本发明涉及猪遗传标记制备技术领域，具体涉及母猪肢蹄骨密度性状的snp遗传标记。本发明所述的遗传标记可用于猪肢蹄骨密度性状的预测。
背景技术：
随着科技的发展，猪养殖业在遗传育种、营养调控以及疾病防控等方面均取得了显著突破，商品猪的瘦肉率、料肉比以及生长速度均有了巨大的提升。但伴随集约化养殖而来的便是日益突出的肢蹄问题，为了集约化生产，猪群的活动范围有限，另外栏舍的设计(漏缝地板)更是加剧了猪肢蹄病的发生。据报道，在所有通过性能测定的后备公猪中，有20-50％的后备公猪因肢蹄软弱而被淘汰，在生产母猪中由于肢蹄软弱而被淘汰的母猪也高达6.1-15％(张徐非等，位置功能候选基因hmga1、c6orf106和nssscg00000023160与猪肢蹄结实度的关联性[j].中国农业科学,2016,49(20):4030-4039.)。另外，由于生产成本的限制，猪的肢蹄一旦出现问题，只有极少数能够被治愈(郭春艳.浅谈母猪肢蹄病的发病原因及防治措施[j].农家致富顾问,2017(16):20-20)，绝大多数则采取淘汰措施，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。
肢蹄结实度，是指肢蹄健康程度和四肢运动协调程度的综合反应，但为了研究方便一般用其对立面-肢蹄软弱(legweakness)来衡量。总的来说，肢蹄结实度可以从肢蹄评分、步态评分、腿型评分、骨矿物含量和骨密度、软骨病评分、关节面软骨评分及肱二头肌长度等多个方面衡量(候利娟等，猪肢蹄结实度的遗传解析进展.猪业科学2013:4-7)。而骨密度是人类骨质疏松诊断的一个重要参照标准(程晓光，骨密度测量和骨质疏松诊断[j].国际内分泌代谢杂志,2005,25(5):308-310)。另外，有报道称骨密度(bonemineraldensity,bmd)可以反映骨骼强度的58-70％(曹海伟等.定量超声与双能骨密度测定在骨质疏松诊断中的应用及评价[j].中国骨质疏松杂志,2001,7(2):110-112)。由此可见，骨密度在动物骨骼强度的研究中是一个重要指标，但由于各种生产条件的限制，人们对于家畜骨骼的研究十分罕见。
骨密度，即单位体积骨矿物质的含量，单位为g/cm3，常见的骨密度测定方法有放射吸收法、双能x射线测定法、定量计算机断层扫描技术以及轴向超声波传播技术等(曹健，骨密度(bmd)测定的应用评价[j].医药前沿,2013(2).)，其中双能x射线测定法及定量计算机断层扫描技术应用最广，但双能x射线测量技术测定得为面积骨密度，受物体几何体积的影响，而定量计算机断层扫描技术可以更准确地测量动物骨密度，但其设备价格昂贵(刘珺，双能x线骨密度仪与定量ct测量骨密度的比较研究[d]，中南大学,2005)，且操作十分麻烦(对于大型家畜需要麻醉后进行)，大大限制了其在动物骨密度研究中的应用。而超声波骨轴传播技术，是近年来新兴的一种骨密度测定技术，其不仅能够测定动物骨密度，在一定程度上还可以反映动物骨强度及骨结构的情况，具有简便、无辐射损伤、重复精度高、且价格便宜，易于携带的优点(孙涛等，骨密度无损测定方法简介及其最新进展[j]，中国医疗设备,2009,24(1):49-51)。由此可以看出，利用超声骨轴传播技术测定猪肢蹄骨密度，并利用gwas筛选出与中肢蹄骨密度相关的snp遗传标记，为家猪肢蹄性状的遗传选良提供了一种可行途径，对于猪养殖业具有重要意义。
本发明中发现的snp与猪肢蹄骨密度性状的相关性达到了显著水平，为家猪肢蹄结实度性状的研究提供了新的遗传资源。
技术实现要素：
本发明的目的在于完善家猪抗病育种遗传标记，利用50k的基因芯片对snp进行分型，并使用gwas筛选与母猪肢蹄相关的snp，为猪的抗病育种提供了新的遗传标记资源和应用。
本发明的技术方案如下叙述：
申请人通过基因分型技术并参阅ensembl数据库，得到登陆号为alga0082045单核苷酸突变的上下游50bp的核苷酸序列，其序列如表seqidno:1所示。具体如下所述：
gcttaggccaaaaagataatttatagctatatgttattggagagttcaagr(t/c)aaggctggatccaggggttcggataatgtcatcaggaaagtgtctgtttc
上述序列的第51bp碱基处的r为一个t51-c51的等位基因突变,该突变使seqidno：1序列产生核苷酸多态性。该遗传标记可以作为检测与猪肢蹄骨密度相关的遗传标记,且当seqidno：1上的第51位核苷酸为c时，则母猪的肢蹄具有更高的骨密度。
上述序列可以作为检测与猪骨密度性状相关的遗传标记。
申请人提供了一种筛选猪骨密度性状相关snp遗传标记的方法，所述的方法包括如下步骤：
①按常规方法提取猪耳朵组织的基因组dna，并对dna进行质量检测。
②利用基因芯片技术进行分型(具体步骤见说明书文末说明)。
③采用基于单标记关联回归模型的方法，以个体性别作为固定效应，在利用r统计环境下的enabel软件包进行gwas分析。具体的回归模型如下：y＝xb+sa+zu+e，其中y代表“表型值向量”(thevectorofphenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“snp的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～n(0,gσα2)，g表示基因组相似度矩阵(基于snp标记)，g表示多基因加性方差(通过此进行遗传力的估计)；x、s、z分别为b、α、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，e～n(0,iσe2)，表示残差方差。
本发明筛选的遗传标记可用于非诊断目的的对猪肢蹄骨密度相关基因的基因型或与猪肢蹄性状中的骨密度之间的关联分析中，为猪骨密度性状的遗传标记辅助选择提供了一个新的遗传标记资源。
与现有技术相比本发明具有的有益效果：
本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的肢蹄结实度，与目前的pcr-rflp等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表seqidno：1是本发明筛选得遗传标记(即登陆号为alga0082045的基因片段)上下游50bp核苷酸序列。该片段是本发明筛选的遗传标记。序列长度为101bp，在该序列的51位碱基处的r存在一个t/c等位基因突变。
图1：本发明的总体技术流程示意图。
图2：是本发明克隆的alga0082045基因的上下游50bp核苷酸序列和本发明遗传标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图2显示的核苷酸序列(即序列表seqidno:1所述的序列)的第51位碱基处存在一个t/c等位基因突变(该序列的第51位碱基处的英文字母“r”为突变位点)。
图3：是本发明的曼哈顿图。附图标记说明：黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的遗传标记，该遗传标记位于猪第14号染色体上。
具体实施方式
实施例1：基因分型检测
(1)利用试剂盒法提取骨密度相关群体的耳朵组织dna
1)将骨密度相关群体(该群体包括丹系(丹麦)的大白及长白，为常规品种，由广西扬翔股份有限公司提供)的耳样组织用眼科剪剪碎至糊状，加入200ulga(试剂盒自带)，并震荡混匀；然后放入56℃水浴锅中消化过夜。
2)将消化后的组织样加入200ul缓冲液gb(试剂盒自带)，充分颠倒混匀，并于70℃下放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁上的水珠。
3)加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁上的水珠。
4)将上一步所得溶液及絮状沉淀一并加入吸附柱cb3中，并将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放回收集管中。
5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中。
6)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中，并重复该步骤。
7)将吸附柱cb3置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中剩余的漂洗液。
8)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，并向吸附柱膜中间部位悬空滴加50-200ul的洗脱液te，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)snp基因型的判定及质量控制
使用50k基因芯片(geneseekporcine50ksnp芯片)进行分型，并对基因型数据进行质检，最终有895个个体和48909个snp用于全基因组分析(gwas)研究。
实施例2：本发明筛选的遗传标记及其分型方法在猪肢蹄骨密度性状关联分析中的应用(1)遗传标记分型结果与肢蹄骨密度性状关联分析
用于基因型与肢蹄骨密度性状关联检测分析所用的实验猪群来自广西扬翔股份有限公司培育的纯种母猪群体，包括大白猪、长白猪(为常规品种)。基因分型所用的dna由纯种大白猪、长白猪(说明书正文和表中所称的“纯种大白、长白”简称“猪”)耳样提取。采用基于单标记关联回归模型的方法，采用个体的性别作为固定效应，在利用r统计环境下的genabel软件包进行gwas分析。具体的回归分析模型如下：y＝xb+sa+zu+e
其中：y代表“表型值向量”(thevectorofphenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“snp的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～n(0,gσα2)，g表示基因组相似度矩阵(基于snp标记)，g表示多基因加性方差(通过此方差进行遗传力的估计)；x、s、z分别为b、σ、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，e～n(0,iσe2)，表示残差方差。
关联分析结果见表1。
表1利用alga0082045基因多态性对不同基因型母猪骨密度的检测结果
表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。
由表1可知，基因型为cc的个体肢蹄骨密度极显著高于ct个体，所以c是有利于骨密度增加的等位基因。
附录：关于基因芯片技术的说明：
本发明使用illumina公司研制geneseekporcine50ksnp芯片扫描，该芯片包含超过50000个snp位点，覆盖猪的基因组。此芯片整合了多种猪的基因差异，包括杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，能提供足够的snp密度，可应用于全基因组关联分析(gwas)中。
主要参考文献：
[1]张徐非等，位置功能候选基因hmga1、c6orf106和enssscg00000023160与猪肢蹄结实度的关联性[j].中国农业科学,2016,49(20):4030-4039；
[2]郭春艳，浅谈母猪肢蹄病的发病原因及防治措施[j]，农家致富顾问,2017(16):20-20；
[3]候利娟等，猪肢蹄结实度的遗传解析进展.猪业科学2013:94-7；
[4]程晓光.骨密度测量和骨质疏松诊断[j].国际内分泌代谢杂志,2005,25(5):308-310；
[5]曹海伟等，定量超声与双能骨密度测定在骨质疏松诊断中的应用及评价[j]，中国骨质疏松杂志,2001,7(2):110-112；
[6]曹健，骨密度(bmd)测定的应用评价[j].医药前沿,2013(2)；
[7]刘珺，双能x线骨密度仪与定量ct测量骨密度的比较研究[d]，中南大学，2005；
[8]孙涛等，骨密度无损测定方法简介及其最新进展[j]，中国医疗设备,2009。
序列表
<110>华中农业大学
<120>母猪肢蹄骨密度性状的snp遗传标记
<141>2018-05-02
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>101
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(101)
<220>
<221>mutation
<222>(51)..(51)
<400>1
gcttaggccaaaaagataatttatagctatatgttattggagagttcaagcaaggctgga60
tccaggggttcggataatgtcatcaggaaagtgtctgtttc101