本发明涉及微生物评价领域，特别是一种水产品微生物致腐能力的评价方法。
背景技术
水产品口感鲜美，含有丰富的蛋白质和多不饱和脂肪酸，具有很高的食用价值和营养价值。但水产品在贮藏期间容易腐败变质，影响其感官、风味和营养价值。微生物的入侵和繁殖是造成水产品腐败的重要因素。微生物分解水产品中的蛋白质等成分，产生胺类等碱性含氮物。这些物质被称为挥发性盐基氮，其含量与水产品中氨基酸破坏程度呈正相关，造成水产品的腐败，是反映水产品新鲜程度的重要指标。
在水产品的贮藏中，不同种类微生物对于水产品腐败的影响程度与其致腐能力密切相关。因此对不同种类微生物的致腐能力进行测定和研究，有利于对水产品中造成腐败的主要微生物进行筛选和靶向抑制，为延长水产品的货架期提供理论基础。
致腐能力的强弱可以根据感官评价来定性评估，但由于其受主观因素影响较大，因此使用化学腐败指标(如tvb-n值)进行致腐能力的定量评估更为准确。目前大部分报道使用tvb-n产量因子(ytvb-n)进行致腐能力的评价。tvb-n产量因子(ytvb-n)将tvb-n值和tvc值结合起来，为使用最多的致腐能力评价方法，但这种方法选取贮藏起点和货架终点的tvb-n值和tvc值，总共四个点，而没有将腐败期间的过程纳入考量范围，因此具有较大的误差。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明提供一种简便、准确，又能全面的表达微生物在水产品腐败过程中致腐能力的评价方法，该方法能够简便、准确，又能全面的表达微生物在水产品腐败过程中致腐能力的评价。
本发明的目的是按如下的方式来实现的：一种水产品微生物致腐能力的评价方法，包括以下步骤：
(1)微生物菌悬液的制备：将冷冻保藏的单菌液在37℃水浴中活化10～20min，并在营养琼脂中划线培养复壮后，挑取典型的单菌落于营养肉汤中，37℃下培养12～24h，离心后弃上清液，并用无菌生理盐水调整到菌悬液浓度6～6.5lg(cfu/g)范围内备用；
(2)无菌水产品制备：将新鲜水产品去内脏后用蒸馏水洗净，在无菌超净台中将处理好的水产品放在灭菌的砧板上，在体积浓度75％的酒精中浸泡10～30s后捞起自然晾干后，再用无菌水洗净；
(3)微生物接种及包装：将上述制备的无菌水产品及单菌稀释菌悬液置于超净台中，将水产品浸泡于菌悬液中，10～30s后取出，放置于相应的包装中，以未接种腐败菌的水产品作对照，并贮藏；
(4)贮藏过程中挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测：在t1，t2，…，ti，…，tn时刻均将水产品从贮藏环境中取出，进行挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的多次检测，每个时刻检测结果取平均值；
(5)当挥发性盐基氮(tvb-n)值>50mg/100g时，贮藏期结束,利用采集的数据，使用致腐能力计算公式对微生物致腐能力进行计算，得到水产品微生物的致腐能力。
进一步的，所述步骤(3)中，贮藏温度为4～25℃。
进一步的，所述步骤(4)中，t1，t2，…，ti，…，tn的间隔时间为0.5～2天。
进一步的，所述步骤(4)中分别采用国标gb/5009.228—2016和gb/4789.2—2015进行挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测。
进一步的，所述步骤(5)中致腐能力计算公式为：
本发明的积极效果如下：使用新型致腐能力计算公式，将水产品贮藏全过程中某种微生物的致腐能力进行计算，最终得到某种微生物对水产品的致腐能力。该方法简便、准确，又能全面的表达微生物在水产品腐败过程中致腐能力，可以为水产品贮藏过程中微生物的靶向抑制提供参考，从而延缓水产品的腐败，延长其货架期，提高其经济价值和营养价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本方法作进一步详述。
实施例1:s.glacialipiscicola，p.heimbachae，p.hauseri在小黄鱼冷藏过程中的致腐能力评价
(1)微生物菌悬液的制备：将冷冻保藏的s.glacialipiscicola，p.heimbachae，p.hauseri单菌液分别在37℃水浴中活化10min，并在营养琼脂中划线培养复壮后，挑取典型的单菌落于营养肉汤中，37℃下培养一定0.5，离心后弃上清液，并用无菌生理盐水调整到菌悬液浓度6lg(cfu/g)备用；
(2)无菌水产品制备：将新鲜小黄鱼去内脏后用蒸馏水洗净，在无菌超净台中将处理好的水产品放在灭菌的砧板上，在体积浓度为75％的酒精中浸泡10s后捞起自然晾干后，再用无菌水洗净；
(3)微生物接种及包装：将上述制备的无菌小黄鱼及s.glacialipiscicola，p.heimbachae，p.hauseri单菌稀释菌悬液置于超净台中。将小黄鱼分别浸泡于菌悬液中，10s后取出，放置于无菌培养皿中，以未接种的小黄鱼作对照，置于4℃下冷藏保存；
(4)贮藏过程中挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测：贮藏过程中挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测。每隔2d将小黄鱼从贮藏环境中取出，分别进行挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测，时间点分别记为t1，t2，…ti，…，tn，每个时间点进行多次检测，检测结果取平均值；
(5)当挥发性盐基氮(tvb-n)值≥50mg/100g时，贮藏期结束。利用采集的数据，使用致腐能力计算公式对微生物致腐能力进行计算，得到水产品微生物的致腐能力。
实施例2:a.salmonicida，c.maltaromaticum，s.glacialipiscicola在带鱼真空常温保藏过程中的致腐能力评价
(1)微生物菌悬液的制备：将冷冻保藏的a.salmonicida，c.maltaromaticum和s.glacialipiscicola单菌液分别在37℃水浴中活化20min，并在营养琼脂中划线培养复壮后，挑取典型的单菌落于营养肉汤中，37℃下培养一定24h，离心后弃上清液，并用无菌生理盐水调整到菌悬液浓度6.5lg(cfu/g)备用；
(2)无菌水产品制备：将新鲜带鱼去内脏后用蒸馏水洗净，在无菌超净台中将处理好的水产品放在灭菌的砧板上，在体积浓度为75％的酒精中浸泡30s后捞起自然晾干后，再用无菌水洗净；
(3)微生物接种及包装：将上述制备的无菌带鱼及a.salmonicida，c.maltaromaticum，s.glacialipiscicola单菌稀释菌悬液置于超净台中。将带鱼分别浸泡于菌悬液中，30s后取出，放置于真空袋中抽真空，以未接种的带鱼作对照，置于25℃下保存；
(4)贮藏过程中挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测：贮藏过程中挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测。每隔0.5将三份带鱼从贮藏环境中取出，分别进行挥发性盐基氮(tvb-n)值和菌落总数(tvc)的检测，时间点分别记为t1，t2，…ti，…，tn，每个时间点进行多次检测，检测结果取平均值；
(5)当挥发性盐基氮(tvb-n)值≥50mg/100g时，贮藏期结束。利用采集的数据，使用致腐能力计算公式
使用传统的tvb-n产量因子(ytvb-n)评价方法和本发明的新型致腐能力评价方法对s.glacialipiscicola，p.heimbachae，p.hauseri在小黄鱼冷藏过程中的致腐能力评价结果如表1所示。a.salmonicida，c.maltaromaticum，s.glacialipiscicola在带鱼真空常温保藏过程中的致腐能力评价结果如表2所示。
传统的tvb-n产量因子(ytvb-n)评价方法和本发明的新型致腐能力评价方法对比可以发现，对一些明显的可预测现象，两种方法都给出了一致的结果。考虑到进行单菌污染到货架终点的时间范围较短，且货架期的差异导致不同包装之间微生物致腐能力的比较变得缺少意义，这是传统的tvb-n产量因子(ytvb-n)评价方法所无法避免的，除此以外，传统的tvb-n产量因子(ytvb-n)评价方法所得结果仅有一个值，无法进行显著性分析。本发明的新型致腐能力评价方法，从更大尺度的时间范围内进行致腐能力的评价，也可以对不同包装下的致腐能力进行比较，因此准确性和便捷性更高。
表1tvb-n产量因子(ytvb-n)评价方法和新型致腐能力评价方法对s.glacialipiscicola，p.heimbachae，p.hauseri在小黄鱼冷藏过程中的致腐能力评价
注：同列肩标小写字母不同代表差异显著(p<0.05)
表2tvb-n产量因子(ytvb-n)评价方法和新型致腐能力评价方法对a.salmonicida，c.maltaromaticum，s.glacialipiscicola在带鱼真空常温保藏过程中的致腐能力评价
注：同列肩标小写字母不同代表差异显著(p<0.05)。