本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测脑中风易感性相关的snp位点的引物及检测方法。
背景技术：
：脑中风又称作脑卒中或脑血管病，是由于大脑里面的血管突然破裂出血或因血管堵塞造成大脑缺血、缺氧而引起。临床表现以突发意识障碍或口眼歪斜、半身不遂、口齿不清、认知障碍为主要特征。卒中包括缺血性卒中(短暂性脑缺血发作、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、脑栓塞)与出血性卒中(脑出血、蛛网膜下腔出血)。根据“中国心脑血管病流行病学协作研究组”发表的数据，我国卒中患者中缺血性卒中占62.4％，脑出血占27.5％，蛛网膜下腔出血占1.8％。随着我国人口老龄化和群众生活方式的改变，近年脑卒中的发病率呈显著的上升趋势。据流行病学调查资料显示：中国目前约有700万脑卒中患者，每年新发脑卒中200万人，每年死于中风的患者约达150万，平均每15秒钟就有一例新发病人，每21秒钟死一人。随着生活方式发生的巨变，心脑血管疾病迅猛攀升，其中脑血管病已经超过肿瘤和冠心病，在全国死亡、致残疾病中名列第一位，目前，发病率仍以接近每年9％的速度上升。国际间比较研究提示：中国人群脑血管病的发病率和死亡率高于国际平均水平。脑血管病以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率以及越来越高的诊治费用，给国家和社会造成巨大的经济损失，已成为严重影响我国国计民生的重要公共卫生问题，防治需求极其迫切，必需引起高度重视。通过检测与脑中风易感性相关的snp，就能够帮助脑中风易感人群了解其患脑中风的风险，提前做好预防工作，避免脑中风的发生，脑中风越早发现并及时诊治，治愈机会就越大。通过检测与脑中风易感性相关的snp位点的多态性，不仅可以从分子遗传学水平上了解细胞癌变机制，而且对脑中风的预测、预防、遗传咨询等具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测脑中风易感性相关的snp位点的引物及检测方法，其引物特异性好，检测方法准确性高，可用于脑中风的风险评估，为脑中风的疾病预防提供指导。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测脑中风易感性相关的snp位点的引物，这些引物包括位于prkch基因的rs2230500位点的引物、位于adipoq基因的rs266729位点的引物、位于adipoq基因的rs822391位点的引物以及位于adipoq基因的rs822396位点的引物；其中，rs2230500位点的引物为f：5′-actgtttgggttgaagtaag-3′(seqidno：1)和r：5′-gtctcagctctgtaagaaaag-3′(seqidno：2)；rs266729位点的引物为f：5′-gcctaatgtgacttctcttg-3′(seqidno：3)和r：5′-cctgtttttccagttcctt-3′(seqidno：4)；rs822391位点的引物为f：5′-caagtctcaggttctcctac-3′(seqidno：5)和r：5′-cccagaaatcacctcac-3′(seqidno：6)；rs822396位点的引物为f：5′-ttacaatcagagtccgttc-3′(seqidno：7)和r：5′-taaacttcctcactgcttg-3′(seqidno：8)。采用上述引物检测脑中风易感性相关的snp位点多态性的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取其基因组dna；(2)采用上述引物分别对基因组dna进行目的基因的pcr扩增，并对扩增产物进行胶回收；(3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，然后进行pcr扩增(荧光标记反应)并纯化；(4)将步骤(3)中的纯化产物在3730型全自动序列分析仪(美国appliedbiosystems公司)上样，用chromas软件对snp分型进行分析。进一步地，步骤(2)中pcr扩增体系为：dna模板含量为100-150ng，浓度为5pmol/μl的正向引物3.0μl，浓度为5pmol/μl的反向引物3.0μl，primestarmax25.0μl，用ddh2o补足体积至50μl。进一步地，步骤(2)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。进一步地，步骤(3)中pcr扩增体系为：dtcsmastermix2.5μl，浓度为5pmol/μl的反向引物1.0μl，dna模板20ng，用ddh2o补足体积至10μl。进一步地，步骤(3)中pcr扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。本发明提供的用于检测脑中风易感性相关的snp位点的引物及检测方法，具有以下有益效果：(1)本发明提供了用于检测脑中风易感基因相关位点的引物，该引物具有特异性高、准确性好的优点，实现了脑中风易感性相关的snp位点的检测，提高了检测效率。(2)本发明还提供了一种检测脑中风易感性相关的snp位点的方法，该方法为直接测序法，本检测方法简单，其检测结果也具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点，可以为脑中风的疾病预防提供指导。附图说明图1为不同受检者血液dna样品在4种不同引物下进行pcr扩增所得产物的琼脂糖凝胶电泳图；图2为rs2230500位点多态性检测的测序结果图；图3为rs266729位点多态性检测的测序结果图；图4为rs822391位点多态性检测的测序结果图；图5为rs822396位点多态性检测的测序结果图；图6为rs2230500位点多态性检测结果的荧光验证图；图7为rs266729位点多态性检测结果的荧光验证图；图8为rs822391位点多态性检测结果的荧光验证图；图9为rs822396位点多态性检测结果的荧光验证图。具体实施方式实施例1设计扩增snp位点的引物针对脑中风易感性相关的snp位点设计了大量的引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出特异性好的四对引物，包括：位于prkch基因的rs2230500位点的引物、位于adipoq基因的rs266729位点的引物、位于adipoq基因的rs822391位点的引物以及位于adipoq基因的rs822396位点的引物；其中，rs2230500位点的引物为f：5′-actgtttgggttgaagtaag-3′(seqidno：1)和r：5′-gtctcagctctgtaagaaaag-3′(seqidno：2)；rs266729位点的引物为f：5′-gcctaatgtgacttctcttg-3′(seqidno：3)和r：5′-cctgtttttccagttcctt-3′(seqidno：4)；rs822391位点的引物为f：5′-caagtctcaggttctcctac-3′(seqidno：5)和r：5′-cccagaaatcacctcac-3′(seqidno：6)；rs822396位点的引物为f：5′-ttacaatcagagtccgttc-3′(seqidno：7)和r：5′-taaacttcctcactgcttg-3′(seqidno：8)。rs2230500的rs码序列如seqidno：9所示，rs266729的rs码序列如seqidno：10所示，rs822391的rs码序列如seqidno：11所示，rs822396的rs码序列如seqidno：12所示。使用脑中风易感性相关的snp位点的引物对待测基因组dna分别进行pcr扩增，pcr扩增体系为：dna模板xμl使其含量为100-150ng，去离子水19-xμl，浓度为5pmol/μl的正向引物3.0μl，浓度为5pmol/μl的反向引物3.0μl，primerstarmax25.0μl；扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后72℃延伸5min后于4℃保存；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中，1孔为rs2230500位点的引物扩增条带(360bp)；2孔为rs266729位点的引物扩增条带(467bp)；3孔为rs822391位点的引物扩增条带(433bp)；4孔为rs822396位点的引物扩增条带(437bp)。由图1可知，目的条带清晰，无杂带，且片段大小与设计的大小一致，说明设计的引物特异性好。实施例2与脑中风易感性相关的snp位点多态性的检测(1)基因组dna的提取用edta抗凝管采集受检者外周血5ml，其基因组dna的提取方法参照血液基因组dna提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)的说明书，按说明书中的操作步骤进行提取。获得的全基因组dna使用超微量核酸蛋白分析仪(柏精biodropμlite)检测其浓度以及纯度，记录原始数据。将浓度和纯度都达到要求的dna置于-20℃冰箱保存备用。(2)目的基因的pcr扩增、电泳和胶回收pcr扩增：用上述rs2230500，rs266729，rs822391，rs822396位点的引物分别对提取的dna进行pcr扩增。反应体系为50μl，具体如表1所示，扩增程序如表2所示。pcr反应完成后，取出pcr产物4℃保存(过夜需放置-20℃冻存)。表1pcr反应体系试剂体积(μl)dnaa(100-150ng)ddh2o19-aprimerf3.0primerr3.0primerstarmax25.0total50.0表2pcr扩增程序pcr扩增结束后，取50μl扩增产物，采用2％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为电压120v，电流400ma，时间30min，电泳结果中无非特异性条带；电泳完成后在凝胶电泳图像分析仪下切取含有目的片段的凝胶，将凝胶块装入ep管中，胶回收的方法参照takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒的说明书，最后对胶回收的产物进行浓度测定，4℃保存备用。(3)标记、纯化和测序标记：取一支干净的0.2mlpcr管，依次加入：dtcsmastermix、测序引物、灭菌超纯水、模板dna，其中模板dna和灭菌超纯水的用量由上一步所测定的dna浓度决定，所添加的模板dna量为20ng，反应体系为10μl，具体如表3所示，然后进行荧光标记pcr，扩增程序见表4；表3pcr反应体系试剂体积(μl)dtcsmastermix2.5primerr1.0ddh2o6.5-b模板dnab(20ng)总计10.0表4pcr扩增程序纯化：将浓度为3mol/l，ph值为5.2的醋酸钠缓冲液、0.1mol/l，ph值为8.0的na2edta缓冲液和glycogen以体积比为2:2:1配制终止液，然后取5μl终止液加入上述荧光标记反应pcr产物中充分混匀，离心，将液体转移至一支新的1.5mlep管中，然后加入50μl预冷无水乙醇，充分混匀，放入冰箱-20℃冷冻10min后于12000r/min离心5min，弃去上清，再向ep管中加入150μl预冷70％乙醇，放入高速离心机离心，12000r/min离心2min，弃去上清，稍离心，用移液器吸干ep管内剩余的液体，打开ep管盖，室温晾干至白色沉淀变透明，再向ep管中加入25μlsls(sampleloadingsolution)溶解dna，静置8min，瞬时离心；测序：将溶解的dna加入96孔样品板孔中，加入的过程中不能产生气泡，然后再加入适量矿物油；取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液，向胶槽中加入超纯水至液体接近指示线，最后将96孔样品板、96孔缓冲液和胶槽装入abi3730测序仪进行测序。通过序列分析软件(genomelabtmabi3730(geneticanalysissystem))，将测序结果与标准序列进行比对，寻找snp位点，通过分析snp位点处碱基的类型，就可以得到snp位点的基因型。图2中2-1、2-2和2-3均为rs2230500位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为aa、ag、gg；其中aa为rs2230500位点的非易感基因型，而gg和ag为rs2230500位点的易感基因型。图3中3-1、3-2和3-3均为rs266729位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为gg、cg、cc；其中gg为rs266729位点的非易感基因型，而cg和cc为rs266729位点位点的易感基因型。图4中4-1、4-2和4-3均为rs822391位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为cc、tc、tt；其中cc为rs822391位点的非易感基因型，而tt和tc为rs822391位点的易感基因型。图5中5-1、5-2和5-3均为rs822396位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为gg、ag、aa；其中gg为rs822396位点的非易感基因型，而ag和aa为rs822396位点的易感基因型。上述测序结果图均无套峰、背景峰、杂峰、飘峰等现象，说明采用测序法检测snp位点多态性，其特异性好、准确性高。因此，检测机构可以根据上述snp位点的多态性，评估受检者患脑中风的风险，为脑中风的疾病预防提供指导。实施例3与脑中风易感性相关的snp位点多态性检测结果的验证采用荧光探针法对上述检测结果进行验证，其结果如图6-9所示。其中，图6中6-1、6-2和6-3均为rs2230500位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为aa、ag、gg；其中aa为rs2230500位点的非易感基因型，而gg和ag为rs2230500位点的易感基因型。图7中7-1、7-2和7-3均为rs266729位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为gg、cg、cc；其中gg为rs266729位点的非易感基因型，而cg和cc为rs266729位点位点的易感基因型。图8中8-1、8-2和8-3均为rs822391位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为cc、tc、tt；其中cc为rs822391位点的非易感基因型，而tt和tc为rs822391位点的易感基因型。图9中9-1、9-2和9-3均为rs822396位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为gg、ag、aa；其中gg为rs822396位点的非易感基因型，而ag和aa为rs822396位点的易感基因型。上述荧光探针法检测结果与测序法检测结果100％一致，进一步验证了采用测序法检测snp位点多态性的特异性和准确性。序列表<110>成都中创清科医学检验所有限公司<120>一种用于检测脑中风易感性相关的snp位点的引物及检测方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1actgtttgggttgaagtaag20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtctcagctctgtaagaaaag21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcctaatgtgacttctcttg20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cctgtttttccagttcctt19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caagtctcaggttctcctac20<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cccagaaatcacctcac17<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttacaatcagagtccgttc19<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8taaacttcctcactgcttg19<210>9<211>1001<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cgagtggcagaaccgatcatctgtcaaactgagttgatctttcccccacgttatactggg60ggtgagactgctcccagccaataaggtcttcttcgtgcatgggtgctccatgcttctgct120gcaatttctgacttaatgtgttcttactctttcagaaactcgtttccagatcgaccctaa180gacgacagggaaaggagagcagcaaagaaggaaatgggattggggttaattcttccaacc240gacttggtatcgacaactttgagttcatccgagtgttggggaaggggagttttgggaagg300tgagtcttggctttaactgtttgggttgaagtaagtgtgctctgtgtatggggggtgtgt360gtgtgtgtgcacgcatgcgcacatactcacatttctcatgtgccattctttcttcctgtt420gtgtgcacacaccctaagacccccaagaggactccctcatgctccctccttttgctttgc480cataggtgatgcttgcaagartaaaagaaacaggagacctctatgctgtgaaggtgctga540agaaggacgtgattctgcaggatgatgatgtggaatgcaccatgaccgagaaaaggatcc600tgtctctggcccgcaatcaccccttcctcactcagttgttctgctgctttcagacccccg660taagtatgaatcacattcactgcaccaacagcctcttttcttacagagctgagacagtaa720gatactggagatttcataaagttgagtatcagaaattttgggggatgggctcccaaggca780gggtcatatggaggtattggtgacttctgccaacctctggaggaaaaatggaagcttatg840aattcaccccttccccttgtgctgtcctggggaaggagcaccgtgagggttgtgtgtccc900aggattgaaaaggtcatcatacataaatcttctgtaggtgaagtgaaggtgaatgaaagt960tacagcagtctaagaacagagaaaatgccatgggctcattg1001<210>10<211>1001<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tattaaatagcaacagacagtaacataaaccaaaaataaataggaaaacaccataacaaa60aatcaaacagtgatataattgagagttgcttctatttctttttgttgtcttcttggttca120atcagcctgctaaactatatggaacctcattttcatgggccacttatttaagccggggga180ccttggaaagtctctcatgtctctcatctcaacggcctaatgtgacttctcttgaaatat240ttggacattagcaggaagctgaggctttacatcagatctttactttaatggtggacttga300ctttactggtagatttttaggctctgtgtggactgtggagatgatatctggggggcaggc360agacacttgccctgcctctgtctgagaaaattctgttttggatgtcttgttgaagttggt420gctggcatcctaagcccttgctggggtcgtaatttaattcatcagaatgtgtggcttgca480agaaccggctcagatcctgcscttcaaaaacaaaacatgagcgtgccaagaaagtccaag540gtgttgaatgttgccacttcaagcctaaactttctaggaacacctaagtgggtggcagct600tccagttctccaggctgcttctaggccagagctgggttccacaagagacagaataggcat660atatatgcttaaggaactggaaaaacaggctctctctctctcacaaacacacacacacac720ataccaaggtagctgtcaaaatgttatccgaaattttggaaccaaaaaatcttgaaagat780ggtattccaatatcacattttatgtaagttttctattatattagattcaaattacgattc840gaggccacaagctttaagaattcagggcctttttaacttgccaagccccacaccactcca900ggaacttccccacaccccagttctcagaattcatgtgcaaggtctttcctaaatccaggg960tccaggtcagagagtggaggatgtgctctatttcttacctg1001<210>11<211>1001<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ggtgcccgctaccacgcctgactaatttttgtatttttggtagagacgggatttcaccat60gttgtccaggctggtctgaaactcctgacatcaggtaatccacccacctcagcctcccaa120agtgctgggattacaggcatgagccactgcgcccggcccattttgacttttaaaaatggg180agtttgatataattcaatccagtggttgaattagctagcatcgttccctctccaagtctc240aggttctcctacacgttagagtcaaaagcagggctatgggaagattaagtaaaataaatt300ttgaaaatgccttatgaaaattacactccaaagaactcgcgccagtgtcagtgttctcat360gttcctcatctcacatgatcacatttcgcggattaggaagctgagtctgagaagctccgt420gtagtgctttttcggaggcaccgtgatgtgatggaaggctcactcgttaggaagtcagaa480cagagtctctgagggatcatytccttaatctgtcagtttcctcatctctgaagttgggct540catttccttccttcatggagttattgtaaagatgaagataaataacgtgtaaaatctagc600atgggaactggcttctataaggttctaataagtgcattcctactccttcccctcagcctt660cccatttgtaaaagcaaggcaggggtgaggtgatttctggggctccttttggctctgaca720tttgaggattttgtatacttttttttttttgagacagagtcttgctctgtcacccaggtt780ggagtgcagctcaatgcaaattccgcctcccaggctcaagcaattcttatgtctcagcct840cctgagtacctgggattacaggcaggcaccaccacccccagctaatttttttgtattttc900agtagagacggggttttgccatattggccaggctggtcttgaactcctgacttcatgtga960cccacccatctcagcctcccaaagtgctgagatgacaggtg1001<210>12<211>1001<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gctgacatgggtgagggttccttggagtatcattttcatgtggcattttcaaaacttatt60ttacctaatcttcccaaagccctgcttttgactctaatgtgtctcctgagacttggagag120cgcaagatgctagcgacagagcaagactccatctccagataaataaataagtaaaataaa180aaagaacacaaataattttgaaaatttttttgaaaattaggcacgtttgcactgaccttc240aattgttattaattgctggtttcccacccagaattaagttggaatgcaactttcttttac300aatcagagtccgttcttggtcttggaaacttctgaggctcctgtgctaatcacactcttg360tatttttggcacctctaccccgtgccactgtcatggaacccaggctgatcgcacctatta420gtggagaaatctgtccataatactgaagtttggggacaaacagtgttcccttagggtagg480agaaagagatctttatttttracaaagggggaggagccagaaaactccagagacccctga540gtttgccctctctccaaggtttggggtaagccccccgtcaccctttatctctggggcttt600cacatattctggattctctcctcctgtttcccagcagaaaaggatggagcctcacagatt660cttcccatttctggagaaaaacatgcatggagctcaaagttcttctcaggagttttattg720ccaaagccataataagaaagggtggaggtgacaagcagtgaggaagtttaaagatgcatg780aaatctgtaaagtctcagaacaagaattctcctaaaatgcaaaaggggctttgctggtct840ccccttggcttctcatgtagctcacctcttttttcttatcttgagactagtcaaacctaa900gctgtttctcattttatttccagaagctattgagaacactctcctgaattcttcaaattc960agtagagggcgacaaatgtacatataaatgatggtagtggg1001当前第1页12