一种无血清悬浮培养的昆虫细胞系及其应用的制作方法

本发明属于农业和生物技术领域，具体涉及一种无血清悬浮培养的昆虫细胞系及其应用，即粉纹夜蛾胚胎细胞系qau-tn-e-7，适合于昆虫病毒杀虫剂和外源重组蛋白的大规模生产。

背景技术：

昆虫细胞系在杆状病毒的生产和重组蛋白的表达等方面发挥着十分重要的作用，昆虫细胞培养基中一般含有一定比例的动物血清以支持细胞的生长增殖，但是由于血清的成本高、成分复杂，对后期培养产物的分离、提纯以及检测会造成困难等缺点而限制了其应用。细胞工程、基因工程、蛋白质工程以及医学生物学等领域的研究与开发迫切需要无血清细胞培养技术的支撑，因此昆虫细胞的无血清培养日益受到人们的重视并成为细胞培养工程领域的新热点。同时，多数昆虫细胞系呈贴壁生长，由于受到贴壁面积的限制，使细胞的密度和生产的产量难以达到最高，大规模生产受到限制。

目前在杆状病毒生产和外源重组蛋白表达等方面国际上应用最多的昆虫细胞系是草地贪夜蛾spodopterafrugiperda的sf-21或其克隆株sf-9以及粉纹夜蛾trichoplusiani的bti-tn5b1-4(highfive)，sf-9和bti-tn5b1-4细胞系在实际应用中各有优缺点，两种细胞系在贴壁条件下的生长速度快，但悬浮培养时细胞易结团而影响其生长。昆虫杆状病毒在sf-9细胞中形成芽生病毒(buddedvirus，bv)的滴度较高，但病毒多角体的产量和重组蛋白的表达量均低于bti-tn5b1-4细胞。另外，在bti-tn5b1-4细胞中检测到一种tncl(tn5cellline)病毒，该病毒属于诺达病毒科(nodaviridae)、α-诺达病毒属(alphanodavirus)，该类病毒能够感染乳鼠和乳仓鼠并导致其麻痹和死亡，因此在应用时需要对bti-tn5b1-4细胞检测这种病毒是否存在，以减少bti-tn5b1-4细胞在生产医用药物和疫苗时的潜在风险(litc,etal.,latentinfectionofanewalphanodavirusinaninsectcellline,journalofvirology,2007,81(20):10890-10896)。因此，针对上述缺点，筛选获得一种无tncl病毒、适合于无血清悬浮培养和具有大规模工业化培养潜力的新细胞系将具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明提供一种适合于无血清悬浮培养、不含tncl病毒的昆虫细胞系，该细胞系在无血清悬浮培养条件下生长速度快，细胞密度高，病毒产量和蛋白表达水平高，适合于昆虫病毒杀虫剂和外源重组蛋白的大规模生产。

本发明所提供的昆虫细胞系，为粉纹夜蛾细胞系qau-tn-e-7(trichoplusianicelllineqau-tn-e-7)，于2018年4月17日保藏在位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c201865。

该细胞系是直接采用sf-900^tmⅲsfm无血清培养基对粉纹夜蛾的胚胎细胞进行原代培养和传代培养，建立的稳定生长的细胞系，连续传代培养50代筛选获得的，细胞的生长状态良好。

本发明所提供的细胞系不含tncl病毒。通过反转录pcr(rt-pcr)检测，从bti5b1-4细胞中检测出tncl病毒片段，而qau-tn-e-7细胞中未扩增出相应大小的片段，证明qau-tn-e-7细胞中不含tncl病毒。

本发明所提供的细胞系可用于制备病毒杀虫剂，细胞系对病毒高度敏感、病毒多角体的产量高，其中病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)。在悬浮培养瓶(spinnerflask)中培养的细胞，acmnpv的感染率可达100％，平均每个细胞的病毒多角体产量为106.2个，病毒多角体产量可达3.12×10⁸pib/ml。

本发明所提供的细胞系可用于外源重组蛋白的表达和生产，所述的重组蛋白为β-半乳糖苷酶(β-gal)和碱性磷酸酶(seap)。在悬浮培养瓶(spinnerflask)中培养的细胞，其中重组蛋白表达水平显著提高，β-半乳糖苷酶表达量达3.61×10⁴iu/ml，碱性磷酸酶的活性达3.97iu/ml。

本发明提供了一种适合于无血清悬浮培养的昆虫细胞系(粉纹夜蛾细胞系qau-tn-e-7)，该细胞系在无血清悬浮培养条件下生长速度快，细胞密度高，病毒产量和蛋白表达水平高，在大规模生产昆虫病毒杀虫剂和外源重组蛋白等方面展示了广阔的应用前景。

附图说明

图1为细胞系qau-tn-e-7在无血清培养基中的形态图；

图2为细胞系tncl病毒检测的rt-pcr图；

图3为细胞系的生长曲线和存活率图；其中a为bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养，b为qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养，c为qau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养。

图4为细胞系感染苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)图；

图5为细胞系重组蛋白β-半乳糖苷酶(β-gal)的表达水平图；其中a为bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养，b为qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养，c为qau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养。

图6为细胞系重组蛋白碱性磷酸酶(seap)的表达水平图；a为bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养，b为qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养，c为qau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养。

具体实施方式

本发明对粉纹夜蛾胚胎细胞进行培养建立了粉纹夜蛾细胞系，通过筛选获得了一株生长稳定、对病毒敏感的悬浮细胞系qau-tn-e-7，保藏号为：cctccno:c201865；保存时间为：2018年4月17日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心。

所筛选的qau-tn-e-7细胞形态多为短梭形，细胞大小为43.5±7.3μm×24.5±4.1μm；在24孔细胞培养板中对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的感染率为98.3％，平均单个细胞的病毒多角体产量为115.8个；qau-tn-e-7细胞coⅰ基因片段序列分析与粉纹夜蛾coⅰ片段一致性为100％，细胞系来源于粉纹夜蛾；经rt-pcr检测证实细胞系qau-tn-e-7不含tncl病毒，克服了在生产医用药物和疫苗时的潜在风险，具有较好的应用前景。

对qau-tn-e-7细胞在悬浮培养瓶(spinnerflask)中进行悬浮培养，以2.0×10⁵细胞/ml的浓度接种，以100r/min的转速进行搅拌，细胞的生长状态最好，细胞浓度在第6d达到最高，达到4.29×10⁶细胞/ml，群体倍增时间为21.3h。

对细胞系qau-tn-e-7在悬浮培养瓶(spinnerflask)中无血清悬浮培养条件下的病毒产量和重组蛋白的表达水平进行了测定，病毒产量为3.12×10⁸pib/ml，β-半乳糖苷酶表达量达3.61×10⁴iu/ml，碱性磷酸酶的活性达3.97iu/ml。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1细胞系的建立和筛选以及生物学特性

1.1细胞系的建立

收集粉纹夜蛾(trichoplusiani)新产的(不超过24h)卵约100粒，在超净工作台中分别用10％的次氯酸钠和70％的酒精进行卵表面消毒5min，用无菌水冲洗3次，转移到孔径为100μm的细筛中，加入5mlsf-900^tmⅲsfm培养基，用无菌橡胶头研磨卵粒，将细胞滤液移入25cm²细胞培养瓶中，于28℃培养箱中培养。根据细胞生长状态定期更换一定比例的新鲜培养基，待原代培养的细胞生长铺满培养瓶瓶底后，于超净工作台中吹打细胞制备细胞悬液，按一定的比例进行细胞传代。大约传代10左右，待细胞生长状态稳定，成功建立细胞系。历时2年，先后共进行了53个培养，成功建立了9株粉纹夜蛾胚胎细胞系。通过对9株细胞系的细胞形态、生长速度、对病毒的敏感性、病毒多角体产量等一系列指标进行测定和比较，最终筛选获得了一株对杆状病毒敏感且悬浮生长的细胞系，命名为qau-tn-e-7；保藏号为：cctccno:c201865；保存时间为：2018年4月17日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心。

1.2细胞系的形态特征

在倒置相差显微镜下(olympusix71)观察细胞的形态，随机选取100个细胞，统计不同形态细胞的比例，并通过显微标尺测量细胞的大小。细胞系qau-tn-e-7的细胞多为短梭形，占细胞总数的95％以上，细胞的大小为43.5±7.3μm×24.5±4.1μm(图1)。

1.3细胞系的分子鉴定

利用通用引物hco2198和lco1490(folmeretal.,1994)对细胞系的线粒体细胞色素c氧化酶ⅰ(cytochromecoxidaseⅰ，coⅰ)进行pcr扩增，pcr产物经电泳检测后进行测序。qau-tn-e-7细胞系的coⅰ基因片段长度均为633bp，通过序列比较和分析，该片段与ncbi中粉纹夜蛾coⅰ基因片段序列(ncbi登录号：mf679178)的最大相似率为100％，证明qau-tn-e-7细胞系为粉纹夜蛾细胞系。

1.4细胞系的α-诺达病毒检测

使用transzolupplusrnakit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)分别提取细胞系qau-tn-e-7和bti5b1-4的总rna，以无菌水作为对照，使用transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行反转录合成cdna，参照文献(litc,etal.,latentinfectionofanewalphanodavirusinaninsectcellline,journalofvirology,2007,81(20):10890-10896)，使用引物noda-d4(5-acatccagatccgatcaagt-3)和noda-u4(5-gccaggaatgttgcttgcaa-3)对α-诺达病毒rna2基因组片段进行扩增检测。pcr反应条件为：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸7min。pcr扩增产物通过琼脂糖电泳进行检测。结果见图2，从bti5b1-4细胞中扩增出690bp的片段，而qau-tn-e-7细胞和水中未扩增出相应大小的片段，证明qau-tn-e-7细胞中不含tncl病毒。

1.5细胞系生长曲线测定

取对数生长期qau-tn-e-7和bti-tn5b1-4(highfive)细胞，用血球计数板计数后，用培养基稀释到2×10⁵细胞/ml的浓度，加到25cm²培养瓶中，每瓶5ml，分别用sf-900^tmⅲsfm培养基和含10％fbs的tnm-fh培养基在28℃条件下培养。每天取3瓶细胞，血球计数板计数，计算细胞的浓度，并计算细胞群体倍增时间。同时将等量的细胞悬液与0.4％的台盼蓝混合，测定不同培养天数细胞的存活率。

qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶(t-flask)中的生长曲线见图3，接种后1d内生长较缓慢，细胞存活率为92.3％，之后生长速度逐渐加快，细胞数量呈指数增加，处于对数期生长阶段，2d之后的细胞存活均大于95％，第6d细胞达到最高浓度3.62×10⁶细胞/ml。然后随着培养时间的延长，细胞浓度开始逐渐下降。经计算，qau-tn-e-7细胞在sf-900^tmⅲsfm培养基中28℃条件下的群体倍增时间为23.3h，生长速度较bti-tn5b1-4(highfive)细胞用含10％fbs的tnm-fh培养基培养的快。

1.6细胞系病毒敏感性测定

取对数生长期细胞，按2.0×10⁵细胞/ml的浓度接入24孔细胞培养板中，每孔1ml；28℃条件下培养2h，使细胞贴壁，吸去培养基，以感染复数(multiplicityofinfection，moi)为10的病毒量接种苜蓿银纹夜蛾autographacalifornica核型多角体病毒(acmnpv)，设3个重复，置于垂直摇床上缓慢摇动，吸附2h后弃去病毒液，每孔加入1ml新鲜培养基，28℃培养箱中培养。在倒置显微镜下检查病毒侵染结果并拍照，以细胞内形成病毒多角体作为感染指标，每孔随机选取三个视野统计细胞总数和感染细胞数，计算病毒的感染率。收集细胞，超声波裂解使病毒多角体释放，统计病毒浓度，计算每个细胞的病毒多角体产量。

细胞接种病毒后2d开始出现感染症状，细胞核开始膨大，3d能看到细胞核内有多角体形成，4d感染症状明显，细胞内产生大量的多角体(图4)，细胞逐渐开始破碎，有多角体释放到培养基中。经测定，接种病毒4d细胞的感染率为98.3％，平均每个细胞的病毒多角体产量达115.8pib。

实施例2细胞系的无血清悬浮培养

将qau-tn-e-7细胞在75cm²细胞培养瓶(t-flask)中培养，每瓶15ml，在对数生长期取细胞悬液，接种到125ml的悬浮培养瓶(spinnerflask，corning公司)中，每瓶接入80ml浓度为2.0×10⁵cells/ml的qau-tn-e-7细胞，培养基为sf-900^tmⅲsfm无血清培养基，置于28℃培养箱内，分别以80r/min、100r/min和120r/min的转速对细胞进行悬浮培养，每个转速处理3瓶细胞，每隔24h从每瓶中各取1ml细胞悬液，用血球计数板计数，测定细胞浓度；同时用等量的细胞悬液和0.4％的台盼蓝混合，测定不同处理细胞的存活率。

通过对不同转速悬浮培养的筛选结果表明，以100r/min的转速进行搅拌，细胞的生长状态最好，适合qau-tn-e-7细胞的无血清悬浮培养。无血清悬浮培养条件下的细胞生长曲线见图3，培养2d后细胞的存活率一直在95％以上，细胞浓度在第6d达到最高，达到4.29×10⁶细胞/ml，高于25cm²细胞培养瓶中培养的qau-tn-e-7和bti-tn5b1-4(highfive)细胞浓度。经计算，无血清悬浮培养条件下细胞的群体倍增时间为21.3h，较25cm²细胞培养瓶中培养的qau-tn-e-7和bti-tn5b1-4(highfive)的生长速度快(图3)。

实施例3细胞系在无血清悬浮培养下的病毒产量

将对数生长期的qau-tn-e-7细胞以2.0×10⁵cells/ml的浓度接种在125ml的悬浮培养瓶(spinnerflask，corning公司)中，每瓶接入80ml，培养基为sf-900^tmⅲsfm无血清培养基，置于28℃培养箱内，以100r/min的转速对细胞进行悬浮培养。培养3d，取样检测细胞浓度，根据细胞浓度以感染复数(multiplicityofinfection，moi)为10的病毒量接种苜蓿银纹夜蛾autographacalifornica核型多角体病毒(acmnpv)，重复3次。病毒感染4d取细胞悬液在显微镜下检查病毒感染率，收集细胞悬液用超声波裂解，使细胞裂解释放出多角体，用血球计数板计算多角体的浓度，并统计平均每个感染细胞产生的多角体数量。

结果表明，qau-tn-e-7细胞在在悬浮培养瓶中无血清悬浮培养条件下接种acmnpv4d后细胞的感染率可达100％，平均每个细胞的病毒多角体产量为106.2个，病毒多角体产量可达3.12×10⁸pib/ml。

实施例4细胞系在无血清悬浮培养下重组蛋白的表达

设置三个处理：qau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养、qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养、bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养，将重组病毒acmnpv-β-gal和acmnpv-seap按感染复数moi＝10的比例分别感染培养的细胞，28℃条件下培养，每天分别取样。将每天所取的样品经5000rpm/min离心5min，用超声波破碎仪将细胞破碎，待细胞完全破碎后，5000rpm/min离心5min后取上清备用。参照davis等(1992)和zheng等(2005)的方法测定重组蛋白β-半乳糖苷酶(β-gal)和碱性磷酸酶(seap)的表达水平。

不同培养方法的β-半乳糖苷酶表达结果见图5，细胞的β-gal的表达量随着培养天数的增加逐渐增加，6dqau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中和25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养的β-gal表达量达到最高，分别为3.61×10⁴iu/ml和3.08×10⁴iu/ml，对照bti-tn5b1-4细胞β-gal的表达量在8d达到最高(2.35×10⁴iu/ml)。其中接种6d，qau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养的β-半乳糖苷酶表达量最高，分别是qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养(3.08×10⁴iu/ml)和bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养(2.23×10⁴iu/ml)表达量的1.17倍和1.62倍。

不同培养方法细胞碱性磷酸酶的表达结果见图6，细胞的seap表达量随着培养天数的增加逐渐增加，培养7dqau-tn-e-7细胞在125ml悬浮培养瓶中的seap表达量达到最高(3.97iu/ml)，分别是qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养(3.36iu/ml)和bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养(1.95iu/ml)表达量的1.18倍和2.04倍。而qau-tn-e-7细胞在25cm²培养瓶中用sf-900^tmⅲsfm培养基培养和bti-tn5b1-4(highfive)细胞在25cm²培养瓶中用含10％fbs的tnm-fh培养基培养的细胞在9d达到最高，分别为3.47iu/ml和2.06iu/ml。