HPV分型检测用的核酸组合物及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是涉及一种hpv分型检测用的核酸组合物及应用，尤其是涉及一种hpv分型检测用的核酸组合物、检测芯片及其制作方法、检测试剂盒及其使用方法。

背景技术：

人乳头瘤病毒(hpv)是一种含有约8000个碱基对的双链环状dna病毒，有100多种类型，是一类致瘤病毒。根据致瘤程度分为高危型hpv和低危型hpv，其中至少14种可引起癌症(又称高风险类型，即高危型)，常在宫颈瘤中检出，严重威胁广大妇女的身体健康，其长期感染是导致宫颈癌变的重要原因。长期感染是一个渐进的过程，早期感染清除能减少或避免癌变，也能对症治疗，特别是在目前发病率日益增高且呈年轻化的趋势的情况下，hpv的筛选、预防、诊断和治疗是一个急需解决的问题。

世界卫生组织早在2015年3月发布的实况报导第380号《人乳头状瘤病毒和宫颈癌》中就指出“人乳头状瘤病毒(16型和18型)引起70％的宫颈癌和宫颈癌癌前病变，估计2012年有44.5万个新发病例，占全球新发病例的84％。2012年，约有27万妇女死于宫颈癌，其中85％以上发生在低收入和中等收入国家。”美国癌症学会2016年报告“美国女性子宫宫颈癌以7％发病率排行第四，死亡率排行第五”。我国也早将宫颈癌筛查列入癌症筛查与早期发现项目，在全国开展普查筛选。

早期对宫颈癌的筛查与诊断，主要采用形态学的检查，例如巴氏涂片、液基细胞学(lct、tct)、组织蜡片等。感染了hpv病毒的上皮细胞可出现形态学上的改变，但也会有部分出现未确定意义的非典型鳞状上皮细胞(ascuss)，从而出现假阴性结果，需要结合其它检测或分子生物学技术检测hpv病毒感染。

分子生物学技术检测包含几种常用的方法：核酸分子杂交如southern杂交、northern杂交、原位杂交等，灵敏度较高，但操作步骤较复杂，要求较高，临床应用较少；核酸扩增pcr荧光检测，灵敏度较高，操作简单，但高灵敏度容易导致假阳性，仪器设备价格较高，难以普及；杂交捕获法，通过特定探针直接检测样本病毒，不用经过pcr扩增，但检测仅能显示是否感染hpv不能进行分型；基因芯片法，在pcr扩增的基础上加入探针芯片法，可同时检测多个分型，成本较低，易于推广，但是步骤繁琐，检测背景深，容易出现假阳或假阴，技术需要加以改进；微流控全自动核酸检测系统，结合多种检测技术可实现多种分子诊断实验室功能，全自动，全封闭，多检测，但多功能结合，其具体的灵敏度、准确率有待实验验证。

目前市面上的hpv检测产品种类多，大多采用pcr荧光或杂交与其他技术结合的方式，但不同技术间的结合还存在灵敏度、背景、效率的问题，难以对hpv进行准确分型。因此研制和开发一种能同时检测多个分型hpv病毒的检测产品显得尤为重要。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种hpv分型检测用的核酸组合物、检测芯片及其制作方法、检测试剂盒及其使用方法。

一种hpv分型检测用的核酸组合物，包括pcr扩增引物和检测探针；

所述pcr扩增引物包括用于扩增hpv病毒l1区的变异区域的病毒pcr扩增引物对；

所述检测探针包括14个序列或互补序列中含有分别如seqidno:1～14所示序列的病毒寡核苷酸探针。

在其中一个实施例中，所述病毒pcr扩增引物对的序列分别如seqidno:15和seqidno:16所示。

在其中一个实施例中，所述pcr扩增引物还包括对照pcr扩增引物对，所述检测探针还包括对照寡核苷酸探针；

所述对照pcr扩增引物对用于扩增人管家基因的一序列片段；

所述对照寡核苷酸探针能够与由所述对照pcr扩增引物对扩增得到的产物形成的其中一寡核苷酸链互补配对。

在其中一个实施例中，所述检测探针的5’端还含有序列如seqidno:20所示的连接序列片段。

一种hpv分型检测用的检测芯片，包括芯板、载体以及上述任一实施例所述的hpv分型检测用的核酸组合物中的检测探针；所述芯板具有芯槽，所述载体位于所述芯槽内，所述检测探针固定于所述载体上，且不同的检测探针固定于所述载体的不同区域。

在其中一个实施例中，所述检测探针与所述载体的表面经过共价结合的方式连接。

一种hpv分型检测用的检测芯片的制作方法，包括如下步骤：

在检测探针的5’端以及载体的表面分别修饰形成第一连接基团和第二连接基团，所述第一连接基团能够与所述第二连接基团共价结合；

将5’端标记有所述第一连接基团的检测探针与表面修饰有所述第二连接基团的载体进行共价连接反应，使所述检测探针固定于所述载体的表面；

将固定有所述检测探针的载体固定在芯板的芯槽中。

一种hpv分型检测用的试剂盒，包括pcr扩增引物和上述任一实施例所述的hpv分型检测用的检测芯片，所述pcr扩增引物的下游引物的5’端连接有连接物。

在其中一个实施例中，所述hpv分型检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、pcr扩增试剂、杂交试剂、杂交洗涤试剂、酶杂交试剂、酶洗涤试剂以及显色试剂中的至少一种。

一种上述任一实施例所述的hpv分型检测用的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

配制pcr反应液，并进行pcr扩增反应；

将pcr扩增反应的产物与所述检测芯片上的检测探针进行杂交反应；

对杂交反应后的产物进行显色反应。

上述hpv分型检测用的核酸组合物针对hpv病毒l1区的变异区域设计病毒pcr扩增引物对，因而，一次pcr扩增就能将含有14个高危型hpv的变异区域的目标片段扩增出来，再针对各hpv类型设计特异性的病毒寡核苷酸探针，一次扩增就能检测14个hpv亚型，整个检测过程简单，高效。

尤其是，本发明的病毒寡核苷酸探针在5’端连接有序列为“atacaaa”(seqidno:20)的连接序列片段，通过在该连接序列片段的5’端修饰氨基等第一连接基团，以与具有第二连接基团的载体进行共价连接反应，将病毒寡核苷酸探针固定在载体上。该连接序列片段的长度及序列结构是研究人员经过创造性的实验设计获取的，以在保证与载体稳定连接的同时，减少后续杂交反应位阻，提高杂交效率。

附图说明

图1为一具体实例中检测芯片的俯视示意图；

图2为图1中载体上不同检测探针的分布示意图，其中g代表gapdh，表示对照组，其他数字代表hpv亚型；

图3为使用图1所示的检测芯片进行阴性样本检测的鲁米诺发光的检测结果，图中亮点表示形成可见光点；

图4为使用图1所示的检测芯片进行hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52以及hpv56的阳性样本的鲁米诺发光的检测结果，图中亮点表示形成可见光点；

图5为使用图1所示的检测芯片进行hpv58、hpv59、hpv66以及hpv68的阳性样本的鲁米诺发光的检测结果，图中亮点表示形成可见光点。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种hpv分型检测用的核酸组合物，其包括pcr扩增引物和检测探针。pcr扩增引物包括用于扩增hpv病毒l1区的变异区域的病毒pcr扩增引物对。在一个具体的实例中，病毒pcr扩增引物对的序列分别如seqidno:15(5’-gcmcagggwcataayaatgg-3’)和seqidno:16(5’-gaaahataaactgtaaatcataytc-3’)所示。检测探针包括14个病毒寡核苷酸探针，14个病毒寡核苷酸探针的序列或互补序列中含有分别如seqidno:1～14所示序列。

进一步，pcr扩增引物还包括对照pcr扩增引物对，检测探针还包括对照寡核苷酸探针，以用于控制检测结果的正确与否。对照pcr扩增引物对用于扩增人管家基因的一序列片段；对照寡核苷酸探针能够与由对照pcr扩增引物对扩增得到的产物形成的其中一寡核苷酸链互补配对。在一个具体的实例中，对照pcr扩增引物对用于扩增一段人的管家基因gapdh序列片段，其序列可以如seqidno:17(5’-ggctctccagaacatcatc-3’)和seqidno:18(5’-tgcttcaccaccttcttg-3’)所示；对照寡核苷酸探针的序列或其互补序列中含有如seqidno:19所示序列。

上述检测探针及其检测的hpv亚型的详细信息如下：

本发明设计的pcr扩增引物能够在hpv病毒的l1区的变异区域扩增出单一片段，一次扩增即可。各检测探针之间具有良好的特异性，且tm值(解链温度)相近，最高不超过5℃，能够在室温(14℃～40℃)下与扩增的hpv病毒的寡核苷酸链互补配对。

如图1和图2所示，本发明还提供了一种hpv分型检测用的检测芯片10，其包括芯板100、载体200以及上述hpv分型检测用的核酸组合物中的检测探针300。芯板100具有芯槽102，载体200位于芯槽102内。检测探针300固定于载体200上，且不同的检测探针300固定于载体200的不同区域，如可以以图2所示的矩阵的形式分布。

芯板100作为杂交容器，其可以是含有芯槽102的塑胶条。在一个具体的实例中，芯板100上设有10个芯槽102，每个芯槽102的尺寸约为1cm*1cm*cm。进一步，芯板100或芯槽102具有定位标识，以便于识别不同区域的检测探针300。定位标识可以是标记符号或者是某一可以起到辨识作用的结构等，如芯槽102一角的延伸结构等。

载体200用于固定检测探针300。载体200的尺寸与芯槽102的尺寸相适配，如可以是1cm*1cm的方形结构，用于固定在芯槽102的底部，如可以通过uv胶粘接的方式连接等，注意胶水不要过量粘到载体200的上表面。

在一个具体的实例中，载体200可以是一种以硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料制作成型，如苏州偲聚生物材料有限公司的改性硅胶膜等，其表面具有基团立体数量多，特异性结合效率高，易洗涤非特异反应，无背景、显色或发光清洗的优点。

检测探针300与载体200的表面可以经过共价结合的方式连接。如在一个实例中，检测探针300的5’端连接有第一连接基团，如氨基，载体200的表面修饰有第二连接基团，如羧基，第二连接基团在载体200的表面形成微阵列。第一连接基团与第二连接基团可以共价反应连接，具体地，载体经过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)carbodiimide，edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)的反应激活表面的羧基(-cooh)，在缓冲液的平衡下与检测探针3005’端修饰的氨基(-nh2)结合，而将检测探针300固定在其表面。

进一步，在一个实例中，检测探针300的5’端具有连接序列片段，其序列如seqidno:20所示(atacaaa)，第一连接基团标记在连接序列片段的5’端，通过设置连接序列片段，可以起到延长臂的作用，以增长整个检测探针300的长度，增加杂交空间，减少杂交位阻，便于后于与目标寡核苷酸链互补配对，提高杂交的效率和效果。

基于上述构思，本发明还提供了一种hpv分型检测用的检测芯片的制作方法，其包括如下步骤：

在检测探针的5’端以及载体的表面分别修饰形成第一连接基团和第二连接基团，第一连接基团能够与第二连接基团共价结合；

将5’端标记有第一连接基团的检测探针与表面修饰有第二连接基团的载体进行共价连接反应，使检测探针固定于载体的表面；

将固定有检测探针的载体固定在芯板的芯槽中。

本发明的hpv分型检测用的检测芯片在制作时，硅胶膜等载体先进行活化处理，如浸泡于edc和nhs的活化液中，30min后取出用去离子水冲洗2次，晾干，马上用于点样；检测探针也需要进行活化处理，如使用ph值8.0的等体积碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液进行活化稀释；待检测探针与载体反应结束之后，优选还进行uv光照射5分钟，以加强第一连接基团与第二连接基团的连接键。

进一步，本发明还提供了一种hpv分型检测用的试剂盒，其包括上述pcr扩增引物和上述hpv分型检测用的检测芯片10。

pcr扩增引物的5’端连接有连接物。在一个具体的实例中，连接物可以是生物素、亲和素或链霉亲和素等，当连接物是生物素时，用于显色反应的物质可以用亲和素或链霉亲和素标记；当连接物是亲和素或链霉亲和素标记时，用于显色反应的物质可以用生物素标记。

在一个具体的实例中，hpv分型检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、pcr扩增试剂、杂交试剂、杂交洗涤试剂、酶杂交试剂、酶洗涤试剂以及显色试剂中的至少一种。

更具体地，核酸提取试剂可以是但不限于强碱试剂，如tris碱加树脂制成的提取试剂，包括tris碱溶液和树脂chelex-100，能裂解细胞，吸附蛋白质细胞碎片杂质，相应地，核酸提取时可选用细胞强碱热破碎法进行细胞破碎，后续离心收集上清。

pcr扩增试剂可使用但不限于takala的taqhotstar系列的dna扩增试剂，其对于简拼引物具有高扩增效率，低非特异扩增，对于本发明的简拼引物扩增多分型hpv病毒具有良好的扩增效果，有利于后续检测。

杂交试剂可以是但不限于40％的甲酰胺溶液。杂交液有利于核酸配对碱基的结合，使hpvpcr产物与对应的探针特异结合。

杂交洗涤试剂可以是但不限于35％的甲酰胺溶液。杂交洗涤试剂稍低的浓度有利于洗脱去结合的不牢靠的非特异结合，提高特异准确性，减少非特异背景。

酶杂交试剂可以是但补选于相应浓度的标记有链霉亲和素的辣根过氧化物酶。

酶洗涤试剂可以是但不限于nah2po4、na2hpo4磷酸盐缓冲液。在缓冲液的平衡下，链霉亲和素与扩增产物引物端的生物素特异结合，形成载体-检测探针-pcr产物(引物的5’端标记生物素)-链霉亲和素-辣根过氧化物酶的复合物。

显色试剂含有a液氧化剂过氧化脲和b液为鲁米诺试剂。鲁米诺试剂在酶作用发出肉眼不可见的荧光，通过ccd技术可将短波长荧光曝光成可见光点。b液还可以是沉淀型底物tmb。在氧化剂的催化下，酶将底物tmb分解为肉眼可见颜色的化学物质，以供结果鉴别。

基于上述构思，本发明进一步还提供了一种hpv分型检测用的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

配制pcr反应液，并进行pcr扩增反应；

将pcr扩增反应的产物与检测芯片上的检测探针进行杂交反应；

对杂交反应后的产物进行显色反应。

本发明在常温下即可对变性后的单链pcr扩增的产物进行杂交及洗涤，链霉亲和素-辣根过氧化物酶(hrp-sa酶)的链接及洗涤，底物显色反应。本发明提供的hpv分型检测用的核酸组合物、检测芯片及试剂盒等产品整合了多个分子检测技术，能够能简单、快速、灵敏和准确的检测出结果。得到的结果可以作为非直接诊断目的的中间结果为hpv的分型、诊断和研究提供帮助。

以下结合具体实施例对本发明的hpv分型检测用的核酸组合物及相关应用进行进一步详细的说明。

本实施例利用聚合酶链反应(pcr)和核酸杂交技术，以生物素标记特异性引物，对hpv病毒dna的l1区的变异区域进行pcr扩增，得到一个长约190nt的dna产物；然后dna产物与载体上固定的、不同型别hpv的检测探针进行杂交，并偶联上链酶亲和素-辣根过氧化物酶，在酶的作用下把底物鲁米诺分解氧化发光；最后通过hpv分型基因芯片检测报告系统自动采集图片分析并报告结果。所述的检测方法简便高效，能快速鉴定分辨出hpv的型别。

一、检测芯片(探针微矩阵)的制备

a、准备

制备探针微矩阵可使用已知的点样仪如biodot-ad系列的芯片点样仪、北京博奥晶典生物技术有限公司的晶芯系列点样仪，每个点点样0.2μl，探针浓度为10μm。

作为载体的改性硅胶膜选自苏州偲聚生物材料有限公司的硅胶膜产品。

b、硅胶膜活化

改性硅胶膜解冻平衡至室温后，浸泡于edc和nhs的活化液中，30min后取出用去离子水冲洗2次，晾干，马上用于点样。

c、探针点样

探针用ddh2o溶解为20μm的溶液，加入ph值8.0的等体积碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，混匀，备用。硅胶膜处理完成后，即使用点样仪按照设定的阵列进行矩阵的点样，每个矩阵点点样0.2μl，包含四个角的对照用的gapdh检测探针。

d、探针固定

检测探针的序列如seqidno:1～14以及seqidno:19所示，且5’端具有序列如seqidno:20所示的连接序列片段，该连接序列片段的5’端具有氨基修饰。

刚制备好的芯板(探针微矩阵)放在恒温恒湿箱(26℃，50％湿度)中固定一个小时，待点样液体蒸发干涸后即可保存在4℃冰箱，后续固定在芯板上需要在两天内完成。

e、芯片固定

在芯板的底部滴加少量的一滴uv胶水，能粘住硅胶膜底面即可。将硅胶膜矩阵面朝上粘贴，注意不要让胶水过量粘到硅胶膜矩阵面，否则芯片作废。用uv胶对应的波长紫外线照射凝固2min，硅胶膜即可固定在芯片板的芯片槽内，密封保存于4℃冰箱。

二、hpv分型检测

1、核酸提取

核酸提取是使用tris碱加树脂制成的提取试剂通过高温煮沸12min的方式破碎细胞，释放病毒。通过离心取上清富集病毒，并用于pcr扩增反应。

tris碱的ph值调至11～12，强碱溶解细胞膜释放胞内物，加热变性蛋白质。加入树脂chelex-100，吸附细胞质的蛋白质等物质，通过离心可将细胞的大分子组分富集在管底，核酸病毒小分子游离分散在上清中。上清可作为pcr的模板使用。

2、pcr扩增

核酸扩增使用takala的taqhotstar系列的dna聚合酶试剂，具体扩增按照试剂的说明书要求或适当调整即可。

pcr反应液配制为:extaq25μl

hpvf0.75μl

hpvr1μl

gapdhf0.75μl

gapdhr1μl

dna5μl(可根据病毒dna的含有量进行调节)

ddh2o补至50μl。

其中，hpvr/gapdhr为生物素标记。

pcr扩增反应的程序为：94℃、5min；94℃、10s，45℃、45s，共40个循环；72℃、45s；72℃、5min；4℃长期保存。

上样为：1μl6×buffer+5μldna样本核酸，若为10×buffer，则减少加入量，可尝试不加buffer。

3、芯片杂交

杂交试剂为40％的甲酰胺溶液，杂交洗涤剂为35％的甲酰胺溶液，杂交试剂有利于核酸配对碱基的结合，使hpv分型产物与对应的探针特异结合。杂交洗涤剂稍低的浓度有利于洗脱去结合的不牢靠的非特异结合，提高特异准确性，减少非特异背景。

pcr扩增产物沸水浴5min，立即冰浴保存，将双链dna解链成单链分子。取大部分dna产物20μl(25μl扩增体系)加入芯片槽，加入300μl杂交试剂，室温摇床杂交，100rpm/min，杂交30min，去杂交液。

加入300μl杂交洗涤实际，室温摇床洗涤，100rpm/min，洗涤2min，去洗涤液。重复操作一次。

4、酶杂交

酶杂交试剂为相应浓度的标记有链霉亲和素的辣根过氧化物酶，在缓冲液的平衡下，链霉亲和素与扩增产物引物端的生物素特意结合，形成硅胶膜-检测探针-pcr产物(引物5’端标记生物素)-链霉亲和素-辣根过氧化物酶的复合物。

加入100μl酶杂交试剂，室温摇床杂交，100rpm/min，杂交15min，去杂交液。

加入酶洗涤试剂，室温摇床洗涤，100rpm/min，洗涤2min，去洗涤液。重复操作一次。

5、酶反应显色

显色试剂含有a液氧化剂过氧化脲，b液沉淀型底物tmb，在过氧化剂的催化下，酶将底物tmb分解为肉眼可见颜色的化学物质，以供结果鉴别。

加入等量a/b液混合的化学底物试剂鲁米诺试剂各150μl，静止反应8min，通过ccd技术检测，拍照，读取分析结果。ccd技术可将看不见的短波长荧光曝光成可见光点。或者

加入等量a/b液混合的化学底物试剂tmb各150μl，静止反应8min，即可见蓝色点出现，拍照，读取分析结果。

本实施例的核酸提取简单化，提取核酸仅需离心，沸水浴，离心三个步骤，仅需30min就可完成。杂交部分可以在常温下进行，无需加热，可以减少仪器及操作，提高检测效率。并且使用摇床代替杂交仪，仪器价廉易得，杂交时间短，从杂交到出结果仅需90min，与常规杂交3～6h相比，大大提高了检测效率。

三、结果：

通过对阴性样本以及hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66以及hpv68阳性样本进行检测，结果如图3、图4和图5所示，证明使用本发明的hpv分型检测用的核酸组合物、检测芯片或试剂盒等配合相应的方法完全可行，可以准确地对hpv进行分型检测。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州鸿琪光学仪器科技有限公司

<120>hpv分型检测用的核酸组合物及应用

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtacctacgacaaggggagg20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gtatttaagacaaagtgagg20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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atatataagacaagttgaag20

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<400>9

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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gtatattaggcatgttcagg20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gcmcagggwcataayaatgg20

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<212>dna

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ctgcgaaatatgatgacatc20

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<212>dna

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<400>20

atacaaa7