本发明涉及工业生物技术领域，具体涉及的是一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法。
背景技术：
目前毕赤酵母G/GMH1发酵过程中营养盐采用一次性补加，容易导致盐浓度过高或过低，不利于菌体生长，无法实时在线监测营养盐变化情况，无法对补加营养盐及时调控。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法，通过活细胞电极实时监控培养基的营养盐浓度，使毕赤酵母G/GMH1处于最优的生产状态，从而提高菌体表达葡萄糖氧化酶的表达效率。
本发明采取的技术方案是：
一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，其特征是，包括发酵罐、营养盐补料瓶和控制柜，所述发酵罐中注有毕赤酵母发酵液，所述营养盐补料瓶通过补料泵连通至发酵罐，所述发酵罐内设置活细胞电极，所述控制柜连接所述补料泵和活细胞电极，所述控制柜根据活细胞电极传回的电导率数据控制所述补料泵补料。
进一步，所述控制柜控制补料泵补料的过程是通过控制补料泵的转速实现的。
进一步，所述发酵罐中设置搅拌器。
一种应用上述的重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置进行毕赤酵母培养的方法，其特征是，在所述发酵罐中对毕赤酵母培养基进行培养，包括如下步骤：
(1)甘油批培养，通气比控制在5vvm，搅拌转速控制在700rpm；
(2)甘油流加培养，通过控制甘油补加速率，使DO维持在5％-10％之间，当菌浓达到诱导的菌浓后，停止补加甘油，待DO再次上升，饥饿培养1h；
(3)甲醇诱导，诱导前期缓慢流加甲醇，待菌体生长稳定后，流加麦芽糖溶液和纯甲醇，同时通过所述发酵液装置的控制营养盐的流加，使发酵液的电导率为8或10ms/cm。
进一步，在甲醇诱导阶段，控制一定比例的流速，使流加入的麦芽糖摩尔数和甲醇的摩尔数比为1/20。
进一步，甘油批培养阶段和甘油流加培养阶段温度设定在30℃，甲醇诱导阶段温度设定在22℃。
进一步，发酵罐中培养液的PH值为5.5。
进一步，所述的成分包括40g/L甘油，18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。
进一步，甘油流加阶段的甘油补料为50％重量体积比的甘油，使用时补加1.2％的PTM1；甲醇诱导阶段的甲醇补料为100％甲醇，使用时补加1.2％的PTM1。
进一步，补料的营养盐包括18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。
本发明的有益效果是：
优化了毕赤酵母G/GMH1发酵培养工艺，实现在线反馈控制营养盐流加，提高了细胞代谢活性，促进了产物的表达。与对照组相比，维持电导率(营养盐浓度)为10ms/cm时，菌浓DCW和葡萄糖氧化酶的表达量分别提高了23.5％和24.1％。
附图说明
附图1是本发明的培养装置的结构示意图；
附图2是发酵过程电导率变化曲线图；
附图3是不同电导率对菌体生长的影响曲线图；
附图4是不同电导率对GOD产量的影响曲线图；
附图5是不同电导率对单位菌体GOD的影响曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法的具体实施方式作详细说明。
参见附图1，重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置包括发酵罐1、营养盐补料瓶2和控制柜3，发酵罐1中注有毕赤酵母发酵基液，发酵罐1中设置搅拌器4，营养盐补料瓶2通过补料泵5连通至发酵罐1，发酵罐1内设置活细胞电极6，控制柜3连接补料泵5和活细胞电极6，控制柜3根据活细胞电极传6回的电导率数据控制补料泵5的转速进行补料，发酵基液的电导率是通过改变营养盐的浓度实现的。
重组毕赤酵母G/GMH1在50L反应器内发酵过程中，主要分为三个阶段：甘油批培养阶段、甘油流加培养阶段、甲醇诱导阶段；在批培养阶段，通气比控制在5vvm，搅拌转速控制在700rpm，在批培养结束后，细胞摄氧率(Oxygen Uptake Rate，OUR)，二氧化碳释放率(Carbon Dioxide Release Rate，CER)下降，溶解氧(DO)上升，开始流加甘油培养，通过控制甘油补加速率，使DO维持在5％-10％之间，当菌浓达到诱导的菌浓后，停止补加甘油，待DO再次上升，饥饿培养1h后，开始流加甲醇诱导，诱导前期缓慢流加甲醇，带菌体生长稳定后，流加1/20摩尔比的麦芽糖/甲醇混合溶液，同时，采用活细胞电极在线检测反馈营养盐的流加，使电导率维持在10ms/cm，8ms/cm的水平。整个过程控制补加氨水维持pH在5.5左右，甘油批培养阶段和甘油流加培养阶段温度设定在30℃，诱导阶段温度设定在22℃。
本发明的菌种为毕赤酵母重组菌G/GMH1，以G/GODM(GS115,Mut+,god)为出发菌株，AOX1启动子调控HAC1基因表达的重组毕赤酵母。培养基为BSM(Basal salts medium)发酵培养基，包含40g/L甘油，18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。甘油补料为50％(w/v)甘油，使用时补加1.2％的PTM1。甲醇补料为100％甲醇，使用时补加1.2％的PTM1。营养盐补料包含18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。其中微量元素PTM1(trace mineral solution)包括0.09g/L KI，6g/L CuSO4·5H2O，3g/L MnSO4·H2O，0.2g/L MoNa2O4·2H2O，0.02g/L H3BO3，20g/L ZnCl2，0.5g/L CoCl2，65g/L FeSO4·7H2O，0.2g/L生物素，5mL/L H2SO4。
在培养过程中，对菌浓的测定方法如下：
取发酵液，稀释到一定的倍数，然后在波长为600nm处时，测定OD600＝OD读数×稀释倍数n；根据测定得到的OD600和菌体干重的关系：DCW(g/L)＝0.24×OD600+1.23(R2＝0.994)，计算菌体干重(Dry cell weigh,DCW)。
对GOD测定方法如下：
发酵液处理：将发酵液在12000rpm条件下离心5min，转移发酵上清液到1.5mL的EP管中，测定GOD。
GOD酶活测定：在10mL离心管中依次加入2.5mL的0.21mM的邻联茴香胺，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U/mL的辣根过氧化物酶，37℃保温5min后，向离心管中加入V0酶液；每隔30秒记录一次OD500，此时，GOD酶活(U/mL)＝(△OD500/△t)max/7.5×V/V0×n；V为反应总体积，V0为加入粗酶体积，n为稀释倍数。
经过实验，参见附图2，在重组毕赤酵母甘油流加培养的菌体生长阶段(0h之前为甘油培养阶段电导率变化)，随着菌体的快速增长，培养基中的营养盐快速消耗，当菌体浓度达到43g/L，发酵液电导率从初始的21ms/cm降低到8ms/cm左右。为了优化营养盐补加策略，本研究根据电导率测量值反馈控制营养盐的补加速率，将电导率分别维持在10ms/cm，8ms/cm的水平，以正常不补加营养盐的工艺作为对照，考察营养盐浓度对重组菌生长和产物合成的影响。
参见附图3，维持不同的电导率对菌体生长的产生不同的影响。适当提高电导率能够提高菌体的比生长速率，延长菌体的生长时间，进而提高菌浓。对照组在108h左右菌浓不再增加；而电导率维持在10ms/cm时，菌体生长时间延长到132h，且得到最大菌浓，为108.32g/L，比对照组提高了23.5％；8ms/cm电导率条件下菌浓介于对照和10ms/cm组之间，最大菌浓为96.21g/L比对照提高了9.1％。
参见附图4，诱导0-60h，电导率对菌体表达GOD的影响不显著，60h后GOD表达量开始出现差异，电导率维持在10ms/cm时GOD表达量最高，为1485U/mL，比对照组GOD表达量提高了72.1％。而当电导率维持在8ms/cm时，GOD表达量最高为1059U/mL，比对照组提高了22.7％，这可能与适当的维持一定的营养盐浓度能够减缓AOX失活，并保持高GOD合成速率有关。
参见附图5，从不同电导率控制水平对单位菌体GOD的影响显示，诱导60h前单位菌体GOD变化情况基本一致。诱导60h后，单位菌体GOD合成变化开始出现差异，高电导率控制条件下单位菌体GOD合成速率明显高于低电导率组和对照组。高营养盐补加速率下的菌体保持较好的生长状态，细胞活性高，GOD合成能力强。而不补加营养盐的对照组60h后菌体生长减慢，细胞活性降低，进而影响了GOD的增长速率。当发酵液电导率维持在10ms/cm时，单位菌体GOD合成速率明显要高于电导率维持在8ms/cm和不进行控制的对照组。维持诱导阶段发酵液电导率在10ms/cm条件下的单位菌体GOD表达量最高为13750U/g·DCW，比维持在8ms/cm(11031U/g·DCW)和不补加营养盐的对照组(9589U/g·DCW)分别提高了24.6％和43.4％。
从以上实验结果可以发现，进入诱导期后，由于菌体的比生长速率大幅度降低，营养盐的消耗速率减缓，从而导致电导率的下降速率也减缓。从不补加营养盐的正常培养批次电导率变化趋势可以看出，当电导率低于4ms/cm时，菌体的生长速率变缓，而当电导率低于2.5ms/cm时，菌体的生长停滞(附图3)，GOD的表达量也同步呈现下降的趋势(附图4)。前期研究发现菌体的比生长速率与GOD的比合成速率呈现正相关，同时比氧消耗速率也与单位菌体的GOD合成速率呈正相关；而菌体的比生长速率除了与碳源底物的补加有关，还受到菌体生长必需的磷元素、氮元素等无机盐的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。