本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种c5orf42基因突变体及其应用。
背景技术：
joubert综合征(joubertsyndrome，mim#213300)是一种罕见的神经系统疾病，主要表现为小脑蚓部发育不全或缺如，于1969年由joubert等首次报道，发病率估计约为1:100000。joubert综合征最典型的特点为小脑蚓部发育不全或缺如，临床表现主要包括阵发性呼吸过度或者呼吸暂停、共济失调、发育迟缓、眼球运动障碍、认知缺陷，部分患者常伴发视网膜缺损或视网膜发育不良、多囊肾和多指(趾)症，肝纤维囊肿等。
joubert综合征通常由mri结合临床表现进行确诊。1992年，saraiva和baraitser在总结了101个病例以后提出了joubert综合征的诊断标准：(1)小脑蚓部发育不全；(2)肌张力低；(3)发育迟缓；(4)异常呼吸或者异常眼运动。1997年，maria等又将影像学的“磨牙征”等加入了js的诊断标准中。joubert综合征主要的影像学特征性表现有：小脑蚓部部分或完全缺如、小脑上脚增粗，表现出“磨牙征”(molartoothsign，mts，又称“臼齿征”)“中线裂”或“蝙蝠翼”，其中“磨牙征”是joubert综合征诊断的最重要特征。目前临床上通常把所有具有“磨牙征”的疾病统称为joubert综合征及其相关疾病(joubertsyndromerelateddisorders，jsrd)。
joubert综合征是一种遗传性疾病。大部分为散发，其主要的遗传方式是常染色体隐性遗传，仅在少部分因ofd1基因突变导致的患者中表现为x连锁隐性遗传。目前已经报道joubert综合征的致病基因有超过30个，分别为：inpp5e、tmem216、ahi1、nphp1、cep290、tmem67、rpgrip1l、arl13b、cc2d2a、ofd1、ttc21b、kif7、tctn1、tmem237、cep41、tmem138、c5orf42、tctn3、znf423、tmem231、cspp1、pde6d、kiaa0586、tctn2、cep104、kiaa0556、b9d1、mks1、tmem107、armc9、cep290、sufu、pibf1以及kiaa0753。其中，以c5orf42、cc2d2a、cep290、ahi1以及tmem67基因的突变最为常见。
c5orf42是第17个被发现的joubert综合征致病基因。c5orf42是位于5号染色体的第42个开放阅读框的基因，它包含52个外显子区域，编码一个包含有3198个氨基酸的蛋白质。但是目前已知的大部分c5orf42突变都分布coiled-coil结构域和跨膜结构域以外的区域。蛋白质组学的分析发现，c5orf42广泛的表达于包括脑在内的人体各种组织中，而在其他脊椎动物中也有c5orf42同源蛋白的存在。2013年，lopez等在对口面趾综合征vi型(oral-facial-digitalsyndrometypevi，ofdvi)家系的遗传机制研究中发现11个家系中有9个家系为c5orf42突变导致的，因此认为c5orf42是ofdvi的主要致病基因；随后romani等的研究发现，c5orf42在单纯型的joubert综合征中具有8.9％的突变率；在致死性畸形-meckel综合征的基因筛查过程中也发现有c5orf42突变的存在。截止目前，已经有超过60个不同的c5orf42突变位点被发现，但中国人群中的c5orf42基因突变只有两个突变位点的报告，分别为c.3676c>t,p.arg1226x以及c.8310_8311inst。
sanger测序是临床分子诊断的金标准，但是检测效率低、成本高，传统的酶切、杂交、taqman探针、dhplc和hrm等方法针对突变热点进行检测，但检测通量较低。近几年微阵列芯片技术的发展可以同时针对数百个突变位点进行高通量检测，极大提高了诊断效率，降低了检测成本。但微阵列芯片技术存在检测周期长、检测成本相对较高，对除点突变之外的其他突变类型的检出能力有限的缺点。采用靶向测序方法(即目标区域测序)有目的地研究基因组特定区域，是一种大规模的多重pcr扩增方法，能够实现几千甚至上万重引物对进行快速扩增目标区域检测低频率或稀有突变。joubert综合征是一种罕见的颅脑先天性发育畸形，目前发现的joubert综合征致病基因致病位点多位于编码区，并且没有集中的突变热点。本发明采用目标区域测序的方法，对c5orf42基因在内的joubert候选基因组合进行高通量测序，结合sanger方法进行验证检测，确定已知突变和发现新的致病突变，确定了一种与joubert综合征相关的基因突变体。
技术实现要素：
在一种实施方式中，本发明提供一种分离的编码c5orf42基因突变体的核酸，所述核酸具有以下14个位点突变中的至少一个：c.9368delc、c.9177dupa、c.8679_8680del、c.8377_8378del、c.7702_7703inscttt、c.7242dupa、c.6515_6522del、c.4598dupa、c.4541delt、c.650g>a、c.230_233delctgg、c.3g>a、c.217+1g>a和c.-47-3c>a；优选地，所述核酸具有上述14个位点突变中的至少二个。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒包括检测c5orf42基因的以下14个突变位点中的至少一个的试剂：c.9368delc、c.9177dupa、c.8679_8680del、c.8377_8378del、c.7702_7703inscttt、c.7242dupa、c.6515_6522del、c.4598dupa、c.4541delt、c.650g>a、c.230_233delctgg、c.3g>a、c.217+1g>a和c.-47-3c>a。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒是sanger测序试剂盒、高通量测序试剂盒、基因芯片试剂盒或pcr试剂盒。
在一种实施方式中，提供一种joubert综合征治疗剂，所述治疗剂是抑制c5orf42基因的以下14个位点突变中至少一个的作用剂：c.9368delc、c.9177dupa、c.8679_8680del、c.8377_8378del、c.7702_7703inscttt、c.7242dupa、c.6515_6522del、c.4598dupa、c.4541delt、c.650g>a、c.230_233delctgg、c.3g>a、c.217+1g>a和c.-47-3c>a。
在一种实施方式中，提供一种joubert综合征治疗剂，所述治疗剂是抑制c5orf42基因的以下14个位点突变中至少二个的作用剂：c.9368delc、c.9177dupa、c.8679_8680del、c.8377_8378del、c.7702_7703inscttt、c.7242dupa、c.6515_6522del、c.4598dupa、c.4541delt、c.650g>a、c.230_233delctgg、c.3g>a、c.217+1g>a和c.-47-3c>a。
在一种实施方式中，提供一种筛选患joubert综合征的生物样品的方法，其包括以下步骤：从所述生物样品提取c5orf42基因核酸样本；确定所述核酸样本c5orf42基因的核酸序列；所述核酸样本c5orf42基因的核酸序列与正常人c5orf42基因相比，具有以下14个位点突变中的至少二个的杂合子或者至少一个的纯合子：c.9368delc、c.9177dupa、c.8679_8680del、c.8377_8378del、c.7702_7703inscttt、c.7242dupa、c.6515_6522del、c.4598dupa、c.4541delt、c.650g>a、c.230_233delctgg、c.3g>a、c.217+1g>a和c.-47-3c>a；所述点突变存在是所述生物样品患joubert综合征的指示，任选地，所述生物样品为选自人体血液，任选地，所述核酸样本为全基因组dna。
在一种实施方式中，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括：从所述生物样品提取rna样本，优选所述rna样本为mrna；以及基于所述rna样本，通过反转录反应，获得cdna样本，所述cdna样本构成所述核酸样本。
在一种实施方式中，本发明提供一种筛选患joubert综合征的生物样品的系统，所述系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与正常人c5orf42基因相比，是否具有以下14个位点突变中的至少二个的杂合子或者至少一个的纯合子：c.9368delc、c.9177dupa、c.8679_8680del、c.8377_8378del、c.7702_7703inscttt、c.7242dupa、c.6515_6522del、c.4598dupa、c.4541delt、c.650g>a、c.230_233delctgg、c.3g>a、c.217+1g>a和c.-47-3c>a，判断所述生物样品是否患joubert综合征。
在一种方式中，本发明提供一种构建体，所述构建体包含上述分离的编码c5orf42基因突变体的核酸。
在一种方式中，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞是通过上述的构建体转化受体细胞而获得的。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为c5orf42：nm_023073.3:c.9368delcp.pro3123fs的位点测序图；
图2为c5orf42：nm_023073.3:c.9177dupap.ala3060serfsx23的位点测序图；
图3为c5orf42：nm_023073.3:c5orf42c.650g>ap.trp217x的位点测序图-家系类型1；
图4为c5orf42：nm_023073.3:c5orf42c.650g>ap.trp217x的位点测序图-家系类型2；
图5为c5orf42：nm_023073.3:c.8679_8680delp.glu2895aspfsx18的位点测序图；
图6为c5orf42：nm_023073.3:c.8377_8378delp.glu2793fs的位点测序图；
图7为c5orf42：nm_023073.3:c.7702_7703insctttp.leu2568fs的位点测序图；
图8为c5orf42：nm_023073.3:c.7242dupap.thr2415fs的位点测序图；
图9为c5orf42：nm_023073.3:c.6515_6522delp.lys2172thrfsx36的位点测序图；
图10为c5orf42：nm_023073.3:c.4598dupap.asn1533lysfsx11的位点测序图；
图11为c5orf42：nm_023073.3:c.4541deltp.met1514serfsx24的位点测序图；
图12为c5orf42：nm_023073.3:c.230_233delctggp.ala77glyfsx3的位点测序图；
图13为c5orf42：nm_023073.3:c.217+1g>a的位点测序图；
图14为c5orf42：nm_023073.3:c.3g>a的位点测序图；
图15为c5orf42：nm_023073.3:c.-47-3c>a的位点测序图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例一.候选基因c5orf42测序
1.样本收集：在知情同意的前提下，采集医院明确诊断为joubert综合征的患者及其家属的外周血做为实验材料。
2.外周血dna的提取和纯化
采用qiaampdnabloodminikit试剂盒(qiagen，德国)的操作说明从全血中提取基因组dna，利用qubit2.0(invitrogen，美国)进行定量。
a)向1.5ml离心管加入20ul蛋白酶k
b)加入200ul全血样本。
c)加入200ulbufferal，漩涡振荡15sec。
d)56℃水浴10min。
e)快速离心，避免管盖上留有溶液。
f)加入200ul无水乙醇，漩涡振荡15sec，快速离心。
g)将所有溶液转移到qiaamp离心柱中，10000rpm离心2min，将离心柱转入新的收集管。
h)向离心柱上加入500ulbufferaw1，10000rpm离心2min，将离心柱转入新的收集管。
i)向离心柱上加入500ulbufferaw2，10000rpm离心5min，弃收集管。将离心柱转入新的收集管，10000rpm离心3min。
j)将离心柱放入新的1.5ml离心管，向离心柱上加入200ulbufferae，室温放置5min，10000rpm离心2min。
k)弃去离心柱，盖上管盖。保存于-20度冰箱。
l)dna定量：通常能得到20-50ng/μldna，纯度(紫外260od：280od)在1.8-2.0范围内。
3.测序
(1)文库构建
采用ionampliseqtm自定义panel，对人的c5orf42基因进行高效富集，然后在iontorrentpgm平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获实验采用ionampliseqtmlibrarykit建库试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照最新的经过优化的实验流程进行操作。
实验基本流程：将基因组dna采用磁珠法(ampurebeads，invitrogen，美国)纯化后，采用ionampliseqpanel扩增目的基因，在片段两端分别连接barcode和测序引物，经pcr线性扩增后进行文库质检，合格即可进行上机测序。
(2)文库质检
文库构建完成后，使用agilent2100对文库的长度进行检测，符合预期后，稀释文库至15ng/ml。
(3)上机测序
库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行iontorrentpgm平台测序。
4.数据分析与处理
测序产出的大量数据利用ionreportertm软件经初步质量控制后，进行数据评估以确保数据的可信度，主要包括数据量、重复率、捕获效率、测序深度及覆盖率等指标，继而以grch37.1/hg19基因组为参考序列进行比对,对变异检测和注释，主要针对与人类基因组对比后获得的各类变异，主要包括snp和indel。针对性地分析主要突变对蛋白结构及功能影响的注释，常用到的软件包括sift、polyphen2和mutationtaster。
5.分析结果
经过数据筛选、深度加工和生物信息学序列比对，最终分析发现患病者c5orf42基因具有14个突变位点，具体情况见表1。
表1.c5orf42基因突变检测结果
实施例二.sanger测序进行突变位点的验证
1.pcr扩增
pcr引物设计：引物由华大六合科技有限公司合成，共设计11对引物，如表2所示。
表2.引物序列
pcr反应体系如表3所示，25μl体系的配制：
表3.反应体系
pcr反应退火温度为58℃。
2.测序：扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由abi3730xl完成sanger测序。
3.测序结果：使用chromas软件查看sanger测序峰图，用seqman软件比对sanger测序结果。sanger测序结果表明，患者的c5orf42基因上携带不同的突变，存在以下几种形式：a.父母均为某一突变的杂合子，患者是该突变的纯合子，见图1，sanger测序结果与候选基因测序结果相符合；b.当父母只是其中一个杂合突变的携带者，患者的一个突变位点来自于母亲，另一突变位点来自于父亲。两个杂合突变同时发生时致病，突变信息见图2-图15。sanger测序结果与候选基因测序结果相符合。c.根据a和b，可以预测，至少一个突变的纯合子和至少一个其他突变的杂合子同时发生时致病，以及至少二个突变杂合子同时发生时致病。
实施例三.基因突变检测试剂盒的制作
突变位点试剂盒的制作和操作流程基于sanger测序技术。试剂盒含有实施例二中扩增c5orf42基因两个突变位点的特异性引物，该试剂盒还可以包括pcr反应常用的试剂，如taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断joubert综合征，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。