本发明涉及重金属防治领域，具体地说，涉及一种六价铬还原酶及其在治理水体铬污染中的应用。
背景技术：
土壤和地下水中的铬(cr)污染是国际上最关注的环境问题之一，其主要来源于铬盐生产、电镀、鞣革、颜料生产、采矿和冶金等行业。铬在环境中存在两种稳定的铬氧化态：与cr(vi)相比，cr(iii)溶解性低、迁移能力弱和生物毒性低。因此，水中铬污染治理的有效策略之一就是将cr(vi)还原成cr(iii)。其中微生物还原cr(vi)被看作是一种具有很大应用潜力的方法，如王洋洋等人1利用pannonibacterphragmitetusbb处理cr(vi)污染水体，但微生物修复过程仍存在周期较长的缺点，且利用微生物进行原位修复时受环境因子影响大，与土著微生物存在相互竞争，造成修复效果不稳定。
目前有大量的研究报道利用酶制剂修复土壤和治理污染地下水，如利用漆酶修复ddt污染的土壤2、土壤酶修复铅污染土壤3、固定化酶修复被农药污染的土壤4、硝化细菌产生的酶对对地下水进行脱氮处理等。对于cr(vi)污染，有大量研究报道了cr(vi)还原酶，如escherichiacoli中的nfsa和yief，其最大还原速率分别为0.25和5.0μmol/min/mg5；pseudomonasputidakt2400中的chrr其最大还原速率为8.8μmol/min/mg6。这些蛋白酶均能在一定条件下实现cr(vi)的有效还原，但是离大规模工业应用尚有较大差距。
p.phragmitetusbb的cr(vi)还原能力远高于经典cr(vi)还原菌p.putidakt2440(19.23mm>>400μm)等其他细菌6，且全基因组及功能分析显示其胞内存在cr(vi)高效还原酶。因此，利用这类酶中的一种或多种制成酶制剂处理含cr(vi)废水具有工业化应用潜能。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种来自于pannonibacterphragmitetusbb菌的六价铬还原酶。
本发明的另一目的是提供所述六价铬还原酶在治理水体铬污染中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的六价铬还原酶，其氨基酸序列如seqidno:1所示，或该序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。其在genbank中注释结果为含铜的亚硝酸盐还原酶，
本发明的六价铬还原酶可按如下方法制备：对六价铬还原酶编码基因进行密码子优化后在大肠杆菌(如e.colibl21)中表达获得，密码子优化前后的核苷酸序列分别如seqidno:2和seqidno:3所示。
本发明还提供一种六价铬还原剂，其活性成分为所述六价铬还原酶。
本发明还提供所述六价铬还原酶或所述六价铬还原剂在治理水体铬污染中的应用。
前述的应用，向六价铬污染水体中投放所述六价铬还原酶和/或六价铬还原剂，将高水溶性的六价铬还原成低水溶性的三价铬。通过降低其迁移性达到治理目的。
优选地，当污染水体中铬浓度≤100mg/l时，六价铬还原酶的投放量为0.03-0.1u/mgcr(ⅵ)。根据动力学最大速度vmax＝34.46μmolcr(ⅵ)/min/mg酶蛋白折算。
优选地，还原反应在ph6-8的条件下进行。酶的最适作用ph值为7。
优选地，还原反应在25-45℃的温度下进行。酶的最适作用温度为35℃。
本发明还提供一种能快速去除废水中cr(vi)的酶制剂的制备方法，将pannonibacterphragmitetusbb菌株cgmccno.3052的铬还原酶基因nirk-cr构建到表达载体上，并利用原核表达系统制备高活性的铬还原酶nirk-cr。
具体地，以pannonibacterphragmitetusbb菌株cgmccno.3052基因组为模板，设计如下引物，通过pcr扩增获得铬还原酶基因nirk-cr的核酸序列(seqidno:2)，将核酸序列构建到pet-22b(+)载体上，并转化bl21大肠杆感受态细胞，所得重组菌经诱导表达，分离纯化得到目的蛋白。
为了进一步提高酶表达量，根据表达菌bl21对密码子的偏好性，对铬还原酶基因nirk-cr进行密码子的优化，密码子优化后铬还原酶基因nirk-cr的核酸序列见seqidno:3。
用于扩增上述铬还原酶基因nirk-cr的引物对为(seqidno:4-5)：
f：5′-attgaattctatgacccgccgtgaag-3′
r：5′-aatctcgagacagttgctggggatc-3′
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明以pannonibacterphragmitetusbb中的铬还原酶nirk-cr作为还原cr(vi)的酶制剂有效成分，该酶制剂对cr(vi)具有较强的还原作用，能快速去除废水中的cr(vi)，在含cr(vi)废水处理中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中cr(vi)还原基因nirk-cr的pcr扩增结果电泳图谱。
图2为本发明实施例1中目的基因nirk-cr和表达载体pet-22b(+)双酶切结果电泳图。
图3为本发明实施例2中目的基因nirk-cr密码子优化前后胞外表达铬还原酶nirk-cr的sds-page图。
图4为本发明实施例3中诱导温度对胞外表达铬还原酶nirk-cr影响的sds-page图。其中，泳道从左至右分别对应于37℃、30℃、25℃及dnamarker。
图5为本发明实施例3中诱导剂iptg浓度对胞外表达铬还原酶nirk-cr影响的sds-page图。其中，泳道从左至右分别对应于0、0.5mm、1mm、2mm及蛋白marker。
图6为本发明实施例3中铬还原酶nirk-cr纯化后的sds-page图。
图7为本发明实施例4中温度和ph值对酶制剂活性的影响。
图8为本发明实施例4中酶制剂对温度的耐受性。
图9为本发明实施例5中酶制剂对含cr(vi)废水的还原情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1构建cr(vi)还原酶基因nirk-cr的表达质粒
1、引物设计与合成
用primerpremier5按照基因nirk-cr的dna序列(nz_kz269956.1p874_rs13880)设计相应的引物，并加入了相应的酶切位点ecori和xhoi，将所设计的基因pcr引物序列(表1)在上海生工生物公司技术服务合成引物，合成量为2od。
表1pcr引物
2、pcr扩增基因
pcr体系(25μl)：pcrmix12.5μl；primerr0.5μl；primerf0.5μl；dna模板(细菌总dna)1μl；ddh2o10.5μl。
pcr扩增程序：95℃变性5min，然后进入循环：95℃使dna变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后再72℃延伸7min。
3、pcr产物的电泳与切胶回收
将pcr产物利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，并利用eb染色后观察条带大小，然后切胶，利用dna凝胶回收试剂盒(天根，dp209)对目的基因进行纯化回收。pcr产物的电泳结果如图1所示，cr(vi)还原基因的大小在1200bp左右。
4、cr(vi)还原基因与pet-22b(+)载体质粒的连接
将纯化的pcr产物以及表达载体pet-22b(+)质粒利用ecori和xhoi在37℃下双酶切过夜，酶切体系：ecori1μl；xhoi1μl；10×buffer5μl；pcr产物40μl；ddh2o3μl。将酶切产物利用1％的琼脂糖进行电泳验证，并利用dna回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，dp209)对特异的酶切产物进行回收，酶切产物如图2所示。
利用t4dna连接酶将酶切产物置于4℃过夜连接到酶切的载体上，连接体系：质粒1μl；10×buffer1μl；t4dna连接酶1μl；pcr产物6μl；ddh2o1μl。
5、转化宿主菌bl21
取连接产物加入bl21感受态细胞中放于冰上30min，再42℃水浴90s，冰上放置2min，加入800μllb液体培养基于37℃、150r/min培养1h，然后将转化产物涂布到含有氨苄青霉素(100mg/l)的固体培养基上。37℃正面放置培养2小时，然后将培养皿倒置培养过夜。
6、阳性克隆子的鉴定
从固体平板上挑取阳性克隆子，接种到含有氨苄青霉素(100mg/l)的液体培养基中培养，然后收集菌体，利用质粒提取试剂盒(sigma,pln350)对转化入bl21的质粒进行提取，然后利用引物t7promoter和t7terminator进行测序验证。
实施例2铬还原酶基因nirk-cr的密码子优化
如实施例1所述将目的基因转入大肠杆菌e.colibl21进行胞外表达，诱导表达后发现表达量不高，如图3所示。因此根据大肠杆菌密码子使用的偏好性7，对其中部分密码子进行优化，以提高目的基因nirk-cr在e.colibl21中的表达量。
所述优化后的核苷酸序列如seqidno：3所示，密码子优化前后蛋白表达量变化的sds-page如图3所示。结果显示，对目的基因进行密码子优化之后表达量明显提升。
实施例3铬还原酶nirk-cr蛋白的表达和纯化
1、蛋白的诱导表达
将平板上阳性克隆子接种到灭菌的lb液体培养基中，37℃震荡培养，待菌液od600值达0.6-0.8时加入相应量的iptg，然后放置于摇床中进行诱导表达，诱导表达5小时后，收集菌体，用超声破碎细胞得到粗酶液。
2、蛋白诱导表达的条件优化
通过改变培养的温度(25℃、30℃和37℃)及iptg浓度(0、0.5、1、2mm)，经过sds-page电泳观察蛋白表达情况，如图4、图5所示，得出最佳的诱导表达条件为诱导温度为30℃、诱导剂iptg浓度为0.5mm。
3、目的蛋白的纯化制成酶制剂
将平板上阳性克隆子接种到灭菌的lb液体培养基中，37℃震荡培养，待菌液od600值达0.6-0.8时加入iptg(0.5mm)，然后放置于30℃摇床中进行诱导表达。诱导表达5小时后，收集菌体，在缓冲液中重悬，然后利用超声对细胞进行破碎。12000rpm离心15min使细胞碎片和细胞液中的成分分离开，然后上清液加入蛋白纯化柱(碧云天，p2226)对表达的蛋白进行纯化，具体纯化步骤按照蛋白纯化试剂盒操作说明书。将纯化的蛋白进行sds-page电泳，结果如图6所示。最终制成酶制剂。
实施例4酶制剂的活性分析
1、温度对酶制剂活性的影响
将酶制剂分别在25、30、35、40、45℃处理30min，并取样检测酶制剂的活性。如图7所示，酶制剂在35℃时具有最大的活性，30℃及40℃时有比较高的活性，分别为最大活性的85％和90％。25℃和45℃时其活性为最大活性的43％和60％。由此可知，酶制剂在较宽的温度范围内均具有活性。
2、ph对酶制剂活性的影响
不同ph值(5、6、7、8、9)条件下对酶制剂的活性进行了检测。如图7所示，酶制剂在ph值为7时具有最大的活性，当ph值为6和8时其活性只能达到ph值为7时的50％以下，由此可知该酶制剂对ph值条件要求非常专一。
3、酶制剂对温度的耐受性
将酶制剂分别在35℃、50℃、60℃、70℃处理5、10、15、20、25和30min，并取样检测酶制剂的活性。结果如图8所示。结果显示，在35℃处理30min以后酶活并没有下降，一直维持着原来的活性。而在50℃处理一段时间后其活性就会出现明显的下降，处理30min以后其活性只保留82％左右。当酶制剂在60℃处理30min以后其蛋白活性基本消失，在60℃处理5min后其活性已经出现了明显的下降，只有原来活性的75％左右，10min后其活性只有原来的27％左右，处理15min后其蛋白活性基本消失。在70℃处理10min以后就不能够再检测到目的蛋白的活性。这说明目的蛋白对温度具有一定的耐受，能够在50℃条件下短时间内维持活性。
实施例5酶制剂在含cr(vi)废水处理中的应用
从湖南某企业取一定量的含cr(ⅵ)废水，首先测定未进行处理前cr(ⅵ)浓度，为100mg/l。将实施例2制备的酶制剂按0.1u/mgcr(ⅵ)的投加量(即1u)加入其中，35℃处理6小时，测定其中残余cr(ⅵ)浓度，并设置不添加酶制剂的对照组，结果如图9所示。
由图9可知，在未添加酶制剂的废水中，cr(ⅵ)浓度未发生明显变化，加入酶制剂的废水中cr(ⅵ)浓度降到35mg/l，还原率达65％，能快速有效地去除废水中的六价铬。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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