因。或者，编码突变蛋白的dna可通过定点诱变天然特异性结合成员基因或cdna制备，突变蛋白可使用常规多肽合成直接制备。关于非天然氨基酸位点特异性整合到蛋白质中的一般性方法描述于christopherj.noren，spencerj.anthony-cahill，michaelc.griffith，peterg.schultz，science，244：182-188(april1989)。该方法可用于产生含非天然氨基酸的类似物。本发明可通过参考以下非限制性实施例更好地理解，其仅作为本发明的示例提供。以下实施例用于更全面地说明本发明优选的实施方案，但不应以任何方式解释为限制本发明的宽范围。实施例本发明可通过参考以下非限制性实施例更好地理解，其仅作为本发明的示例提供。以下实施例用于更全面地说明本发明优选的实施方案，但不应以任何方式解释为限制本发明的宽范围。实施例1概述egfr以两种明确定义的构象异构体存在——受束缚(tethered)和不受束缚的(untethered)。受束缚的构象异构体仅在无配体的(和部分连接的)受体形式下观察到，其可由配体诱导形成不受束缚的背靠背二聚体。mab806识别细胞表面上某些截短的、过表达或活化形式的egfr上的表位，但其不识别正常未刺激细胞上的egfr。另一个相关的抗体mab175同样识别该非正常的表位。我们测定了与抗体mab806和mab175的fab结合的egfr287-302肽表位的3d结构。在所述抗体的存在下，肽表位采用了与两种形式的受体非常类似的构象。然而，mab806或mab175抗体与wtegfr结构的结合可通过fab与受束缚或不受束缚构象的cr1结构域显著的立体冲突而抑制。cr1结构域的3d构象检查表明就在表位之前的二硫键的打断使得cr1结构域充分打开以允许结合任一抗体。半胱氨酸突变体egfrc271a/c283a不仅结合mab806和mab175，而且化学计量是1∶1(即，等价于识别egfrl2配体结合结构域的mab528)。然而mab806不能抑制表达野生型egfr细胞的体外生长，mab806完全抑制了表达egfrc271a/c283a的baf/3细胞的配体相关刺激。我们的结果显示抗体mab806和mab175的结合机制需要在受体活化或截短或过表达期间表位优先暴露的egfr形式，因此，与其他egfr抗体相反，mab806优先位于过表达egfr癌症患者的肿瘤内，该作用机制揭示了通过过表达的、截短的或活化形式的egfr家族受体检测肿瘤和改善抗体/抑制剂杀伤癌细胞的新方法。重要性egfr参与刺激了许多人肿瘤的生长。尽管已使用抑制剂和拮抗剂作为治疗剂，成功依然受到限制。部分原因在于对正常组织egfr的干扰，部分缘于某些试剂有限的暂时效果，即ab具有更长作用。抗体mab806和mab175识别受体的异常构象，其通常在肿瘤细胞上存在，但在正常细胞上不存在。这些抗体与egfr的三维结合位点鉴定了解释其肿瘤特异性的异常构象。这些抗体与其他抗-egfr试剂协同作用诱导小鼠中复杂的肿瘤的杀伤。使用放射性标记形式的抗体在癌症患者中的初步结果证实了肿瘤选择性。引言其配体家族对egfr活化的理解一直是挑战性的，但精致的遗传学(1-3)、生物物理学(4-8)，和最近的晶体学(9-17)研究揭示了活化egfr细胞内酪氨酸激酶结构域需要的众多复杂的系列构象变化和聚集事件(18)。在这些复杂性中，很明显溶液中egfr胞外结构域有至少两种主要构象：无活性的受束缚构象和活性的不受束缚或伸展的配体结合的“背靠背”二聚体。egfr是首个与癌症相关的生长因子受体(19-20)。egfr通过自分泌配体活化(19；21；22)，并且在大部分的晚期神经胶质瘤中，egfr受体胞外结构域被截短(23；24)并由此活化。通常需要egfr的活化以维持恶性状态。相反，除了少数毛囊和brunner腺细胞外，成年有机体中egfr以低水平表达，并且在成体生命中是无活性的。已开发了靶向egfr的两类主要试剂：酪氨酸激酶抑制剂(tki′s)和单克隆抗体(mab’s)。tki’s例如gefitinib(zd1839)和erlotinib(osi-774)竞争性结合egfr的atp口袋以抑制其活化。相反，针对egfr的抗体例如西妥昔单抗(cetuximab)(c225)和帕尼单抗(panitumumab)(abx-egfr)竞争性地抑制配体结合，由此防止受体活化。抑制剂和抗体两类物质在egfr依赖的小鼠异种移植物模型中具有显著的抗肿瘤活性(25-29)，均已批准用于包括nscl、胰腺、头颈和结肠癌的选择性癌症中(30-32)。尽管对这些egfr治疗剂的响应率为中等的，期望成功鉴定对egfr阻断应答的患者亚群体能改善患者的结果。例如在神经胶质瘤中，对tarceva的响应似乎很大程度上局限于对δ2-7egfr(也称为egfrviii，通常在神经胶质瘤中表达的egfr胞外截短体)和pten双阳性的患者亚群(33)。这些治疗剂显示希望的同时，其使用也受到剂量限制性毒性的限制，例如显著表达egfr的正常皮肤中大量摄取这些试剂后导致的皮疹。许多神经胶质瘤过表达egfr(23；34)，主要是因为egfr基因的扩增。egfr基因在神经胶质瘤中的扩增也与突变事件有关，其导致外显子2-7(34)切除，随后表达上述提到的截短的、部分活化的δ2-7egfr形式的egfr(35；36)。δ2-7egfr在n末端含有独特的融合肽，其由外显子1和8的拼接和插入独特的甘氨酸产生。已描述了某些靶向该接合肽的单克隆抗体(34)，由此代表了对δ2-7egfr具有特异性的潜在的治疗剂。我们使用过表达该截短的egfr的nr6细胞(无内源性egfr家族成员的3t3变体)产生了一系列的δ2-7egfr特异性抗体。在强力结合δ2-7egfr的同时，某些抗体当过表达时还结合wtegfr，但以生理水平表达时不结合。这些抗体的最佳描述mab806(35；37；38)似乎不结合表面表达低于1x105egfr的细胞，而仅仅更高的表达水平才产生mab806反应性egfr的独特群体(受体总数的5-10％)(35，37，38)。随后的表位作图研究表明mab806与胞外结构域上氨基酸287-302之间的短半胱氨酸环相结合，该胞外结构域上氨基酸287-302仅在egfr从受束缚构象转化为伸展构象时短暂暴露(23，28)。因此，仅在具有受体解束缚有利条件的细胞内发现mab806反应性，例如存在突变(例如δ2-7egfr)、过表达或受体活化的细胞。在egfr过表达的情况下，似乎非配体依赖的egfr活化和糖基化变化导致解束缚增加(39)。这些情况常见于肿瘤细胞中，但在正常组织中较少。因此mab806能够优先靶向肿瘤细胞而非诸如肝的正常组织。实际上，我们最近采用mab806的嵌合体完成的i期临床试验结果表明该抗体靶向的表位未暴露于正常组织中，但在egfr阳性肿瘤范围内是可及的(28；40)。在异种移植物中，mab806已显示针对表达δ2-7egfr的u87mg神经胶质瘤细胞，以及一系列其他在缺乏该突变情况下过表达wtegfr的模型的强抗肿瘤活性(28；40)。此外，mab806在动物模型中与其他egfr治疗剂组合使用时显示协同抗肿瘤活性，所述其他egfr治疗剂包括egfr激酶抑制剂(27)和针对无关表位的抗体(47)。半胱氨酸残基287和302之间的egfr氨基酸序列足以结合mab806，然而，尽管δ2-7egfr中发现的截短体清楚地暴露该半胱氨酸环以供mab806结合，mab806与wtegfr的结合机制仅部分被阐明。egfr的全长胞外结构域和与配体结合的egfr-ecd1-501片段的晶体结构已被解析。这些结构的分析证明mab806不能结合全长ecd结构(13)中观察到的受束缚的egfr或egfr-ecd1-501(14)或egfr-ecd1-621(42)构建体中所见的配体结合型不受束缚的背靠背二聚体。因此我们假设mab806结合存在于无活性和活性状态之间的部分不受束缚形式的wtegfr。mab806不能结合这些连接的不受束缚的egfr进一步通过在防止受体内化条件下用egf预孵育表达baf/3细胞的wtegfr加以证实。在这些条件下更高百分比的egfr应当形成连接的背靠背二聚体，由此防止mab806结合。清楚地证实了这一观察(43)。然而，稳定态下配体对mab806结合的影响，例如在含强egfr/配体自分泌环细胞中可能发生，是未知的。有趣的是，虽然mab806与细胞表面wtegfr的结合依赖于受体的构象，在免疫学的角度来说，该表位并非是构象性的，因为在western印迹中mab806是有效的egfr探针，即，其能识别变性的受体。显而易见，egfr构象决定的表位可及性是mab806结合的最关键因素，而非表位构象本身。mab806还结合固定于塑料和表面等离子共振芯片上的egfr(37)。在该报道中我们还以和mab806同样的方式描述了其他抗体的生物活性、特异性和表位。为理解这些抗体的独特的特异性我们测定了与mab806和mab175的fab片段和游离fab片段结合的mab806肽表位(egfr287-302)的3d结构。egfr287-302在受体上的方位和与抗体结合的所述肽的构象证明mab806必须结合特定形式的egfr，该形式的折叠不同于观察到的受束缚或伸展构象的wtegfr。我们使用点突变检查了邻近半胱氨酸环(氨基酸271-283)对egfr结构和mab806/175反应性的影响，因为该环似乎严格限制了这些抗体的结合。我们报道了mab806和175针对du145异种移植物(一种具有强tgf-α/egfr自分泌刺激环的前列腺细胞系)的效果，以及放射性标记的mab806与处于i期治疗的头颈癌患者的结合(44)。结果mab175特异性初步结合研究表明mab175具有类似于mab806的egfr特异性。在mab806(igg2b)和mab175(igg1)的cdr区，氨基酸序列几乎相同，每个只有一个氨基酸的差异(图1)。所有这些差异保留了侧链的电荷和大小。显然，这些抗体独立出现。我们进行了一系列免疫组化实验以分析mab175结合的特异性。mab175染色过表达egfr的a431异种移植物切片(图2a)和表达δ2-7egfr的u87mg.δ2-7神经胶质瘤异种移植物切片(图2a)。相反，mab175不染色u87mg异种移植物切片。u87mg细胞系仅表达中等水平的野生型egfr(图2a)，无可检测的egfr自分泌环。最重要的是，mab175不结合正常人肝切片(图2b)。因此，rnab175似乎具有与mab806同样的特异性，即其检测过表达和截短的人egfr，而非以中等水平表达的wtegfr。mab175表位的鉴定由于mab175还结合δ2-7egfr(其缺失氨基酸6-273)和egfr1-501，残基274-501内必须含有mab175表位。当确定mab806表位时，我们表达了一系列与人gh羧基端融合的c-myc-标记的egfr片段，其均在氨基酸501处终止(45；46)。mab175还在western印迹中与274-501和282-501egfr片段反应，但未检测到开始于氨基酸290或298的片段(增补图9)。使用c-myc抗体、9e10验证了所有gh-egfr融合蛋白的存在(增补图9)。因此，mab175表位的关键决定簇确定位于氨基酸290附近。最后，缺失mab806表位(δ287-302)的274-501egfr片段不与mab175结合(图9)，表明该区域类似地决定大部分mab175的结合。我们进一步使用第二种方法鉴定了mab175的表位。在酵母的表面表达包括egfr胞外结构域的片段，使用流式细胞术，通过间接免疫荧光测定mab175的结合。mab175识别酵母片段273-621，其相应于δ2-7egfr的胞外结构域，但不识别片段1-176、1-294、294-543或475-621(图3a和3b)。因此，至少部分的mab175表位必须包含在氨基酸274-294间的区域内，与我们使用egfr片段的免疫印迹数据一致。由于mab175结合变性的273-621片段(图3c)，表位必须是天然线性的(增补图9)。显然mab806和mab175识别egfr的类似区域和构象。使用表面等离子共振(biacore)，我们研究了mab175与egfr肽(287cgadsyemeedgvrkc302(seqidno：14))的结合。使用胺、巯基二硫化物交换或pms-ser偶联化学将egfr287-302固定于生物感应器表面。后一种方法通过n末端的半胱氨酸特异性固定该肽(47)。mab175以所有方位与egfr287-302结合(表1)。pms-丝氨酸偶联的mab175和egfr287-302亲和度为35nm，胺偶联为154nm。在所有情况下，mab175与egfr287-302的结合亲和度低于mab806(表1)。我们还测定了mab175与egfr的两种不同胞外片段的亲和度。mab175结合1-501片段的亲和度与该肽类似(16nm对35nm)(表1)。正如预期，mab175针对1-621全长胞外结构域(其可形成受束缚的构象)的亲和度要低的多(188nm)。尽管mab806和mab175对于egfr287-302具有类似的亲和度，mab175似乎具有对egfr胞外结构域的更高亲和度(表1)。显然，mab175表位位于egfr287-302内，并且类似于mab806，egfr胞外结构域的结合亲和度依赖于构象。表1：与egfr表位结合的mab806和mab175抗体亲和度biacore测定egfr片段mab175的kd(nm)mab806的kd(nm)287-302(pms-ser偶联)3516287-302(巯基偶联)14384287-302(氨基偶联)154851-501(不能形成束缚)16341-621(能形成束缚)188389使用表达在酵母表面的273-621egfr片段突变体群鉴定mab175表位的精细结构(45；46)。mab175和mab806具有近乎相同的对突变体的反应性模式(表2)。287-302二硫键的打断对于表位反应性仅具有中等的影响，因为所有突变体与抗体均在c287处结合，某些但非全部突变体在c302处结合(表2)。对mab175结合起关键作用的氨基酸包括e293、g298、v299、r300和c302(表2)。mab175似乎对突变v299和d297更为敏感，但mab806同样显示对这些位点某些突变的结合降低(表2)。同样，mab175表位似乎与mab806识别的表位基本相同。表2：酵母上展示的egfr表位287-302突变，以及mab806和mab175的结合评分mab175对由δ2-7egfr或egfr自分泌环刺激的肿瘤异种移植物的效果我们检测了mab806和mab175对u87mg.δ2-7神经胶质瘤异种移植物的体内抗肿瘤活性。抗体治疗开始前建立异种移植6天(每周3次，两周，标明日期)。此时平均肿瘤体积为100mm3(图4a)。当由于伦理道德原因处死对照组动物时，与赋形剂或mab806治疗组相比，mab175治疗导致总体肿瘤生长率下降，在接种后19天尤为显著(相对对照p＜0.0001，相对mab806p＜0.002)。此时的赋形剂、mab806和mab175治疗组平均肿瘤体积分别为1530、300和100mm3(图4a)，证明mab175对于表达δ2-7egfr的异种移植物具有抗肿瘤活性。尽管u87mg细胞表达约1×105egfr/细胞，mab806不能识别任何表面egfr，由此也不奇怪不能抑制u87mg的体内生长。此外，这些细胞不能共表达任何egfr配体。为检测egfr表位是否临时暴露，从而能在含有egfr自分泌环的细胞内被mab806和mab175识别，前列腺细胞系du145与u87mg细胞表达wtegfr的水平类似，然而与u87mg细胞不同的是，du145细胞含有tgf-α基因的扩增，从而具有egfr/tgf-α自分泌环。facs分析表明，mab175和806均与du145细胞结合(图4b)，并且其均能免疫沉淀小部分从这些细胞中提取的egfr(图4c)。两种技术均显示mab175具有更好的结合，然而，当与mab528(结合l2结构域)相比时，mab175和mab806仅在这些细胞表面上结合egfr亚组(图4b和4c)。用第二前列腺细胞系(lncap)(数据未显示)和结肠系(lim1215)也观察到类似的结果，其均含有egfr自分泌环(22；48)。显然，在自分泌刺激环存在下，mab806和mab175仅能识别少量细胞上的egfr。由于du145细胞中表达的egfr与mab175和mab806的结合比u87mg细胞中表达的egfr更为有效，我们进行了一项研究以分析这些抗体在裸小鼠中生长的du145异种移植物中的抗肿瘤活性。治疗开始前建立异种移植18天(每周3次，3周，标明日期)。此时平均肿瘤体积为90mm3(图4d)。mab175和mab806均抑制了du145异种移植物的生长。对照组在第67天处死，平均肿瘤体积为1145mm3，mab806和mab175组分别为605和815mm3(分别地p＜0.007和0.02)(图4d)。与mab806和mab175fab片段接触的egfr287-302的3d-结构为理解mab806和mab175怎样识别某些但非全部构象egfr的分子细节，测定了两种抗体fab片段单独(分辨率分别为2.3和)和与氧化的egfr287-302表位的复合物的晶体结构(分辨率分别为2.0和图5a和5b)。两种情况中，自由和复合的fab结构基本相同，肽的构象和抗体cdr环能被很好的定义(图5)。表位为β-带结构，带的一端指向fab，v299包埋在抗原结合位点的中心(图5c-e)。表位的两端均暴露于溶剂，与这些抗体结合长得多的多肽相符。在与表位接触的20个抗体残基中，mab806和mab175间仅存在两个替换(图1)。mab175接触残基有：轻链s30、s31、n32、y49、h50、y91、f94、w96和重链d32、y33、a34、y51、s53、y54、s55、n57、r59、a99、g100、r101；除轻链n30、重链f33的序列差异外，mab806的接触残基相同。egfr287-302通过肽残基293-302间的紧密接触结合fab，大部分接触在残基297和302间。egfr287-302主链原子和fab间仅有的氢键为残基300和302(图5f)。表位序列的识别通过与残基e293(与fab的h50和r101)、d297(与y51和n57)、r300(与d32)和k301(通过水分子与y51和w96)的侧链氢键进行。疏水接触在g298、v299和c302处产生。293和302间表位骨架的构象基本与fab806和fab175晶体相同(这些残基中的cα原子的)。尽管受到二硫键的限制，肽的n末端(287-292)并不与任一抗体结构发生显著接触，改变该区域的构象。然而，fab806复合物中的该片段似乎更为无序。更有趣的是，与抗体接触的egfr287-302肽的构象非常紧密相关于受束缚或不受束缚的egfr结构骨架中观察到的egfr287-302构象(li等，2005；garrett等，2002)。对于来自fab175复合物的egfr287-302，cα位置的rms偏差分别为0.66和(图5)。为进一步了解mab806和mab175对egfr的识别机制，在溶液中、自由态和806fab存在下，使用nmr光谱法研究了15n标记的氧化肽egfr287-302的构象(详见补充数据)。对该自由肽进行共振分配，与那些比较无规卷曲。基本上，自由肽呈无规卷曲结构，而非天然egfr中看到的β-带(14)。添加fab后，观察到共振位移。然而，由于加入fab后显著谱线增宽产生的弱信号以及复合物的成功结晶，未进一步研究fab806-表位复合物的溶液结构。尽管如此，显然当肽与mab806(或mab175)的fab片段结合时，似乎fab选择或诱导匹配天然受体中肽的肽的构象。为什么mab806和mab175仅识别egfr的某些构象？通过叠合egfr287-302，我们将mab175的fab片段对接到egfr的胞外结构域(受束缚的和不受束缚的单体)。对于δ2-7-样片段，没有与受体显著的立体冲突。在不受束缚的形式中，具有包埋的fab的本质上更可及的表面(受束缚形式为)。因此，该抗原可与抗体的非cdr区具有额外的接触，如酵母表达突变体所表明的那样(45)。相反，将整个egfr胞外结构域对接到fab上后，存在与表位前的cr1结构域部分(残基187-286)实质上的空间重叠，并且穿过fab的中心(图5d、e)。因此，由于cr1结构域在受束缚或不受束缚的构象中具有基本相同的结构，mab806或mab175不能结合任一形式的egfr。显然，允许表位结合的取向和任一已知wtegfr构象的cr1结构域的表位的取向之间必定存在差异。对cr1结构域的检查表明egfr287-302前的二硫键(271-283)限制了多肽，其阻断了对表位的可及；打断二硫键(即使其与指导结合抗体无关)预期能允许cr1结构域的部分展开，从而使mab806或mab175可及表位。egfr271-283二硫键的打断促进了mab806的结合蛋白质的二硫键提供了增强的结构刚性，但在某些细胞表面受体中，尤其是那些细胞因子和生长因子受体中，临时打断二硫键和二硫化物交换可控制受体的功能(49)。由于这是mab806和mab175可及其结合位点的一种机制，我们试图通过将271和283位之一或两者的半胱氨酸突变为丙氨酸残基(c271a/c283a)以增加表位的可及性。将能表达全长c271a-、c283a-或c271a/c283a-egfr的载体转染至il-3依赖的ba/f3细胞系中。选择以等价于wtegfr水平表达c271a-和c271a/c283a-egfr突变体的稳定ba/f3克隆(图6a)。未观察到表达高水平突变体c283a-egfr的ba/f3细胞。如前所述，wtegfr几乎不与mab806反应；然而，突变受体与mab528、mab806和抗-flag抗体同样强烈地反应，表明该受体在细胞表面表达并且正确地折叠，此时mab806的表位完全可及。为确认mab806相对于wtegfr更有效的识别c271a/c283a突变体，我们测定了mab806结合与mab528结合的比例。由于wt和c271a/c283aegfr均是n末端flag标记的，我们还测定了与m2抗体结合的mab806和mab528的比例。如之前所报道的，mab806仅识别少量在ba/f3细胞表面表达的总wtegfr(mab806/528结合比为0.08)(表3)。相反，mab806事实上识别该细胞表面表达的全部c271a/c283a突变egfr(mab806/528结合比为1.01)(图6a和表3)。表3：与表达wt或c271a/c283aegfr的细胞的mab806反应性*四个独立克隆的平均值。两个半胱氨酸的突变没有损害egf结合或受体功能。表达c271a/c283aegfr突变体的baf3细胞在egf存在下增殖(图6b)。我们重复观察到egf在表达c271a/c283a突变的细胞中剂量效应曲线的左偏移，表明配体具有更高的亲和性，或突变受体具有增强的信号传导潜能。western印迹分析证实了c271a/c283a突变体以类似于wtegfr的水平表达，并且是响应于egf刺激的酪氨酸磷酸化(图6c)。与其他细胞系中先前的研究一致，mab806对体外egf诱导的表达wtegfr的ba/f3细胞的增殖无任何效果，而阻断mab528的配体完全抑制了egf诱导的所述细胞的增殖(图6d，左)。相反，mab806总体减少了egf诱导的表达c271a/c283a突变体的baf3细胞的增殖(图6d，右)。当271-283半胱氨酸环破裂时，不仅mab806更有效的结合，而且一旦结合，mab806防止了配体诱导的增殖。头颈癌中的i期成像研究据报道，8名患者[1名女性和7名男性；平均年龄61岁(44-75)]完成了该i期试验(44)。所有的患者满足了选择标准，除8号患者外(其具有原发性脑瘤)，所有患者在研究进入时均具有转移性疾病。所有患者均观察到肿瘤的抗体吸收，111in-ch806(嵌合的mab806)具有迅速和高水平的肿瘤吸收(图7)。111in-ch806从正常器官(肝、肺、肾和脾)的清除显示无剂量水平间的差异(44)。具体而言，肝清除显示无剂量水平间的差异，表明肝内无ch806的可饱和抗原室。刚输液后总的肝吸收最大值为14.45±2.43％id，72小时后下降到8.45±1.63％id，输液后一周下降到3.18±0.87％id。其显著区别于wtegfr抗体的吸收(例如225)，其显示在输液后超过3天内在肝中超过30％id(40mg剂量)(50)。测量的111in-ch806峰值肿瘤吸收在输液后5-7天到达。患者1和3的肿瘤吸收不能精确地定量计算，因为靶病变接近心脏血池和患者走动。肿瘤中的峰值ch806吸收范围为5.21至13.73×10-3％id/gm肿瘤组织。肿瘤中的实际ch806浓度计算峰值为(平均值±sd)0.85±0μg/gm(5mg/m2)、0.92±0μg/gm(10mg/m2)、3.80±1.10μg/gm(20mg/m2)以及7.05±1.40μg/gm(40mg/m2)。讨论当egfr或相关的erbb2的水平或活性紊乱时，诸如西妥昔单抗和herceptin的靶向egfr家族成员的抗体是治疗癌症的重要选择。这些抗体结合位点、靶标受体以及最近抗体受体复合物3d结构的确定加深了我们对于这些抗体如何干扰受体激活的理解。这些研究也暗示了靶向该受体家族上其他表位可能产生用于使用抗体组合以改善癌症的治疗的新的机会。不幸的是，所有当前可用的治疗性抗-egfr抗体均识别wtegfr，其实际上在所有的正常组织中表达。在正常组织中表达的egfr不仅代表了所述抗体的大库(largesink)，其在观察到的剂量限制性毒性(例如皮疹)中可能是关键的，并且使得利用抗体/细胞毒性缀合物不可能。虽然有这些问题，应当注意大多数正常组织缺乏活化的egfr，因此中和抗egfr抗体似乎对生命内环境稳定信号传导没有深刻影响。相反，通过自分泌/旁分泌机制、截短、突变、基因扩增和/或过表达，许多肿瘤含有活化的egfr。重要的是，活化的egfr似乎通过增强细胞运动、增殖、侵袭、血管发生和肿瘤细胞存活促进肿瘤发生。因此，施用抗egfr抗体或egfr激酶抑制剂能减少肿瘤细胞的生长和存活。针对δ2-7egfr中独特接合肽的抗体能靶向某些肿瘤而没有与正常组织吸收相关的困难(51)。在神经胶质瘤中，δ2-7egfr的表达伴随着wtegfr的过表达，其不被其他δ2-7egfr抗体抑制，但被mab806或mab175抑制。之前我们描述了抗体mab806，其针对表达δ2-7egfr的细胞。mab806不仅结合该截短的受体，还结合过表达的wtegfr。mab806识别半胱氨酸环内的表位(氨基酸287-302)，当以低至中度水平在细胞上表达并且配体不存在时，其在δ2-7egfr中是可及的，但在wtegfr中是不可及的。类似的，纯的egfr全长胞外结构域(egfr1-621)。该抗体的表位被发现位于egfr胞外结构域的铰链区附近，其在形成活性状态时发生构象改变。此外，该表位不仅包埋在非活性构象中，其在配体结合的背靠背不受束缚egfr二聚体中也是不可及的。mab806的该有趣的性质促使我们再次分析了表达分离自起始融合物(38)的单克隆抗体的其他杂交瘤。在最初的筛选中，其中之一的mab175具有与mab806类似的egfr结合性质。它们的cdr环内的氨基酸序列非常相似(90％的序列同一性)。这些区别保留了有关侧链的大小和电荷。象mab806一样，mab175染色过表达egfr或表达δ2-7egfr的肿瘤细胞，但不染色具有中度水平wtegfr的细胞，例如人肝。详细的表位作图显示，mab175不仅结合与mab806相同的半胱氨酸环，其还具有与一系列含有环内点突变的突变体近乎相同的结合概况。此外，两种抗体的结合均不需要用于结合的表位二硫键是完整的。mab806和mab175均具有针对表达δ2-7egfr的人神经胶质瘤异种移植物的抗肿瘤活性，两者均诱导肿瘤生长显著延迟，虽然mab175在该模型中略微更为有效。有趣的是，mab806和mab175结合在du145前列腺细胞上表达的egfr，该细胞系表达中等水平的egfr但分泌显著量的自分泌型tgf-α(52)。当用于过表达egfr的细胞系时，两种抗体仅结合少量的du145细胞表面egfr。然而，两种抗体均抑制了裸小鼠中du145异种移植物的生长。因此，在生理条件下配体的存在增加了egfr过渡形式的可用性，该形式可被这些抗体识别，靶向该形式足以下调egfr驱动的细胞生长。此类抗egfr抗体可能具有比一开始预料的更宽的抗肿瘤作用。此外，mab806与其他egfr治疗剂组合使用时的协同活性(41)暗示此类抗体的直接(immediate)治疗作用。mab806还结合含有活化egfr激酶的癌相关突变的肿瘤细胞。mab806和mab175选择性的结合含有活化egfr的细胞，可能是鉴别和/或监测可能响应现有批准的egfr治疗剂的患者的有效试剂。我们对egfr287-302表位的结构研究表明，mab806和mab175均识别同样的3d结构基序。与mab806和mab175接触的肽残基在两种情形下具有几乎相同的结构，表明这是这些氨基酸在产生抗原δ2-7egfr中的构象。实际上，这些抗体/肽结构中发现的egfr287-302肽骨架与两种已知的egfr结构构象紧密匹配。然而，这些结构中表位的取向防止了抗体与相关氨基酸的可及：其与抗体806不结合wtegfr的实验观察一致。对egfr结构的详细检查导致了另一个有趣的可能性。egfr287-302表位从第二个二硫键键合的环(氨基酸271-283)上悬挂，打断该二硫键将在不改变该表位骨架构象的情况下使egfr287-302环变得可及(见图8)。c271a/c283aegfr突变体的结果显示，cr1结构域必须开放，以使得mab806和mab175与突变受体化学计量地结合。该突变受体依然可采取对egf刺激完全响应的天然构象，但与wtegfr不同，其被mab806完全抑制。在过表达wtegfr的细胞表面，清楚地存在受体的亚群，其中egfr287-302表位是可被mab806或mab175结合的。由于结合最容易发生在受体活化的时候，还不清楚该受体亚群是处于到不受束缚形式的构象过渡的那些，还是处于从不受束缚形式到连接的活化状态的过渡的那些，抑或271和283间的二硫键已被破坏(还原)的egfr亚群是否存在不完全氧化。若癌细胞表面存在还原形式的egfr，我们的数据清楚地显示其可能是活性的，并能够起始细胞信号传导。尽管仅结合少数受体亚群和不抑制egfr的下游信号传导，mab806抑制过度表达wtegfr的异种移植物生长的能力依然是一个谜。由于这个原因，mab806与独特的具有异常信号传导性质的egfr亚群的结合常常是人们感兴趣的内容，尤其是当其与其他egfr治疗剂具有巨大的协同作用时。如果存在于癌细胞的细胞表面，271-283二硫键还原的egfr可代表egfr的该独特形式。最后，应当记住的是，尽管δ2-7egfr中的缺失很大，其终止于氨基酸273。δ2-7egfr缺少该二硫键，已知具有与wtegfr不同的信号传导性质。另一方面，活化egfr的激酶突变、自分泌环和低糖基化(underglycosylation)也能通过增加受体的活化增强mab806的反应性，推测不需要打断271-283二硫键。这些观察支持了cr1结构域可扭结以允许在egfr活化期间某时间点可及egfr287-302，但在受束缚和配体结合状态下被保护不扭结的观点。我们当前正进行研究以确定mab806识别的egfr是否含有还原的271-283二硫键。嵌合806(ch806)的i期试验结果分析证明，mab806靶向的表位是肿瘤特异性的。定量生物分布分析清楚显示了ch806在肿瘤中的快速和特异性吸收。这些数据与癌细胞上表达的抗原的抗体最高定量靶向一致，显著高于相同剂量下wtegfr抗体的值(44；50)。ch806在所有正常组织中的吸收(包括肝)很低，表明无结合正常组织中wtegfr的证据，在肝中仅代表血池活性和少量自由111in-螯合物的分解代谢。虽然施用了大剂量的蛋白(高达300mg)(50)，其显著区别于靶向wtegfr的抗体(例如225；西妥昔单抗)，后者显示输液后在肝中保留了很高的吸收(20-30％id)超过72小时。此外，在肿瘤明显吸收前，wtegfr的抗体需要大负荷的剂量以饱和正常组织(50)，还具有来自结合皮肤和肠的wtegfr的抗体的剂量限制性毒性(55)。这些结果表明，mab806不靶向人体正常组织，生物分布的定量分析证明了体内mab806靶向的egfr表位的肿瘤特异性。使用来源自mab806或mab175的抗体靶向egfr287-302表位是在最小化正常组织吸收的情况下攻击癌细胞中活化的egfr的一种途径。该受体的活化可由许多癌相关的机制导致。同样可能最重要的是，这些抗体可用于将细胞毒素、治疗性纳米颗粒、sirna和放射性同位素直接靶向至肿瘤位点。最后，这些研究证明，mab806和mab175是帮助将与细胞表面egfr活化相关事件作图的有效工具。在分子水平上理解抗体如何识别异常和活化形式的生长因子受体而不识别非活性的野生型受体，这一工作可用于产生针对癌症治疗剂其他靶点(例如egfr家族的其他成员)的抗体。一种方法可使用与抗体mab806和mab175化学计量地结合的二硫化物突变体egfr-c227a/c283a。当erbb2、erbb3或erbb4连续过表达或活化时，如果发现egfr构象干扰作用，则这些受体对应的二硫化物突变体可作为免疫原建立对肿瘤选择性的其他egfr家族成员靶向抗体。此外，当肿瘤细胞过表达其他受体时，尤其是那些富含二硫化物结构域的，例如trk，一部分这些受体可由于低糖基化或临时二硫键打断而部分错误地折叠。可以想象，二硫键突变体或截短的受体可类似用于可能产生识别其他异常表达受体的抗体的免疫原。实验操作细胞系δ2-7egfr转染的u87mg.δ2-7(54)和a431细胞系(2)之前已描述。非依赖激素的前列腺细胞系du145(55)从atcc获得(atcc.org)。见细胞系生长条件的补充数据。抗体、fab和肽mab806和mab175在生物生产实验室(ludwiginstituteforcancerresearch，melbourne)中生产和纯化。抗体，抗体片段和肽表位的制备和鉴别见补充数据。使用哺乳动物细胞和酵母中表达的egfr片段对mab175作图作图按补充数据中所述进行。表面等离子共振(biacore)使用biacore3000进行所有实验。以5μl/分的流速将含有假定mab806表位的肽通过胺、巯基或pms偶联固定于cm5感应芯片上(47)。mab806和mab175在25℃下以5μl/分的流速流过感应器表面。批次间通过以10μl/分的流速注入10mmhcl再生表面。免疫沉淀和western印迹细胞用裂解缓冲液(1％tritonx-100，30mmhepes，150mmnacl，500mm4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟，150nm抑酶肽，1mme-64蛋白酶抑制剂，0.5mmedta和1mm亮肽素，ph7.4)裂解20分钟，在14,000xg下离心30分钟使溶液澄清，用有关的抗体在终浓度5μg/ml下免疫沉淀60分钟，用sepharose-a珠捕获过夜。随后用2×nupagesds样品缓冲液(invitrogen)洗脱样品，在nupage胶(3-8％或4-12％)上解析，电转移至immobilon-p转移膜(millipore)上，随后用有关抗体探测后通过化学发光放射显影检测。免疫组织化学冻干的切片用5μg/mlmab175或不相关的同种型对照在室温下染色60分钟。使用dakoenvision+hrp检测系统按厂商说明检测结合的抗体。切片最后用水淋洗，用苏木精复染，包埋。异种移植物模型将含u87mg.δ2-7细胞(3x106)的100μlpbs皮下接种到4至6周龄雌性balb/c裸小鼠的两侧腹(animalresearchcentre，perth，australia)。所有研究使用先前报道的已建立的肿瘤模型进行(41)。一旦肿瘤到达适当图解中给出的平均体积则开始治疗。肿瘤体积(mm3)使用以下公式计算：(长×宽2)/2，其中长是最长的轴，宽是垂直的测量值。每个治疗组的数据以平均肿瘤体积±se表示，所有的数据用单侧student’s检验进行显著性分析，其中p＜0.05被认为是统计学显著性的。该研究计划已由austin医院的动物伦理委员会批准。表达egfr突变体构建体的稳定细胞系的产生和鉴定使用定点诱变试剂盒(stratagene，lajolla，ca)产生(wt)egfr的突变。各个诱变的模板是人egfrcdna(登记号x00588)(2)。每个构建体进行自动核苷酸测序以证实egfr突变的完整性。野生型和突变体(c173a/c281a)egfr通过电穿孔转染至baf/3细胞。关于细胞系鉴定的其他详细情况见补充数据。fab175和fab806、fab-肽复合物的晶体结构测定以及806肽表位在溶液中的nmr结构制备和分析fab806、fab175和单独的fab-肽复合物的晶体学方法以及15n-标记的806表位肽在溶液中的nmr研究详情描述于补充数据中。通过分子置换法测定结构，利用下列收敛(converge)精修：r＝0.225/r自由＝0.289(fab806)和r＝0.226/r自由＝0.279(fab806：肽)；r＝0.210/r自由＝0.305(fab806)和r＝0.203/r自由＝0.257(fab806：肽)。chab806肿瘤在患者中的生物分布为证明mab806体内的肿瘤特异性，工程化并在cgmp条件下产生嵌合的形式(ch806)(56)。进行i期首次人体试验评价ch806在806阳性肿瘤患者中的安全性、生物分布和免疫应答，安全性、生物分布和药代动力学的结果之前已被报道(44)。为定义与患者正常组织(即肝)相比的ch806肿瘤特异性，通过从注射5-7mci(200-280mbq)111in-ch806后一周内获得的全身γ照相机成像计算111in-ch806的％注射剂量(id)进行肿瘤和肝内的ch806定量吸收。肝和肿瘤的剂量测定计算基于每名个体患者感兴趣的区域111in-ch806输液成像数据组进行，进行背景和衰减校准，允许计算累积活性。进行剂量测定计算以获得注射后一周内肿瘤和肝中的111in-ch806浓度。参考文献1.holbro，t.andhynes，n.e.(2004)annu.rev.pharmacol.toxicol.44：195-217.，195-217.2.ullrich，a.，coussens，l.，hayflick，j.s.，dull，t.j.，gray，a.，tam，a.w.，lee，j.，yarden，y.，libermann，t.a.，schlessinger，j.，and.(1984)nature.309，418-425.3.yen，l.，benlimame，n.，nie，z.r.，xiao，d.，wang，t.，almoustafa，a.e.，esumi，h.，milanini，j.，hynes，n.e.，pages，g.，andalaoui-jamali，m.a.(2002)mol.biol.cell.13，4029-4044.4.clayton，a.h.，walker，f.，orchard，s.g.，henderson，c.，fuchs，d.，rothacker，j.，nice，e.c.，andburgess，a.w.(2005)j.biol.chem.280，30392-30399.5.gadella，t.w.j.andjovin，t.m.(1995)journalofcellbiology129，1543-1558.6.schlessinger，j.(2002)cell％20；110，669-672.7.yarden，y.andschlessinger，j.(1987)biochemistry.26，1443-1451.8.yarden，y.andsliwkowski，m.x.(2001)nat.rev.mol.cellbiol.2，127-137.9.bouyain，s.，longo，p.a.，li，s.，ferguson，k.m.，andleahy，d.j.(2005)proc.natl.acad.sci.u.s.a.102，15024-15029.10.burgess，a.w.，cho，h.s.，eigenbrot，c.，fer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文国家实验室beamlinex29的adscquantum315ccd检测器上收集，这些数据用hkl2000(12)处理(数据收集统计在表1中列出)。使用程序molrep(13)和fab结构2e8的坐标，通过分子置换法解析天然806fab。该结构的精修用refmac5进行(14)，在coot(15)中建立模型。806-肽和175fab-肽结构均使用程序molrep和806fab结构的坐标通过分子置换法解析，在refmac5和coot和o中再次精修和重构，最终结构的验证用procheck(16)和whatcheck(17)进行。nmr研究为进行nmr研究，除大肠杆菌在补充有15nh4cl的neidhardt’s基本培养基中培养外(19)，使用先前fairlie等描述的方法(18)重组制备与shp2的sh2结构域的融合的15n-标记肽。使用cnbr从融合伙伴切割所述肽，通过反相hplc纯化，maldi-tof质谱和n-端测序验证其身份。806抗体结合序列内而非肽本身的甲硫氨酸突变成亮氨酸以能够从融合伙伴上切割下来。用于nmr研究的样品在含有5％2h2o、70mmnacl和50mmnapo4的ph6.8水溶液中制备。所有的谱图在298k下在brukeravance500光谱仪上获得，使用冷冻探头。使用标准2dtocsy和noesy以及15n-编辑的tocsy和noesy谱建立所述肽在无m806fab情况下的序列比对。所述肽和fab806的相互作用通过监测该肽在fab806存在和不存在情况下的15nhsqc谱进行测定。所述肽在fab806存在下的15nhsqc谱的谱干扰清楚地显示该肽能在溶液条件下结合fab806。然而未测定该肽在复合物形式下的详细结构。补充数据表1.数据收集和精修统计数据收集括号内为最高分辨率下的数据。精修参考文献1.palacios，r.，henson，g.，steinmetz，m.，andmckearn，j.p.(1984)nature.309，126-131.2.walker，f.，orchard，s.g.，jorissen，r.n.，hall，n.e.，zhang，h.h.，hoyne，p.a.，adams，t.e.，johns，t.g.，ward，c.，garrett，t.p.，zhu，h.j.，nerrie，m.，scott，a.m.，nice，e.c.，andburgess，a.w.(2004)jbiolchem.279，22387-22398.3.ymer，s.，tucker，w.q.，sanderson，c.j.，hapel，a.j.，campbell，h.d.，andyoung，i.g.(1985)nature.％19-25；317，255-258.4.panousis，c.，rayzman，v.m.，johns，t.g.，renner，c.，liu，z.，cartwright，g.，lee，f.t.，wang，d.，gan，h.，cao，d.，kypridis，a.，smyth，f.e.，brechbiel，m.w.，burgess，a.w.，old，l.j.，andscott，a.m.(2005)br.jcancer.92，1069-1077.5.johns，t.g.，adams，t.e.，cochran，j.r.，hall，n.e.，hoyne，p.a.，olsen，m.j.，kim，y.s.，rothacker，j.，nice，e.c.，walker，f.，ritter，g.，jungbluth，a.a.，old，l.j.，ward，c.w.，burgess，a.w.，wittrup，k.d.，andscott，a.m.(2004)jbiolchem.279，30375-30384.6.johns，t.g.，adams，t.e.，cochran，j.r.，hall，n.e.，hoyne，p.a.，olsen，m.j.，kim，y.s.，rothacker，j.，nice，e.c.，walker，f.，ritter，g.，jungbluth，a.a.，old，l.j.，ward，c.w.，burgess，a.w.，wittrup，k.d.，andscott，a.m.(2004)jbiolchem.279，30375-30384.7.johns，t.g.，adams，t.e.，cochran，j.r.，hall，n.e.，hoyne，p.a.，olsen，m.j.，kim，y.s.，rothacker，j.，nice，e.c.，walker，f.，ritter，g.，jungbluth，a.a.，old，l.j.，ward，c.w.，burgess，a.w.，wittrup，k.d.，andscott，a.m.(2004)jbiolchem.279，30375-30384.8.johns，t.g.，adams，t.e.，cochran，j.r.，hall，n.e.，hoyne，p.a.，olsen，m.j.，kim，y.s.，rothacker，j.，nice，e.c.，walker，f.，ritter，g.，jungbluth，a.a.，old，l.j.，ward，c.w.，burgess，a.w.，wittrup，k.d.，andscott，a.m.(2004)jbiolchem.279，30375-30384.9.masui，h.，kawamoto，t.，sato，j.d.，wolf，b.，sato，g.，andmendelsohn，j.(1984)cancerres.44，1002-1007.10.gill，g.n.，kawamoto，t.，cochet，c.，le，a.，sato，j.d.，masui，h.，mcleod，c.，andmendelsohn，j.(1984)jbiolchem.259，7755-7760.11.vandeloosdrecht，a.a.，beelen，r.h.，ossenkoppele，g.j.，broekhoven，m.g.，andlangenhuijsen，m.m.(1994)jimmunolmethods.174，311-320.12.otwinowski，z.andminor，w.(1997)processingofx-raydiffractiondatacollectedinoscillationnmodeacademicpress(newyork).13.vagin，a.andteplyakov，a.(1997)j.appl.cryst30，1022-1025.14.murshudov，g.n.，vagin，a.a.，anddodson，e.j.(1997)actacrystallographica53，240-255.15.emsley，p.andcowtan，k.(2004)actacrystallographica60，2126-2132.16.laskowski，r.a.，macarthur，m.w.，moss，d.s.，andthomton，j.m.(1993)j.appl.cryst26，283-291.17.hooft，r.w.，vriend，g.，sander，c.，andabola，e.e.(1996)nature381，272.18.fairlie，w.d.，uboldi，a.d.，desouza，d.p.，hemmings，g.j.，nicola，n.a.，andbaca，m.(2002)proteinexpressionandpurification26，171-178.19.neidhardt，f.c.，bloch，p.l.，andsmith，d.f.(1974)journalofbacteriology119，736-747.序列表<110>johns,terranceold,lloydscott,andrewstockert,elisabeth<120>靶向egf受体的单克隆抗体175及其衍生物和用途<130>2332-1-014pct<140>pct/us2008/009771<141>2008-08-14<150>60/964,692<151>2007-08-14<160>14<170>fastseqforwindowsversion4.0<210>1<211>11<212>prt<213>小家鼠<400>1hisserserglnaspileserserasnilegly1510<210>2<211>8<212>prt<213>小家鼠<400>2tyrhisglythrasnleugluasp15<210>3<211>9<212>prt<213>小家鼠<400>3valglntyrglyglnpheprotrpthr15<210>4<211>6<212>prt<213>小家鼠<400>4serasptyralatrpasn15<210>5<211>16<212>prt<213>小家鼠<400>5tyrilesertyrseralaasnthrargtyrasnproserleulysser151015<210>6<211>9<212>prt<213>小家鼠<400>6alathralaglyargglypheprotyr15<210>7<211>11<212>prt<213>小家鼠<400>7hisserserglnaspileasnserasnilegly1510<210>8<211>8<212>prt<213>小家鼠<400>8tyrhisglythrasnleuaspasp15<210>9<211>9<212>prt<213>小家鼠<400>9valglntyralaglnpheprotrpthr15<210>10<211>6<212>prt<213>小家鼠<400>10seraspphealatrpasn15<210>11<211>16<212>prt<213>小家鼠<400>11tyrilesertyrserglyasnthrargtyrasnproserleulysser151015<210>12<211>9<212>prt<213>小家鼠<400>12valthralaglyargglypheprotyr15<210>13<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的接合肽<400>13leugluglulyslysglyasntyrvalvalthrasphis1510<210>14<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>14cysglyalaaspsertyrglumetglugluaspglyvalarglyscys151015当前第1页12