本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种通过恒温扩增技术，进行支原体污染检测的方法，以及该方法中所使用的引物和探针的组合。
背景技术：
：：细胞培养技术在生物制药、疫苗生产和临床细胞治疗等领域都是必不可少的核心环节之一。然而在培养过程中面临一个严重问题是细胞经常会被污染，污染来源包括支原体、细菌和真菌等类型，其中支原体是最主要的污染源[1-2]。支原体污染后又可通过血清，实验人员和已污染的细胞培养物等途径进行扩散[3-5]，引发细胞样品的更大面积污染。据统计世界范围内大约有15％-35％的细胞培养物遭受了支原体污染[6-7]。支原体作为目前发现的生物界最小无细胞壁的原核细胞，大小介于细菌和病毒之间，直径约为0.2-0.3um，可以通过常用的除菌滤膜(0.22-0.45um)，导致细胞培养中很难避免支原体的污染。支原体细胞膜分为三层，内外层为蛋白质，中间为脂质，含有胆固醇较多，使支原体膜更具柔顺性，这个特性使得支原体对脱水、渗透压、压力等物理因素抵抗力大大增强，支原体没有细胞壁，对普通的抗生素有抗性[8]，所以细胞一旦被支原体污染就很难清除干净。现在已经被发现的支原体大约有200多种，其中细胞培养过程中导致污染的最常见支原体类型主要包括：猪鼻支原体(m.hyorhinis)、发酵支原体(m.fementans)、精氨酸支原体(m.arginina)、口腔支原体(m.orale)、人型支原体(m.hominis)、唾液支原体(m.salivarium)、梨支原体(m.pirum)和莱氏无胆甾原体(a.laidlawii)。根据报道，95％的细胞污染是由这8种支原体造成的[9-10]。支原体会和宿主细胞竞争培养基营养成分，大量消耗细胞培养基中的必需氨基酸(如谷氨酸等)，影响细胞生长和形态结构，从而对细胞代谢、基因表达产生巨大影响[11]。被支原体污染后细胞生长速度变慢，细胞发生病变，表现为细胞体积增大，碎片增多，在细胞质中产生颗粒。培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代，甚至整个细胞群体溶解。支原体还会导致细胞染色体断裂、数目减少[12-13]。支原体可通过影响巨噬细胞的活性，抑制干扰素的合成或降低其活性，从而加大了细胞感染病菌和病毒的几率。细胞被支原体污染后，所得到的实验数据和结论不具有可信度[14]。支原体污染导致实验室一些珍贵的细胞损失。而由支原体污染细胞进行生物制剂生产时，更会导致终产品不合格，给工业生产带来巨大经济损失[15]，生产的疫苗会失去了药效价值，人和动物接种这样的疫苗将大大增加患病的风险[16]；人体输入遭受支原体污染的细胞治疗产品会有生命危险[17]。如果细胞被细菌及真菌污染，容易在培养过程中发现。细胞被细菌污染后培养液变浑浊，溶液ph值急速变化，污染严重的还会导致细胞死亡；真菌污染的细胞培养液中会出现白色、浅黄色及黑色的小点。不同于细胞被细菌及真菌污染容易发现，而细胞被支原体污染后细胞不会立即死亡，被支原体污染不会引起细胞外观的明显变化，细胞培养液不会发生浑浊，并且污染初期阶段在高倍显微镜下观察其细胞形态也不会发生改变[18]，需要花很多的精力去识别。因此细胞支原体污染难以察觉，具有极大的隐蔽性[19]，对细胞的潜在的威胁更大。由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用[8]。为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测[20]。美国食品药品监督管理局(fda)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况[21]。欧洲药典europeanpharmacopoeia(ep,7thedition,section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测[22]。提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要[19]。1956年，robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来[23]，研究者们分别对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入的研究。1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(tigr)与位于chapelhill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序[24]，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后richardherrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序[25]，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。到目前为止，出现了很多支原体的检测方法[26-27]，有传统检测方法(包括直接培养法和dna荧光染色法)、atp酶法、免疫法(elisa法等)以及分子诊断方法(包括普通pcr和荧光pcr、lamp，重组酶扩增技术等)，这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。培养法是最传统的支原体污染检测方法，也是最早的检测方法，基本实验步骤首先是将细胞培养物置于支原体肉汤液体培养基中，37℃培养3天后离心，将沉淀物转移至支原体固体琼脂培养基中，相同条件下培养，观察培养基中若有类似煎鸡蛋样菌落出现，则细胞被支原体污染了。培养法简单直观，大多数支原体可出现特有的典型菌落，但是支原体生长缓慢，培养一代大约需要3-4小时，一般需要培养28天才能判断是否有支原体的污染[27]，工作量大，而且有进一步扩大支原体传播的风险。支原体对培养条件比较苛刻，培养基成分质量或批次的不同都会对支原体的正常生长产生影响，而且有一些支原体无法通过培养法生长，因此使用培养法检测结果并不准确容易产生假阴性[28]。为了减轻支原体培养法的工作量，缩短检测时间，需要一种快速简单的检测方法阻止支原体污染的扩散，出现了使用dna荧光染色法检测支原体的方法。dna荧光染色法是利用荧光试剂hoechst33258等标记细胞和支原体dna，荧光染料会结合到dna的a-t富集区域，因为支原体dna中a-t含量占多数，所以可将其染色，染料在紫外光激发下产生黄绿色荧光，利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。被支原体污染的细胞不仅在细胞核而且在细胞核外及细胞膜上均可见许多大小均一之荧光小点[29]，即为支原体dna，证明细胞被支原体污染了。由于该方法不需要培养支原体，只需要用荧光显微镜观察，操作较为简便，检测快速。但是该方法灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出。细胞裂解死亡产生碎片也会被荧光染料染色被误认为是支原体染色所致造成假阳性。dna荧光染色法比细胞培养法检测缩短了检测时间但灵敏度和准确性不高且检测时需要荧光显微镜[30]。荧光染色法不能确定具体是哪种支原体导致的细胞污染。荧光染色法一般要求培养无污染的指示细胞作为对照，增加了检测的工作量。鉴于dna荧光染色法的不足之处，出现了灵敏度和准确性更高的pcr(polymerasechainreaction)检测支原体方法，remyteyssoud等以支原体的16srrna核酸序列中高度保守序列设计引物[31-33]，采用pcr的方法检测细胞中的支原体污染。支原体作为一种原核生物，其rrna基因是由保守和多变序列间隔排列而成，能够作为生物分类的指标。pcr以4种dntp为底物，在引物存在的情况下，在dna模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。pcr检测方法尤其适用于培养困难而且耗时的支原体的检测鉴定。pcr法检测支原体基本步骤包括提取待测细胞上清，在pcr总反应体系中加入pcr缓冲液、氯化镁、taq酶、dntp、模板和引物，设置扩增条件扩增反应。取微量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，观察是否有目的片段出现。pcr方法由于引物设计特异性较强，可以进行种属的鉴别。比常规培养法检测时间大大缩短，比dna荧光染色法具有较高的特异性[34]，能够鉴别支原体的不同种。pcr产物的分析一般采用琼脂糖凝胶电泳分析，初步判断pcr产物片段的大小与预计是否一致。但最令人头痛的问题是pcr扩增产物污染，因为pcr产物拷贝量大，极其微量的污染即可造成假阳性的产生[11]。最可能造成pcr产物污染的形式是气溶胶污染，在操作时比较剧烈地摇动反应管，尤其是打开反应管的盖进行电泳点样操作时都可形成气溶胶而污染。一个气溶胶颗粒包含大量拷贝，因而由气溶胶造成的污染产生的假阳性是一个值得特别重视的问题[11]，而且pcr一次只能检测一个指标。随着分子生物学的发展，逐渐发展了利用荧光定量pcr技术进行支原体检测手段，如melaniestormer等利用荧光定量pcr方法快速检测细胞中的支原体污染[35]。荧光定量pcr(real-timefluorescencequantitativepcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司推出的一种核酸新定量试验技术，荧光定量pcr是在常规pcr基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量pcr技术中ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表ct值。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量pcr检测支原体主要的步骤包括支原体特异引物和探针的设计，阳性标准品的制备及标准曲线的绘制，荧光定量pcr特异性实验，敏感性实验和重复性实验，最后是用待测细胞上清液上机检测，通过ct值及扩增曲线判断。随着实时荧光定量pcr的使用，出现了很多利用此技术检测支原体的研究，lorenzons等利用荧光定量pcr方法检测肺炎支原体capripneumoniae[36]等，2017年gerlier等发明了利用荧光定量pcr检测支原体的专利[37]。实时荧光定量pcr简化了操作步骤，采用闭管检测可避免pcr跑胶导致的气溶胶假阳性的出现，敏感性高，可以实现实时监控，还可以实现定量判断。实时荧光定量pcr具有比pcr检测快，灵敏度高的优势[38]，尤其适合样品模板含量较低时使用，实时荧光定量pcr能通过溶解曲线能够判断特异性扩增[39]。实时荧光定量pcr需要配套价格高昂的荧光定量pcr仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationmethod,lamp)是一种新兴的基因扩增技术，由日本学者notomi[40]2000年在nucleicacidsres杂志上公开发表，作为一种分子生物学检测技术，现先已广泛应用于分子检测领域，2005年saitor等人发表了lamp法快速检测肺炎支原体的文章[41]。2014年heying[42]等用lamp方法快速检测capripneumoniae支原体，2016年美国jonasm[43]等发明了利用lamp方法检测肺炎支原体的专利。2016年曹振发明了一种检测广谱支原体的lamp方法的专利[44]。2017年matsuzakii[45]等使用lamp用于基因转移的快速检测。lamp原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(如bst酶)的作用下，水浴锅中63℃左右，60分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有很高的扩增效率，操作简单，检测不需要使用特殊的仪器。lamp虽然增加了扩增效率，但引物间的非特异性配对容易导致假阳性结果[46-50]，限制了lamp方法的使用。由于实时荧光定量pcr需要配套的仪器，且操作复杂，需要有经验的实验人员对检测结果进行分析，而lamp法会出现假阳性问题，使实时荧光定量pcr和lamp法在检测支原体污染上都存在一定的弊端，为了寻求一种使用简单，结果准确的支原体检测方法，出现了利用支原体酶这一特定活性检测支原体的atp酶法[29，51]，如lonza公司推出的商品化的mycoalert支原体检测试剂盒，atp酶法是采用生物发光的原理，检测支原体酶活性，其检测的支原体酶广泛存在于180多种支原体中，而这种酶不存在于真核细胞中。当支原体被裂解后，释放的酶与反应底物发生催化反应，将adp转化成atp[29]，通过荧光分光光度计测量样品中添加底物前后atp的含量，可以得到一个比率，该比率指示支原体是否存在。如果这些酶不存在，第二次读数相对于第一次读数就没有增加，如果酶与底物进行特异性反应，就会导致atp含量上升。atp含量的上升通过生物发光化学反应可以检测到，读数上升表明存在支原体污染。atp酶法能够检测的支原体种类比较全，检测结果能够量化，容易判断，耗时短，整个实验过程需要20分钟左右[28]。由于atp酶法主要依赖支原体酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性，2015年vahidmollakazemiha等研究发现atp酶法的灵敏度和准确性要低于实时荧光定量pcr法[9]，atp酶法需要使用荧光分光光度计，且商品化的支原体检测试剂盒价格昂贵，大面积推广使用成本较高。通过比较实时荧光定量pcr、和atp酶法可以看出，基于核酸扩增检测支原体的方法在其灵敏度和准确性上仍是支原体快速筛选检测的首要手段。因此，本领域急需开发一种操作简便、特异性强、灵敏度高的基于核酸扩增的支原体检测方法。技术实现要素：恒温扩增技术因其操作简单、仪器控温容易实现已作为微生物快速检验的最重要的手段之一。目前在工业和科研领域最为常见的恒温扩增技术包括lamp(loop-mediatedisothermalamplificationmethod)[52-53]和rpa(重组酶聚合酶扩增技术，recombinasepolymeraseamplification)[54]。其中，rpa在扩增时间、扩增特异性、扩增所需要的能耗等方面均具有明显的优势。原理为通过反应体系中通常为28-35个碱基的两条特异性引物与重组酶形成复合物，在模板dna上寻找同源序列发生链交换，并在dna聚合酶作用下发生延伸[55]。经过上下游引物在模板的特异性区段两端分别结合延伸，循环往复发生指数级扩增[55]。扩增产物虽然可通过添加sybrgreen染料实现荧光信号的增加，但因荧光染料无法区分非特异性，而通过反应体系中增加可以被核酸外切酶iii或者核酸内切酶iv进行碱基类似物切除的方式的特异性荧光探针技术进行检测，从而大大提高了检测的特异性。目前rpa核酸检测技术现已应用到农业，兽医，生物制药等多个领域[56-58]。boyle(2013)等人研究发现rpa对于hiv-1的诊断是一个理想的技术，不需要复杂的温度循环设备，在恒定温度条件下20min内可以完成目的基因的扩增，对于hiv-1前病毒nda检测灵敏度可低至3个拷贝[59]。目前rpa技术已经在多个传染病病原和微生物检测领域得以广泛的报道[60-63]，如用于致病性支原体或是某种病毒等的检测，但报道均为针对一种或完全同一类的病原进行检测，截止目前利用rpa技术检测细胞支原体污染的相关研究尚未见有报道。而支原体污染检测需要跨不同的物种进行检测，并且从进化树亲缘关系上，与支原体检测需要包含的物种如莱氏无胆甾原体其基因序列和大肠杆菌同源性更高，需要排除大肠杆菌的干扰同时包含莱氏无胆甾原体。因此通过常规序列同源性分析，无法在上述两条引物与探针之间设计特异性区段能够在同源性上既能包括常见的支原体污染类型，又能排除大肠杆菌序列。本发明所述的支原体，是指m.arginini、m.fermentans、m.hominis、m.orale、m.hyorhinis、m.salivarium、m.pirum、acholeplamasalaidlaawii、ureaplasmaurealyticum、spiroplasmacitri、m.gallisepticum、m.genitalium、m.pneumoniae、m.penetrans、m.capricolum、m.bovis、m.bovoculi、m.synoviae、m.pulmonis、m.flocculare、m.arthritidis、m.hyosynoviae、m.hyopneumoniae、acholeplasmamodicum、acholeplasmamorum、m.entomophilum、m.florum、m.agussizii、m.alkalescens、m.alligatoris、m.arthriditis、m.bovirhinis、m.buccale、m.californicum、m.canadense、m.cloacale、m.conjunctivae、m.crocodyli、m.equirhinis、m.faucium、m.gallinaceum、m.iguanae、m.lipophilum、m.muris、m.neurolyticum、m.opalescens、m.primatumm.spermatophilum、m.dispar、m.falconis、m.lipofaciens以及在基因组序列上与上述51种具有90％以上同源性的相同或近似种属的微生物。本研究发明者通过大量实验数据发现，rpa扩增酶具有较强的错配容忍性，而针对3’末端的错配将大大影响扩增的效率。通过在探针序列中，在碱基类似物两端待排除序列引入错配，从而通过特异性扩增的引物及和特异性剪切的探针组合，达到扩增特异性的检验目的。错配容忍度研究也有相关报道，patil(2011)等人研究发现单链dna(碱基大小约为83bp)有12％的错配，导致链交换率降低了50％，但与pcr相比同样在引物3’末端错配也会降低其扩增效率[64]。boyle(2013)等人研究结果显示rpa能够检测许多不同的hiv-1病毒亚型，能容忍高达9个碱基的错配[59]。另一项研究表明rpa检测手足口rna病毒能够容忍5个碱基的错配[65]。daher(2014)等人研究结果表明rpa对引物与模板间的错配容忍度较高[66]。然而，chen(2015)等人研究表明引物3’末端与模板的错配会影响dna聚合酶的延伸[67]，c-c,a-g,g-a和a-a这4种引物与模板间的错配对dna聚合酶的延伸影响比较大，会严重削弱扩增效率。基于以上原则，发明人通过对比23条常见支原体16s-23s-5s序列以及大肠杆菌基因序列，设计rpa上下游引物，引物在3’末端与大肠杆菌至少有一个碱基的错配，但与所有支原体3’末端并无错配，虽然在5’端与中间有个别碱基错配，但并不影响其扩增；并设计特异性的探针区段，在碱基类似物两端在待排除序列引入错配，从而通过特异性扩增的引物及和特异性剪切的探针组合。因此本发明通过对比文献上列出的常见保守基因，并选定保守性强的16s-its-23s-5srdna作为目标扩增区段，本区段通常在基因组上有1-15个拷贝数[68]，因此相对于选择其他单拷贝基因，选择本区段可以提高支原体污染检测的灵敏度。从ncbi检索支原体及大肠杆菌的16s-its-23s-5srdna序列，分别是：m.arginini(登录号：ap014657.1)、m.fermentans(登录号：cp002458.1)、m.hominis(登录号：cp009652.1)、m.orale(登录号：nz_atuh01000005.1)、m.hyorhinis(登录号：cp016817.1)、m.salivarium(登录号：nz_axze01000009.1)、m.pirum(登录号：nz_kk365983.1)、acholeplamasalaidlaawii(登录号：cp000896.1)、ureaplasmaurealyticum(登录号：ap014584.1)、spiroplasmacitri(登录号：cp013197.1)、m.gallisepticum(登录号：cp006916.3)、m.genitalium(登录号：cp003773.1)、m.pneumoniae(登录号：cp017343.1)、m.penetrans(登录号：ba000026.2)、m.capricolum(登录号：cp000123.1)、m.bovis(登录号：cp023663.1)、m.bovoculi(登录号：cp007154.1)、m.synoviae(登录号：cp011096.1)、m.pulmonis(登录号：al445565.1)、m.flocculare(登录号：cp007585.1)、m.arthritidis(登录号：cp001047.1)、m.hyosynoviae(登录号：nr_029183.1、jq670924.1)、m.hyopneumoniae(登录号：cp003802.1)、e.coli(登录号：cp017446.1)，通过vectornti软件进行16s-its-23s-5srdna序列比对，选择保守性较好的区域设计引物及探针，由于前八种支原体(m.arginini、m.fermentans、m.hominis、m.orale、m.hyorhinis、m.salivarium、m.pirum和acholeplamasalaidlaawii)污染比例约占支原体污染的95％，所以引物及探针的设计优先考虑这8种常见支原体，在此基础上再考虑涵盖其它支原体，同时排除大肠杆菌假阳性结果比对，部分对比序列结果见图2：本研究首次使用rpa技术，根据以上引物与探针的原则，设计多组引物与探针。利用重组酶聚合酶扩增技术进行扩增实验，通过荧光信号值的改变而判断细胞是否为支原体污染。基于上述研究，本发明第一方面提供了一种检测细胞培养中支原体污染的方法，该方法采用基于重组酶聚合酶恒温扩增法，以支原体基因组中的保守区域或特异性区域做为检测靶向区段进行检测；优选情况下以支原体的rdna做为检测靶向区段，更优选是16s-its-23s-5srdna。本发明提供的检测细胞培养中支原体的方法，其反应体系包括重组酶，聚合酶，单链dna结合蛋白，核酸酶，至少一对引物，一条探针，dntp、待检测模板、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。优选地所述重组酶选自噬菌体uvsx蛋白，大肠杆菌reca蛋白的任一种或一种以上的组合；所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合；所述单链dna结合蛋白选自大肠杆菌ssb蛋白，gp32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶iii，核酸内切酶iv或甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶的任一种或一种以上的组合；所述重组加载蛋白选自噬菌体uvsy蛋白，大肠杆菌reco或大肠杆菌recr的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合，其中所述聚乙二醇选自peg1450，peg3000，peg8000，peg10000，peg14000，peg20000，peg25000，peg30000，peg35000或peg40000；所述能量系统选自atp或atp，磷酸肌酸，肌酸激酶的组合；盐离子选自tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合；所述探针为荧光染料标记的探针，荧光染料可以为syto-13，syto-82，fam，fitc,sybrgreeni，syto-13，syto-82，vic，hex，joe，tamra，tet，cy3，rox，texas-red，或cy5。本发明提供的检测细胞培养中支原体的方法，所述引物至少包括两条，分别结合于支原体rdna待扩增区域的上游和下游，引物的长度为15-45核苷酸碱基，优选为28-35核苷酸碱基，引物与所有种类的待检测支原体的rdna的一个连续区段有至少80％的序列相似性(如，至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％)；3’末端最后一个碱基对扩增反应至关重要，因此至少一条引物3’末端一个碱基与待检测支原体的核酸序列完全一致，而与大肠杆菌同源区段一个碱基不一致，引物可以进行化学修饰以提高tm值，进而提高引物与靶序列结合的特异性，所述化学修饰优选为pna，lna或bna的任一种或一种以上的组合；所述探针长度为35-55个核苷酸碱基，优选地42-50个碱基，探针中位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物优选为thf，在thf的两侧分别为两个t碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3‘-末端通过封闭基团进行封闭。进一步优选地，所述引物选自如下组合：组合一：上游引物1：5’-accacccggtaaggctaaatactaaccagac-3’上游引物2：5’-aggaccatctcctaaggctaaatactacttgg-3’上游引物3：5’-caaaccattgggtaagcctaaatactagtcag-3’下游引物1：5’-cacccattaacgggctctgactaattgtaa-3’下游引物2：5’-cacacattaatgggctctgacacgttgtag-3’组合二：上游引物：5’-cacctcgatgtcgrctcatctcatcctcga-3’下游引物1：5’-ctaggaacagctcttctcaatcttcctacggg-3’下游引物2：5’-gtagctctcatcaatattccaacgcccacat-3’下游引物3：5’-ctagaagcaaagctcttcaatcttcctgtggg-3’组合三：上游引物1：5’-aatttgaagatacgcggagaaccttacccac-3’上游引物2：5’-tggtggagcatgttgcttaattcgacggtaca-3’上游引物3：5’-aggcttagaaataagttcggaggctaacagatg-3’下游引物1：5’-acgtgtgttgccccactcgtaagaggcatgatgat-3’下游引物2：5’-tttgcagccctagacataaggggcatgatgat-3’或组合四：上游引物1：5’-ctgtaccattttgaataagtgacgactaactat-3’上游引物2：5’-cggtacctgattagaaagcaacggctaactat-3’上游引物3：5’-cggtaccctgtcagaaagcgatggctaactat-3’下游引物1：5’-ctacagacgctttacgcccaataatttcgga-3’下游引物2：5’-ctacgcaccctttacgcccagtaaatccgga-3’上述检测细胞培养中支原体的方法，反应温度为25-45℃，优选为37-42℃，更优选为37℃；反应时间为15-60分钟，优选为15-30分钟。本发明另一方面提供了上述引物和探针在制备细胞培养中支原体检测试剂中的应用。本发明再一方面提供了一种检测细胞培养中支原体的试剂盒，包括重组酶，聚合酶，单链dna结合蛋白，核酸酶，至少一对引物，一条探针，dntp、待检测模板、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。其中，所述重组酶选自噬菌体uvsx蛋白，大肠杆菌reca蛋白的任一种或一种以上的组合；所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合；所述单链dna结合蛋白选自大肠杆菌ssb蛋白，gp32蛋白的任一种或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶iii，核酸内切酶iv或甲酰胺嘧啶-dna糖基化酶的任一种或一种以上的组合；所述重组加载蛋白选自噬菌体uvsy蛋白，大肠杆菌reco或大肠杆菌recr的任一种或一种以上的组合；所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合，其中所述聚乙二醇选自peg1450，peg3000，peg8000，peg10000，peg14000，peg20000，peg25000，peg30000，peg35000或peg40000；所述能量系统选自atp或atp，磷酸肌酸，肌酸激酶的组合；盐离子选自tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合；所述探针为荧光染料标记的探针，荧光染料可以为fam，sybrgreen，syto-13，syto-82，cy-3或cy-5；所述引物至少包括两条，分别结合于支原体rdna待扩增区域的上游和下游，引物的长度为15-45核苷酸碱基，优选为28-35核苷酸碱基，引物与所有种类的待检测支原体的rdna的一个连续区段有至少80％的序列相似性；3’末端最后一个碱基对扩增反应至关重要，因此至少一条引物3’末端一个碱基与待检测支原体的核酸序列完全一致，而与大肠杆菌同源区段一个碱基不一致；所述探针长度为35-55个核苷酸碱基，优选地42-50个碱基，探针中位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物优选为thf，在thf的两侧分别为两个t碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3‘末端通过封闭基团进行封闭，优选地所述引物选自如下任意一种组合；组合一：上游引物1：5’-accacccggtaaggctaaatactaaccagac-3’上游引物2：5’-aggaccatctcctaaggctaaatactacttgg-3’上游引物3：5’-caaaccattgggtaagcctaaatactagtcag-3’下游引物1：5’-cacccattaacgggctctgactaattgtaa-3’下游引物2：5’-cacacattaatgggctctgacacgttgtag-3’组合二：上游引物：5’-cacctcgatgtcgrctcatctcatcctcga-3’下游引物1：5’-ctaggaacagctcttctcaatcttcctacggg-3’下游引物2：5’-gtagctctcatcaatattccaacgcccacat-3’下游引物3：5’-ctagaagcaaagctcttcaatcttcctgtggg-3’组合三：上游引物1：5’-aatttgaagatacgcggagaaccttacccac-3’上游引物2：5’-tggtggagcatgttgcttaattcgacggtaca-3’上游引物3：5’-aggcttagaaataagttcggaggctaacagatg-3’下游引物1：5’-acgtgtgttgccccactcgtaagaggcatgatgat-3’下游引物2：5’-tttgcagccctagacataaggggcatgatgat-3’或组合四：上游引物1：5’-ctgtaccattttgaataagtgacgactaactat-3’上游引物2：5’-cggtacctgattagaaagcaacggctaactat-3’上游引物3：5’-cggtaccctgtcagaaagcgatggctaactat-3’下游引物1：5’-ctacagacgctttacgcccaataatttcgga-3’下游引物2：5’-ctacgcaccctttacgcccagtaaatccgga-3’待测试的细胞株处理如下：选择95株细胞培养株作为待筛选样本库，分别用移液器取200ul的细胞培养上清，移至1.5ml新的无菌离心管中，95℃煮沸5min，-20℃保存备用。阳性样本的筛选：参照takarapcrmycoplasmadetectionset(6601takara)试剂盒产品说明进行两轮pcr反应检测支原体，并筛选出阳性株，两轮pcr反应参照试剂盒说明书进行，条件如下：94℃30sec,1cycle；94℃30sec、55℃2min、72℃1min，30cycles。第一轮pcr反应加入1ul处理后的细胞上清做为模板，第二轮pcr反应加入第一轮pcr反应产物0.5ul。为了防止污染，在第一轮pcr反应结束后，pcr反应产物-20℃冻存10min后再解冻加模板，最终从95株细胞培养株中筛选出共计37株阳性样本。根据说明，takarapcrmycoplasmadetectionset试剂盒主要能检出培养细胞中至少11种支原体(m.fermentans,m.hyorhinis,m.arginini,m.orale,m.salivarium,m.hominis,m.pulmonis,m.arthritidis,m.neurolyticum,m.hyopneumoniae,m.capricolum)以及脲原体(ureaplasma)属中的1种(u.urealyticum)。为了确认37株阳性样本中支原体污染种类，分别对扩增pcr产物片段回收后进行sanger测序，将测序得到的序列在ncbi上进行blast比对，最终确定37株阳性样本中共有5个种类的支原体污染，分别是m.arginini、m.fermentans、m.hominis、m.hyorhinis、m.salivarium。然后从每个种类的支原体污染的阳性样本中分别挑选出具有代表性的细胞，其细胞编号分别是f81、jurkat、kato-iii、cho-k1、bhk21，并挑选一株未污染阴性细胞kb。另外，针对实施案例中的引物区段，分别合成了常见4种污染支原体acholeplamasalaidlaawii、ureaplasmaurealyticum、m.orale、m.pirum及spiroplasmacitri、m.capricolum、m.genitalium、m.pneumoniae、m.penetrans5种支原体16s和23srdna序列的质粒作为阳性dna对照品，供后续实验检测。利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法扩增反应体系进行扩增，至少能检测出包括上述23种在内的细胞支原体污染，在某些实施案例中，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(分子量20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶600ng/ul大肠杆菌ssb蛋白150ng/ul噬菌体uvsx蛋白25ng/ul噬菌体uvsy蛋白20ng/ulklenow聚合酶大片段(exo-)50ng/ul核酸外切酶iii450umdntp250um每条上游引物250um每条下游引物120um每条荧光探针上述处理后细胞上清作为扩增模板，2ul扩增温度为37℃，反应30min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。重组酶聚合酶扩增技术不需要复杂的样品dna前处理过程，不需要模板的热变性，反应在较低的恒定温度条件下完成，反应敏感度高，特异性强，上机检测30min内即可出结果。反应通过荧光数值判读，省去了pcr产物电泳验证的过程，避免了气溶胶污染。本发明的有益效果：本发明以各种属支原体中相对保守且含有多个拷贝的rdna为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了细胞中污染的支原体的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。与pcr检测方法相比，本发明的方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qpcr相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。附图说明图1为支原体进化树。图2为各种支原体序列及大肠杆菌序列比对示意图。图3为不同细胞支原体重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法检测结果。1.cho-k12.bhk213.f814.jurkat5.kato-iii6.kb7.e.coli8.ddh2o。图4为不同细胞支原体qpcr检测结果。1.cho-k12.bhk213.f814.jurkat5.kato-iii6.kb7.e.coli8.ddh2o。图5为重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法灵敏度测试结果。1.cho细胞处理原液2.cho细胞处理原液稀释10倍3.cho细胞处理原液稀释100倍4.cho细胞处理原液稀释1000倍5.ddh2o图6为重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法灵敏度测试结果。1.cho细胞处理原液稀释300倍2.cho细胞处理原液稀释600倍3.cho细胞处理原液稀释900倍4.ddh2o图7为qpcr灵敏度测试结果。1.cho细胞处理原液2.cho细胞处理原液稀释10倍3.cho细胞处理原液稀释100倍4.cho细胞处理原液稀释300倍5.cho细胞处理原液稀释600倍6.cho细胞处理原液稀释900倍7.cho细胞处理原液稀释1000倍8.ddh2o图8为qpcr灵敏度测试溶解曲线结果图9为重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶iv)方法灵敏度测试结果。cho细胞处理原液300倍2.cho细胞处理原液稀释600倍3.cho细胞处理原液稀释900倍4.ddh2o图10-13各种支原体序列及大肠杆菌序列比对示意图。以下将通过具体实施方式对本发明的内容进行详细说明。然而应当理解，具体实施例仅用于说明本发明，并不能理解为对本发明的保护范围的限制。基于本发明公开的技术手段，利用本领域公知常识和惯用手段进行的各种常规的替换、变更等都属于本发明的范围。具体实施方式实施例一选择上述筛选及通过质粒合成得到的23种支原体为检测目标，上游三条引物序列分别是：5’-accacccggtaaggctaaatactaaccagac-3’(seqidno.1)能扩增出m.bovis、m.bovoculi、m.fermentans、m.synoviae、m.pulmonis、m.flocculare、m.hyorhinis、m.hominis、m.arginini、m.arthritidis、m.hyosynoviae、m.orale、m.salivarium、m.hyopneumoniae、spiroplasmacitri共15种支原体；5’-aggaccatctcctaaggctaaatactacttgg-3’(seqidno.2)能扩增出acholeplamasalaidlaawii；5’-caaaccattgggtaagcctaaatactagtcag-3’(seqidno.3)能扩增出m.gallisepticum、m.pirum、m.pneumoniae、m.penetrans、m.genitalium、ureaplasmaurealyticum、m.capricolum共7种支原体。下游两条引物序列分别是：5’-cacccattaacgggctctgactaattgtaa-3’(seqidno.4)能扩增出m.bovis、m.bovoculi、m.fermentans、m.synoviae、m.pulmonis、m.flocculare、m.hyorhinis、m.hominis、m.arginini、m.arthritidis、m.hyosynoviae、m.orale、m.salivarium、m.hyopneumoniae、acholeplamasalaidlaawii、m.capricolum、ureaplasmaurealyticum、spiroplasmacitri共18种支原体；5’-cacacattaatgggctctgacacgttgtag-3’(seqidno.5)能扩增出m.gallisepticum、m.pirum、m.genitalium、m.pneumoniae、m.penetrans共5种支原体；探针序列是：ctatttcactcccmtccckgggttcttt(fam-dt)ca(thf)c(bhq1-dt)ttccctcacggtact(c3-spacer)。利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法扩增反应体系进行扩增，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(分子量20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶600ng/ul大肠杆菌ssb蛋白150ng/ul噬菌体uvsx蛋白25ng/ul噬菌体uvsy蛋白20ng/ulklenow聚合酶大片段(exo-)50ng/ul核酸外切酶iii450umdntp250um每条上游引物250um每条下游引物120um每条荧光探针扩增温度为37℃，反应30min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。检测上述6种细胞(f81、cho-k1、jurkat、kato-iii、bhk21、kb)、合成的阳性质粒、大肠杆菌及ddh2o。样本处理：取200ul细胞培养液，95℃煮沸5min取上清备用。检测结果除了细胞kb、大肠杆菌及ddh2o结果为阴性外，其余检测结果均为阳性(见图3)；随后选取处理后的cho细胞上清，用tebuffer进行10、100、1000倍的梯度稀释，测试重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法的灵敏度，稀释1000倍的细胞上清扩增曲线很弱，为了确认其灵敏度，对细胞上清进行300、600、900倍的梯度稀释，经过检测最终确认其灵敏度能检测稀释900倍处理后的细胞上清(见图5、6)，灵敏度完全能达到应用需求。同时，对上述6种细胞(f81、cho-k1、jurkat、kato-iii、bhk21、kb)、大肠杆菌及ddh2o进行qpcr(sybrgreen)检测，qpcr支原体引物按照mollakazemiha等人[28,69-70]文献上的序列进行合成，序列如下：f:gtggggaggaaayaggattagar:ggcatgatgatttgacgtcrt，qpcr反应条件：95℃2min；45cycles：95℃15s，52℃20s，72℃20s，融解曲线：95℃15s，65℃60s，95℃15s。用abi7500荧光仪器进行检测。样本处理同上，最终qpcr检测结果同重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法结果一致(见图4),除细胞kb、大肠杆菌及ddh2o结果呈现阴性外，其余均为阳性。随后选取上述处理后的cho细胞上清，进行灵敏度检测，最终结果显示qpcr能检测出处理后的cho细胞上清稀释900倍的支原体(见图7、8)，同重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法的灵敏度相同。实施例二选取实施例一中设计的引物及探针序列，进行重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶iv)方法版本扩增测试，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶400ng/ul大肠杆菌reca蛋白200ng/ul大肠杆菌ssb蛋白60ng/ul大肠杆菌reco蛋白40ng/ul大肠杆菌recr蛋白60ng/ul大肠杆菌recf蛋白8units枯草芽孢杆菌dna聚合酶i50ng/ul核酸内切酶iv450umdntp250um每条上游引物250um每条下游引物120nm荧光探针扩增温度为42℃，反应30min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。检测上述6种细胞(f81、cho-k1、jurkat、kato-iii、bhk21、kb)、大肠杆菌及ddh2o。样本处理：取200ul细胞上清，95℃煮沸5min取上清备用。检测结果与qpcr、重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法结果一致，除了细胞kb、大肠杆菌及ddh2o结果为阴性外，其余检测结果均为阳性；随后选取处理后不同稀释倍数的cho细胞上清，测试重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶iv)方法的灵敏度，最终能检测到稀释900倍的细胞上清(见图9),虽然灵敏度与重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法基本相同，但起峰时间平均要比重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法晚2-3min。实施例三所有引物及探针的设计优先考虑8种常见支原体(m.arginini、m.fermentans、m.hominis、m.orale、m.hyorhinis、m.salivarium、m.pirum和acholeplamasalaidlaawii)，在此基础上再考虑涵盖其它支原体，同时要排除大肠杆菌的干扰，比对结果见图10：探针及引物序列如下：上游引物序列：5’-cacctcgatgtcgrctcatctcatcctcga-3’(seqidno6)，能扩增所有23种支原体；下游三条引物序列分别是：5’-ctaggaacagctcttctcaatcttcctacggg-3’(seqidno7)，能扩增出m.gallisepticum、m.pirum、m.pneumoniae、m.penetrans、m.capricolum、ureaplasmaurealyticum共6种支原体；5’-gtagctctcatcaatattccaacgcccacat-3’(seqidno8)，能扩增出m.bovis、m.bovoculi、m.fermentans、m.synoviae、m.pulmonis、m.flocculare、m.hyorhinis、m.hominis、m.arginini、m.arthritidis、m.hyosynoviae、m.orale、m.salivarium、m.hyopneumoniae、acholeplamasalaidlaawii、spiroplasmacitri共16种支原体；5’-ctagaagcaaagctcttcaatcttcctgtggg-3’(seqidno9)，是能扩增出m.genitalium；探针序列分别是：ttcgcccattaaagcggtacgcgagctgggtt(fam-dt)a(thf)aacg(bhq1-dt)cgtgagacagtt(c3-spacer)、ttcgccgattaaagagatacgtgagttgggtt(fam-dt)a(thf)accg(bhq1-dt)cgtgagacaggt(c3-spacer)。利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法扩增反应体系进行扩增，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(分子量20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶400ng/ul大肠杆菌reca蛋白200ng/ul大肠杆菌ssb蛋白60ng/ul大肠杆菌reco蛋白40ng/ul大肠杆菌recr蛋白60ng/ul大肠杆菌recf蛋白8unitsklenow聚合酶大片段(exo-)50ng/ul核酸外切酶iii450umdntp420um上游引物250um每条下游引物80um每条荧光探针扩增温度为37℃，反应30min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。检测上述6种细胞(f81、cho-k1、jurkat、kato-iii、bhk21、kb)、大肠杆菌及ddh2o。样本处理：取200ul细胞培养液，95℃煮沸5min取上清备用。检测结果除了细胞kb、大肠杆菌及ddh2o结果为阴性外，其余检测结果均为阳性。实施例四所有引物及探针的设计优先考虑这8种常见支原体，在此基础上再考虑涵盖其它支原体，同时要排除大肠杆菌的干扰，比对结果见图11-12：上游三条引物序列分别是：5’-aatttgaagatacgcggagaaccttacccac-3’(seqidno10)，能扩增出m.bovis、m.bovoculi、m.fermentans、m.synoviae、m.pulmonis、m.flocculare、m.hyorhinis、m.hominis、m.arginini、m.arthritidis、m.hyosynoviae、m.orale、m.salivarium、m.hyopneumoniae共14种支原体；5’-tggtggagcatgttgcttaattcgacggtaca-3’(seqidno11)，能扩增出m.genitalium、m.gallisepticum、m.pirum、m.pneumoniae、m.penetrans、ureaplasmaurealyticum、spiroplasmacitri、m.capricolum共8种支原体；5’-aggcttagaaataagttcggaggctaacagatg-3’(seqidno12)，能扩增出acholeplamasalaidlaawii支原体；下游两条引物序列分别是：5’-acgtgtgttgccccactcgtaagaggcatgatgat-3’(seqidno13)能扩增出m.genitalium、m.gallisepticum、m.pirum、m.pneumoniae、m.penetrans、m.capricolum、ureaplasmaurealyticum、spiroplasmacitri、acholeplamasalaidlaawii共9种支原体；5’-tttgcagccctagacataaggggcatgatgat-3’(seqidno14)能扩增出m.bovis、m.bovoculi、m.fermentans、m.synoviae、m.pulmonis、m.flocculare、m.hyorhinis、m.hominis、m.arginini、m.arthritidis、m.hyosynoviae、m.orale、m.salivarium、m.hyopneumoniae共14种支原体；探针序列是：cagatggtgcatggttgtcgtcagctcgtg(fam-dt)c(thf)(bhq1-dt)gagatgtttggtca(c3-spacer)。利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法扩增反应体系进行扩增，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(分子量20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶600ng/ul噬菌体gp32蛋白150ng/ul噬菌体uvsx蛋白25ng/ul噬菌体uvsy蛋白20ng/ulklenow聚合酶大片段(exo-)50ng/ul核酸外切酶iii450umdntp250um每条上游引物250um每条下游引物120um荧光探针扩增温度为37℃，反应20min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。检测上述6种细胞(f81、cho-k1、jurkat、kato-iii、bhk21、kb)、大肠杆菌及ddh2o。样本处理：取200ul细胞培养液，95℃煮沸5min取上清备用。检测结果除了细胞kb、大肠杆菌及ddh2o结果为阴性外，其余检测结果均为阳性。实施例五所有引物及探针的设计优先考虑这8种常见支原体，在此基础上再考虑涵盖其它支原体，同时要排除大肠杆菌的干扰，比对结果见图13：上游三条引物序列分别是：5’-ctgtaccattttgaataagtgacgactaactat-3’(seqidno15)、5’-cggtacctgattagaaagcaacggctaactat-3’(seqidno16)、5’-cggtaccctgtcagaaagcgatggctaactat-3’(seqidno17)，上游3条引物能扩增出所有23种支原体；下游两条引物序列分别是：5’-ctacagacgctttacgcccaataatttcgga-3’(seqidno18)、5’-ctacgcaccctttacgcccagtaaatccgga-3’(seqidno19)，下游两条引物能扩增出所有23种支原体；探针序列是：ggctaactatgtgccagcagccgcggtaa(fam-dt)a(thf)a(bhq1-dt)aggkggcgagcgttatc(c3-spacer)。利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法扩增反应体系进行扩增，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(分子量20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶600ng/ul噬菌体gp32蛋白150ng/ul噬菌体uvsx蛋白25ng/ul噬菌体uvsy蛋白20ng/ulklenow聚合酶大片段(exo-)50ng/ul核酸外切酶iii450umdntp250um每条上游引物250um每条下游引物120um荧光探针扩增温度为37℃，反应30min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。检测上述6种细胞(f81、cho-k1、jurkat、kato-iii、bhk21、kb)、大肠杆菌及ddh2o。样本处理：取200ul细胞培养液，95℃煮沸5min取上清备用。检测结果除了细胞kb、大肠杆菌及ntc结果为阴性外，其余检测结果均为阳性。实施例六选取实施例五中设计的引物及探针序列，进行重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法扩增测试，构建扩增反应体系如下：30mm三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0100mm醋酸钾14mm醋酸镁3mm二硫苏糖醇5％聚乙二醇(分子量20000)3mmatp30mm磷酸肌酸100ng/ul肌酸激酶600ng/ul噬菌体gp32蛋白150ng/ul噬菌体uvsx蛋白25ng/ul噬菌体uvsy蛋白20ng/ulklenow聚合酶大片段(exo-)50ng/ul核酸外切酶iii450umdntp250um每条上游引物250um每条下游引物120um荧光探针模板10ng基因组dna扩增温度为37℃，反应30min，用molarrayma-1610恒温荧光扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。检测口腔支原体阳性质粒、ddh2o及部分需排除的生物。样本处理：抽提需排除生物的基因组，测定其浓度，再用tebuffer将其分别稀释至10ng/ul备用。通过重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶iii)方法检测，最终结果除了口腔支原体阳性质粒结果为阳性外，其余均为阴性(见下表)。参考文献[1]cordcuphoff,hansgdrexler.detectionofmycoplasmacontaminationincellcultures[j].molecularbiology,2014,28.4.1-28.4.14.[2]drexler,h.g.anduphoff,c.c.mycoplasmacontaminationofcellcultures:incidence,sources,effects,detection,elimination,prevention[j].cytotechnol,2002,39:23-38.[3]uphoff,c.c.anddrexler,h.g.preventionofmycoplasmacontaminationinleukemialy-mphomacelllines[j].humancell,2001,14:244-247.[4]wangh,kangf,jelfsp,jamesg,gilbertgl.simultaneousdetectionandidentificationofcommoncellculturecontaminantandpathogenicmollicutesstrainbyreverselineblothybridization[j].applenvironmicrobiol,2004,70:1483–1486.[5]sungh,kangsh,baeyj,hongjt,chungybetal.pcr-baseddetectionofmycoplasmaspecies[j].microbiol,2006,44:42–49.[6]l.young,j.sung,g.stacey,andj.r.masters.detectionofmycoplasmaincellcultures[j].natureprotocols,2010,5,(5):929–934.[7]tabatabaei-qomir,sheykh-hasanm,fazaelyhetal.developmentofapcrassaytodetectmycoplasmacontaminationincordbloodhematopoieticstemcells[j].iranjmicrobiol,2014,6(4):281-4.[8]nikfarjaml,farzanehp.preventionanddetectionofmycoplasmacontaminationincellculture[j].cell,2012,13:203–212.[9]vahidmollakazemiha,shahinbonakdar,amiramanzadehetal.real-timepcrassayissuperiortoothermethodsforthedetectionofmycoplasmacontaminationinthecelllinesofthenationalcellbankofiran[j].cytotechnology,2016,68(4):1063–1080.[10]kong,f,james,g,gordon,s,zelynski,a,andgilbert,g.l.species-pcrforofcommoncontaminantmollicutesincellculture[j].applenvironmicrobiol,2001,67:3195-3200.[11]m.hannahdegeling,caseya,maguire,m,sarahs.bovenberg.sensitiveassayformycoplasmadetectioninmammaliancellculture[j].analyticalchemistry,2012,84:4227-4232.[12]loensk,urisd,goossensh,ievenm.moleculardiagnosisofmycoplasmapneumoniaerespiratorytractinfections[j].clinmicrobiol2003,41:4915–4923.[13]mardassibb,mohamadrb,gueririi,boughattaass,mlikb.duplexpcrtodifferentiatebetweenmycoplasmasynoviaeandmycoplasmagallisepticumonthebasisofconservedspecies-specificsequencesoftheirhemagglutiningenes[j].clinmicrobiol,2005,43:948–958.[14]masterjr.falsecelllines:theproblemandasolution[j].cytotechnology,2002,39:69-74.[15]ryanja.understandingandmanagingcellculturecontamination[j].cornitechnicalbulletinlifescience,1994,15:11-12.[16]mertenow.viruscontaminationsofcellcultures:abiotechnologicalview[j].cytotechnology,2002,39:91-116.[17]falagan-lotschp,lopests,ferreiran,balthazarn,monteiroam,borojevicr,granjeirojm.performanceofpcr-basedandbioluminescentassaysformycoplasmadetection[j].microbiolmethods,2015,118:31-6.[18]uphoff,c.c.anddrexler,h.g.contaminationofcellcultures,mycoplasmaintheencyclopediaofindustrialbiotechnology[j].m.flickinge,2010,5:3611-3630.[19]brinzeudgt,feierv,herbeckr,cristodorp,paunescum,condora,etal.microbialandfungalcontaminationofkeratinocyteandcellcultures[j].expmedsurgres2008,15:123-8.[20]国家药典委员会.通则98,3301支原体检查法《中华人民共和国药典》[m].2015年版北京：中国医药科技出版社，2015：518-519.[21]chengh-s,shenc-w,wangs-retal.effectofstorageconditionsondetectionofmycoplasmainbiopharmaceuticalproducts[j].celldevbiolanim,2007,43:113–119.[22]europeandirectorateforthequalityofmedicines(edqm):mycoplasma；ineuropeanpharmacopoeia,7thed.councilofeurope,strasbourg,2007,section2.6.7.[23]rabinsonlb,yogevd,naoty.molecularbiologyandpathogenicityofmycoplasmas[j].microbiolmolbiolrev,1998,62:1094-1156.[24]frasercm,gocaynejd,whgeo,etal.theminimalgenecomplementofmycoplasmagenitalium[j].science,1995,270:397-403.[25]himmelreichr，hilberth，plagensh,etal.completesequenceanalysisofthegenomeofthebacteriummycoplasmapneumoniae[j].nuclacidsres,1996,24,4420-4449.[26]c.c.uphoandh.g.drexler.mycoplasmacontaminationofcellcultures,inencyclopediaofindustrialbiotechnology:bioprocess,bioseparation[j].celltechnology,2010,3611-3630.[27]peredeltchoukm,wilsondavids,bhattacharyab,volokhovd,chizhikovv.detectionofmycoplasmacontaminationincellsubstratesusingreversetranscriptionpcrassays[j].applmicrobiol,2011,110:54–60.[28]mollakazemihav,amanzadeha,memarnejadianaetal.sensitivityofbiochemicaltestincomparisonwithothermethodsforthedetectionofmycoplasmacontaminationinhumanandanimalcelllinesstoredinthenationalcellbankofiran[j].cytotechnology,2014,66(5):861-73.[29]volokhovdv,grahamlj,brorsonka,chizhikov.ve.mycoplasmatestingofcellsubstratesandbiologics:reviewofalternativenon-microbiologicaltechniques[j].molcellprobes,2011,25(2-3):69-77.[30]claudiazylberberg,juanmanuelrodriguez,andresclementehernandoinsua,ricardoariellopez.detectionofmycoplasmaincellculturesandcellculturederivedbiologicals[p].us2015/0111207a1,2015-04-23.[31]remyteyssou,francoisepoutiers,colettesaillard.detectionofmollicutecontaminationincellculturesby16srdnaamplification[j].molecularandcellularprobes,1993,7:209-216.[32]quirkjt,kupinskijm,diciocciora.detectionofmycoplasmaribosomaldnasequencesinovariantumorsbynestedpcr[j].gynecoloncol2001；83:560–562.[33]tangj,hum,lees,robinra.polymersechainreactionbasedmethodfordetectingmycoplasmaacholeplasmacontaminantsincellculture[j].microbiolmethods2000,39:121–126.[34]kongf,jamesg,gordons,zelynskia,gilbertgl.species-specificpcrforidentificationofcommoncontaminantmollicutesincellculture[j].applenvironmicrobiol,2001；67:3195–3200.[35]stormerm,vollmert,henrichb,kleesiekk,dreierj.broad-rangereal-timepcrassayfortherapididentificationofcell-linecontaminantsandclinicallyimportantmollicutespecies[j].medmicrobiol,2009,299(4):291-300.[36]lorenzons,manso-silvánl,thiaucourtf.specificreal-timepcrassaysforthedetectionandquantificationofmycoplasmamycoidessubsp.mycoidesscandmycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae[j].molcellprobes,2008,22(5-6):324-8.[37]gerlier,blanquier,jean,grosjean.methodforuniversaldetectionandquantificationofmycoplasma(mollicutes)16srdnabyquantitativepolymerasechainreactionamplifyinga1.5kilobasefragment[p].wo2017/178587a1,2017-09-19.[38]ursid,dirvenk,loensketal.detectionofmycoplasmapneumoniaeinrespiratorysamplesbyreal-timepcrusinganinhibitioncontrol[j].microbiolmethods,2003,55(1):149-53.[39]claudialitterst,luisa.ugozzoli.rapiddetectionnofmycoplasmacontaminationincellcuturesamples[p].us:us2011/0104686a1,2011-05-05.[40]notomit,okayamah,masubuchih,yonekawat,watanabek,aminon,haset.loop-mediatedisothermalamplicationofdna[j].nucleicacidsres,2000,18:12-63.[41]saitor,misaway,moriyak,koikek,ubukatak,okamuran.developmentandevaluationofaloop-mediatedisothermalamplificationassayforrapiddetectionofmycoplasmapneumoniae[j].medmicrobiol,2005,54(11):1037-41.[42]hey,zhangn-z,zhaop.sensitiveandrapiddetectionofmycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniaebyloop-mediatedisothermalamplification[j].africanjournalofbiotechnology,2014,13:2113-2118.[43]jonasm.winchell.methodsandcompositionsforisothermalamplificationanddetectionofmycoplasmapneumoniae[p].us2016/0237479a1,2016-8-18.[44]曹振.一种检测广谱支原体的lamp引物组、试剂盒及其应用[p].cn105755161a,2016,7,13.[45]matsuzakii,iguchih,mikasay.novelapplicationofloop-mediatedisothermalamplificationforrapiddetectionofgenetranslocation[j].actahistochemcytochem,2017,50(6):169-176.[46]nagaminek,haset,notomit.acceleratedreactionbyloop-mediatedisothermalamplificationusingloopprimers[j].molcellprobes,2002,16(3):223-229.[47]zyrinanv,zheleznayala,dvoretskyev,vasilievvd,chernova,matvienkoni.bspd61dnanickasestronglystimulatestemplate-independtsynthesisofnon-palindromicrepetitivednabybstdnapoly-merase[j].biolchem,2007,388(4):367-372.[48]hillj,beriwals,chandrai,paulvk,kapila,singht.aloop-mediatedisothermalassayforrapiddetectionofcommonstrainsofescherichiacoli[j].clinmicrobiol2008,46:2800-2804.[49]lauyl,meganathanp,sonaimuthup,thiruvengadamg.sensitive,andrapiddiagnosisofactivetoxoplasmosisbyaloop-mediatedisothermalmethodusingbloodsamplesfrompatients[j].clinmicrobiol,2010,48:3698-3702.[50]koizumin,nakajimac,harunarit,tanikawat.anewloop-mediatedisothermalmethodforrapid,simple,andsensitivedetectionofleptospiraspp.inurine[j].clinmicrobiol,2012,50:2072-2074.[51]mariottie,mirabellip,dinotor,fortunatog,salvatoref.rapiddetectionofmycoplasmaincontinuouscelllinesusingaselectivebiochemicaltest[j].leukres,2008,32:323-326.[52]gandelmano,jacksonr,kiddleg,tisil.loop-mediatedacceleratedbystemprimers[j].mol.sci,2011,12:9108-9124.[53]hosakan,ndembin,ishizakia,kageyamas,numazakik,ichimurah.rapiddetectionofhumanvirustype1groupmbyareversetranscription-loop-mediatedisothermalassay[j].virol.methods,2009,157:195-199.[54]omayboroda,ikatakis,ckosullivan.multiplexedisothermalnucleicacidamplification[j].analyticalbiochemistry,2018,545:20-30.[55]olafpiepenburg,colinh.williams,derekl.stemple.dnadetectionusingrecombinationproteins[j].plosbiol,2006,4(7):e204.[56]ahmeda,vanderlindenh,hartskeerlra.developmentofarecombinasepolymeraseassayforthedetectionofpathogenicleptospira[j].intjenvironrespublichealth,2014,11:4953e64.[57]daherrk,stewartg,boissinotm,bergeronmg.isothermalrecombinasepolymeraseassayappliedtothedetectionofgroupbstreptococciinvaginal/analsamples[j].clinchem,2014,60:660e6.[58]hill-cawthornega,hudsonlo,elghanymf,piepenburgo,nairm,dodgsona,etal.recombinationsinstaphylococcalcassettechromosomemecelementscompromisethemoleculardetectionofmethicillinresistanceinstaphylococcusaureus[j].plosone,2014,9:e101419.[59]davids.boyle,daraa.lehman,lorrainelillis.rapiddetectionofhiv-1proviraldnaforearlyinfantdiagnosisusingrecombinasepolymerasembio,2013,4(2):e00135-13.[60]eulerm,wangy,ottop,tomasoh,escuderor,andap,hufertft,weidmannm.recombinasepolymeraseassayforrapiddetectionoffrancisellatularensis[j].clinmicrobiol,2012,50:2234-2238.[61]eulerm,wangy,nentwicho,piepenburgo,hufertft,weidmannm.recombinasepolymerase-cationassayforrapiddetectionofriftvalleyfevervirus[j].clinvirol2012,54:308-312.[62]krolovk,frolovaj,tudorano.sensitiveandrapiddetectionofchlamydiatrachomatisbyrecombinasepolymeraseamplificationdirectlyfromurinesamples[j].moldiagn,2014,16:127-135.[63]liljandera,yum,obriene,hellermliljandera,yum,obriene,hellerm.afield-applicablerecombinasepolymeraseamplificationassayforrapiddetectionofmycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae[j].jclinmicrobiol,2015,53(9):2810-5.[64]patilkn,singhp,muniyappak.dnabinding,coprotease,andstrandexchangeactivitiesofmycobacterialrecaproteins:implicationsforfunctionaldiversityamongrecanucleoproteinfilaments[j].biochemistry,2011,50:300e11.[65]abdelwaheda,el-deeba,el-tholothm,abdelkaderh,ahmeda,hassans,etal.aportablereversetranscriptionrecombinasepolymeraseassayforrapiddetectionoffoot-and-mouthdiseasevirus[j].plosone,2013,8:e71642.[66]ranak.daher,galestewart,mauriceboissinot.influenceofsequencemismatchesonthespecificityofrecombinasepolymeraseamplificationtechnology[j].molcellprobes,2014,11:005.[67]fengchen,yuezhao,chunhaifan,yongxizhao.mismatchextensionofdnapolymerasesandhigh-accuracysnpdiagnosticsbygoldnanoparticles-improvedisothermalamplification[j].anal.chem,2015,87(17):8718-23.[68]wangy,zhangz,ramanann.theactinomycetethermobisporabisporacontainstwodistincttypesoftranscriptionallyactive16srrnagenes[j].bacteriology,1997,179(10):3270-3276.[69]mollakazemihav,azaris,amanzadeha,bonakdars,moghadamms,anbouhimh,malekis,ahmadin,mousavit,shokrgozarma.efficiencyofplasmocintmonvariousmammaliancelllinesinfectedbymollicutesincomparisonwithcommonlyusedantibioticsincellculture:alocalexperience[j].cytotechnology,2011,63:609–620.[70]mollakazemihav,shokrgozarma,arabestanimr,moghadamms,azaris,malekis,amanzadeha,tehranimj,shokrif.pcr-baseddetectionanderadicationofmycoplasmalinfectionsfromvariousmammaliancelllines:alocalexperience[j].cytotechnology,2009,61:117–124.序列表<110>苏州先达基因科技有限公司<120>支原体污染检测方法及应用<130>2018001<160>19<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220>当前第1页12当前第1页12