本发明属蛋白质工程领域,涉及异肽键的形成,尤其是一种涉及SpyTag-SpyCatcher系统介导的分子自催化形成异肽键,特别是一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋白质工程中应用。
背景技术:
一般地,蛋白质工程着力解决如下两个问题:
1、蛋白质热力学稳定性问题。
2、蛋白质功能动力学高效问题。
目前,蛋白质工程技术存在以下两方面存在着改善空间:
1、构效关系研究限制,定点突变蛋白质改性的效率不高
核苷酸为基础的定向进化,因密码子简并性造成无意义的分子多样性,增加筛选过程难度;因个别氨基酸的变化对整体蛋白质结构与功能影响有限,更不可预知的是,在肽链氨基酸序列限定后,其有意义的生物多样性饱和的事实便已经决定了的能否通过这样的进化获得期望的工程蛋白质;
2、多肽或蛋白质的定点化学修饰,存在生产成本高及产品质量均一性不好控制等问题。
本发明公开一种新的蛋白质工程方法,在一定程度上可以突破上述生物多样性饱和特性的限制,而且因降低了负突变数量,其进化速度有了显著的提高,而且其产物均可通过基因预编程实现,没有后续的化学修饰。在玉米黄质裂解酶改性中显示出了本发明易于实施、进化速度快、效果明显等优点。
随着生物学发展,越来越多蛋白质生理生化功能得到阐明,并进入酶制剂或医药蛋白开发成为生物产业的重要分支领域,其地位逐渐受到重视,尤其生物制药、生物能源、生物资源转化等领域展现出了令人鼓舞的前景。目前,工业酶制剂主要集中在底物为糖类、蛋白质、果胶、脂肪酸等少数品种,与已发现的酶类相比几乎处于起步阶段,这一方面反映了市场的需求状况,更深层次的原因在于其自身催化特性与工艺需求的差距。为增加酶催化的工艺适用性,通常是对酶制剂参与工艺过程之前进行预处理刺激或进行包埋等处理,如对脂酶的有机试剂预处理及包埋,延长了使用寿命,提高了其生物柴油生产中的催化效率,但这些使用前的操作无疑既费时又增加生产成本。新酶的分离、筛选成为一个新的选择,但即使不断有新的耐受性较好的酶被发现,其催化动力学方面也并不总是很理想,导致其催化效率难以维持在较高的水平。实验室定向进化技术的出现,使酶工程发展进入新阶段。一般的做法伴随着酶蛋白编码核酸序列中核苷酸的随机突变,之后,进入期望克隆筛选程序。这一过程模拟自然进化进程,理论上可以获得可能的催化特性。但这一过程也存在着显而易见的限制:首先,需要保证产生足够的生物多样性,这要求蛋白质(核酸)分子具有足够的长度;其次,因绝大多数为负突变,筛选工作依赖于高通量工作流程的建立;最后,因密码子的简并性及单个氨基酸突变在酶蛋白中影响力普遍较小等因素,导致核苷酸随机突变获得良好的酶蛋白的几率进一步降低。
目前已经发现几种异肽键形成途径,分别是:泛素化途径(ubiquitylation),类泛素化(SUMO),转谷氨酰胺化途径(transglutamination),分选酶途径(sortase mediated reaction)及肽链链接酶途径(SpyLigase system)。其中,肽链链接酶途径最为灵活,所涉及的标签不受限于在肽链内的位置,已经应用于蛋白质工程,但仅限于定点修饰。尤其是将SpyTag与SpyCatcher分别置于多肽链的两端(C端及N端),获得了高耐热性的改性蛋白质。因而与本发明所述不同。
肽扫描(peptide scanning)称谓源于早期的肽链内氨基酸全饱和替换技术,即,从肽链的氨基端到羧基端单个氨基酸替换,如丙氨酸扫描(Alanine scanning)。之后,逐渐发展出更多这种类似技术,直至发展到肽链内部两个氨基酸间进行的酰胺扫描,肽扫描常用于基础研究,用来探索组成肽链的各氨基酸作用。本发明就是综合分析了SpyTag-SpyCatcher系统及认识肽扫描本质的基础上,经过理性思维及实验验证获得的一种新的蛋白质工程方法。
技术实现要素:
本发明的目的在于克服现有策略的不足之处,提供一种蛋白质快速进化的方法,该方法对传统蛋白质工程起到了一个手段补充的作用,同时,因可以较大的改变蛋白质结构,进而深刻影响构效关系,更容易获得传统方法不易获得的某种性状的蛋白质或多肽。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法,其特征在于:所述方法依赖于某宿主内,分子内异肽键的形成,且这种异肽键的形成具有位置的任意,可应用于蛋白质工程领域,为蛋白质快速进化改性提供新的策略。
而且,具体步骤如下:
(1)首先用SpyCatcher(氨基酸序列AS1)或SpyTag(氨基酸序列AS2)定点替换某目标蛋白内部的氨基酸或寡肽段,或插入某目标蛋白氨基酸残基下游。避免编码拼接时造成移码突变及翻译终止突变;
(2)将SpyTag或SpyCatcher随机替换上述已经载有SpyCatcher或SpyTag的某目标蛋白内部氨基酸或寡肽段,或插入目标蛋白肽链上任意氨基酸编码的位置,勿造成移码突变及翻译终止突变。最后,得到一可自发形成分子内异肽键的蛋白质文库;
(3)将上述带有SpyCatcher的SpyTag随机替换或插入文库,在合适的宿主内表达;
(4)通过文库筛选,获得蛋白质改性的工程蛋白。
而且,分子内异肽键的形成不包括SpyTag与SpyCatcher同时位于肽链两端的情况。
而且,高醇耐受性CCD2肽链内存在着异肽键,且其氨基酸序列与AS4所示序列同源性大于70%。
如上所述的基于异肽键扫描的蛋白质工程方法在蛋白质工程中的应用。
本发明取得的创新及优点:
1、发展了肽扫描技术。与以往的肽扫描技术最大不同之处在于,通过结合SpyTag-SpyCatcher系统,在一条肽链内引入上述两个标签,进而使两标签间形成异肽键;
2、弥补传统的蛋白质工程多依赖于单核苷酸随机突变的定向进化无意义文库及进化幅度小等缺点,本发明利用异肽键扫描,可以更显著的改变多肽链或蛋白质的结构,进而更深刻的影响蛋白质性质,有利于蛋白质构象的快速突变,为筛选提供了变异幅度更大的群体多样性,利于蛋白质性状的进化。
3、本方法基于SpyTag-SpyCatcher系统,配合DNA合成技术、异源表达技术,整个进化过程可基因编码。
4、SpyTag-SpyCatcher系统分离于细菌,但已成功应用于包括酵母脯乳动物细胞等多种微生物、细胞中,因此,本发明实用性强,适用性广。
5、本方法利用微生物为宿主,利用SpyTag与SpyCatcher系统可自催化形成异肽键的特性,将SpyTag或SpyCatcher随机替换某目标蛋白质肽链的任意氨基酸或插入某目标蛋白质肽链任意位置所得肽链的编码序列,置于合适的启动子及终止子,构建表达盒,在宿主控制下,实现转录及翻译,得到在多肽链不同氨基酸间自发形成了异肽键的目标蛋白质产物的集合。配合适当的筛选方法,可获得不同的改性蛋白质。本发明针对重组蛋白改性而开发,本发明提供了一蛋白质快速人工进化的方法。
附图说明
图1为本发明中展示于EBY100细胞表面的不同环化CCD2在醇溶液中催化玉米黄质转化实验图;其中,各组数据为五次试验平均值。CK1,第一对照,为展示于EBY100细胞表面的野生型CCD2;CK2,第二对照,为含有pYD1空载体的EBY100细胞。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述,以下实施例只是作为实例进行的描述,并非本发明的限定使用实施范围,不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法,所述方法利用微生物宿主异源表达功能,设计编码序列而实现。这个编码序列上既有SpyTag也有SpyCatcher的编码序列,而且两者在整条肽链上相对位置任意。最后,通过文库筛选获得特定性状的改性蛋白质。
具体步骤如下:
(1)将SpyCatcher或SpyTag编码序列置于某目标蛋白或多肽链的特定位置(置换这个目标蛋白或多肽上氨基酸或寡肽段或者插入这个目标蛋白或多肽上氨基酸下游);
(2)将SpyTag或SpyCatcher编码序列随机替换上述已经载有SpyCatcher或SpyTag的目标蛋白或多肽链上任意氨基酸或寡肽段的编码序列,切勿造成移码突变或翻译终止突变,形成一文库;
(3)构建文库表达盒;
(4)将上述表达盒置于合适载体上或整个到宿主基因组上;
(5)通过筛选获得改性蛋白。
实施例2
异肽键扫描筛选耐有机溶剂玉米黄质裂解酶
玉米黄质裂解酶(CCD2,来源于藏红花,氨基酸序列AS3)可催化价格较低的来源广泛的玉米黄质裂解为价格昂贵的、稀缺的苦藏花素及藏红酸二醛,但玉米黄质难溶于水,相应的酶促反应需要在有机试剂中进行。为此,获得耐有机试剂的工程化CCD2意义重要。
1、对有机试剂的耐属性属于酶的热力学稳定范围。玉米黄质可溶于乙醚或乙醇,出于食品安全考虑,选用耐乙醇为目标。乙醇属于极性有机试剂,穿透力强。为获得热力学稳定的工程化CCD2,一个理想方式就是适当收紧蛋白高级结构。因CCD2酶的N及C端均不参与催化活性中心,将Spy Catcher融合于C端,之后,进行异肽键扫描,即SpyTag标签由N端向配体结合或催化活性中心组成部位连续替换十三肽。这样,确定了由M1~N257为扫描范围。这里采取快速逼近方法,将257个氨基酸组成的肽段,分成19+1个十三肽,分别由SpyTag标签替换。替换后肽段编码序列表示为:n1~n2-SpyTag-n3~n4-SpyCatcher
2、基因合成20条具有终止密码子及不同位置SpyTag的CCD2-SpyCatcher多肽链编码序列:第一条,SpyTag-14~623-GSGSG linker-SpyCatcher,第二条,1~13-SpyTag-27~623-GSGSG linker-SpyCatcher,……第19条,1~234--SpyTag-248~623-GSGSG linker-SpyCatcher。特别地,第20条,1~244-SpyTag-258~623-GSGSG linker-SpyCatcher。1条CCD2多肽链编码序列作为对照。
3、将上述21条多肽链编码序列分别克隆到pYD1的BamHI/EcoRI位点。得到表达载体pYD1-CCD2-N,转化EBY100()酵母宿主,得到21株工程菌,在半乳糖培养下可表达并在细胞表面展示各CCD2酶。收集100μL细胞,加入900μL含0.2g/mL玉米黄质的乙醇溶液的1.5mL EP管中,以μL100封口,37℃温育1h,2h,4h及8h后,HPLC分析玉米黄质含量变化。
结果表明,第17条,即1~208-SpyTag-222~~623-GSGSG linker-SpyCatcher表达自环化后,在醇溶液中具有最好的催化效率。通过测序,获得核酸序列,并推测出其编码的氨基酸序列(ASN4)
机制上,初步推测经过分子间异肽键的形成,加固了CCD2在醇溶液中的稳定性,同时,其形成位置适当,对底物进入空间位阻小。
AS1:
AHIVMVDAYKPTK
AS2:
GenBank:AFD50637.1
MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ASN3:
MESPATKLPAPLLMLSSSPFLLPSPNKSSSIFLPRKLGPLPPKYYYYNCCHPKSRSISVVSMANKEEAETSKKKPKPLKVLITKVDPKPRKGMASVAVDLLEKAFVYLLSGNSAADRSSSSGRRRRKEHYYLSGNYAPVGHETPPSDHLPIHGSLPECLNGVFLRVGPNPKFAPVAGYNWVDGDGMIHGLRIKDGKATYLSRYIKTSRFKQEEYFGRAKFMKIGDLRGLLGFFTILILVLRTTLKVIDISYGRGTGNTALVYHNGLLLALSEEDKPYVVKVLEDGDLQTLGILDYDKKLSHPFTAHPKIDPLTDEMFTFGYSISPPYLTYRVISKDGVMQDPVQISITSPTIMHDFAITENYAIFMDLPLYFQPEEMVKGKFVSSFHPTKRARIGVLPRYAKDEHPIRWFDLPSCFMTHNANAWEENDEVVLFTCRLESPDLDMLSGPAEEEIGNSKSELYEMRFNLKTGITSQKQLSVPSVDFPRINQSYTGRKQQYVYCTLGNTKIKGIVKFDLQIEPEAGKTMLEVGGNVQGIFELGPRRYGSEAIFVPCQPGIKSDEDDGYLIFFVHDENNGKSEVNVIDAKTMSAEPVAVVELPSRVPYGFHALFLNEEELQKHQAET
AS4:
MESPATKLPAPLLMLSSSPFLLPSPNKSSSIFLPRKLGPLPPKYYYYNCCHPKSRSISVVSMANKEEAETSKKKPKPLKVLITKVDPKPRKGMASVAVDLLEKAFVYLLSGNSAADRSSSSGRRRRKEHYYLSGNYAPVGHETPPSDHLPIHGSLPECLNGVFLRVGPNPKFAPVAGYNWVDGDGMIHGLRIKDGKATYLSRYIKTSRAHIVMVDAYKPTKKIGDLRGLLGFFTILILVLRTTLKVIDISYGRGTGNTALVYHNGLLLALSEEDKPYVVKVLEDGDLQTLGILDYDKKLSHPFTAHPKIDPLTDEMFTFGYSISPPYLTYRVISKDGVMQDPVQISITSPTIMHDFAITENYAIFMDLPLYFQPEEMVKGKFVSSFHPTKRARIGVLPRYAKDEHPIRWFDLPSCFMTHNANAWEENDEVVLFTCRLESPDLDMLSGPAEEEIGNSKSELYEMRFNLKTGITSQKQLSVPSVDFPRINQSYTGRKQQYVYCTLGNTKIKGIVKFDLQIEPEAGKTMLEVGGNVQGIFELGPRRYGSEAIFVPCQPGIKSDEDDGYLIFFVHDENNGKSEVNVIDAKTMSAEPVAVVELPSRVPYGFHALFLNEEELQKHQAETGSGSGMSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图,但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换、变化和修改都是可能的,因此,本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋白质工程中应用
<130> 2018-5-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> AS1(AS1)
<400> 1
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> AS2(AS2)
<400> 2
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly
20 25 30
Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp
35 40 45
Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu
50 55 60
Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile
65 70 75 80
Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro
85 90 95
Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val
100 105 110
Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val
115 120 125
Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile
130 135
<210> 3
<211> 623
<212> PRT
<213> ASN3(ASN3)
<400> 3
Met Glu Ser Pro Ala Thr Lys Leu Pro Ala Pro Leu Leu Met Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ser Pro Phe Leu Leu Pro Ser Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ile Phe
20 25 30
Leu Pro Arg Lys Leu Gly Pro Leu Pro Pro Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Asn
35 40 45
Cys Cys His Pro Lys Ser Arg Ser Ile Ser Val Val Ser Met Ala Asn
50 55 60
Lys Glu Glu Ala Glu Thr Ser Lys Lys Lys Pro Lys Pro Leu Lys Val
65 70 75 80
Leu Ile Thr Lys Val Asp Pro Lys Pro Arg Lys Gly Met Ala Ser Val
85 90 95
Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Ala Phe Val Tyr Leu Leu Ser Gly Asn
100 105 110
Ser Ala Ala Asp Arg Ser Ser Ser Ser Gly Arg Arg Arg Arg Lys Glu
115 120 125
His Tyr Tyr Leu Ser Gly Asn Tyr Ala Pro Val Gly His Glu Thr Pro
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Pro Ser Asp His Leu Pro Ile His Gly Ser Leu Pro Glu Cys Leu Asn
145 150 155 160
Gly Val Phe Leu Arg Val Gly Pro Asn Pro Lys Phe Ala Pro Val Ala
165 170 175
Gly Tyr Asn Trp Val Asp Gly Asp Gly Met Ile His Gly Leu Arg Ile
180 185 190
Lys Asp Gly Lys Ala Thr Tyr Leu Ser Arg Tyr Ile Lys Thr Ser Arg
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Phe Lys Gln Glu Glu Tyr Phe Gly Arg Ala Lys Phe Met Lys Ile Gly
210 215 220
Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly Phe Phe Thr Ile Leu Ile Leu Val Leu
225 230 235 240
Arg Thr Thr Leu Lys Val Ile Asp Ile Ser Tyr Gly Arg Gly Thr Gly
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Asn Thr Ala Leu Val Tyr His Asn Gly Leu Leu Leu Ala Leu Ser Glu
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Glu Asp Lys Pro Tyr Val Val Lys Val Leu Glu Asp Gly Asp Leu Gln
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Tyr Ser Ile Ser Pro Pro Tyr Leu Thr Tyr Arg Val Ile Ser Lys Asp
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Gly Val Met Gln Asp Pro Val Gln Ile Ser Ile Thr Ser Pro Thr Ile
340 345 350
Met His Asp Phe Ala Ile Thr Glu Asn Tyr Ala Ile Phe Met Asp Leu
355 360 365
Pro Leu Tyr Phe Gln Pro Glu Glu Met Val Lys Gly Lys Phe Val Ser
370 375 380
Ser Phe His Pro Thr Lys Arg Ala Arg Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr
385 390 395 400
Ala Lys Asp Glu His Pro Ile Arg Trp Phe Asp Leu Pro Ser Cys Phe
405 410 415
Met Thr His Asn Ala Asn Ala Trp Glu Glu Asn Asp Glu Val Val Leu
420 425 430
Phe Thr Cys Arg Leu Glu Ser Pro Asp Leu Asp Met Leu Ser Gly Pro
435 440 445
Ala Glu Glu Glu Ile Gly Asn Ser Lys Ser Glu Leu Tyr Glu Met Arg
450 455 460
Phe Asn Leu Lys Thr Gly Ile Thr Ser Gln Lys Gln Leu Ser Val Pro
465 470 475 480
Ser Val Asp Phe Pro Arg Ile Asn Gln Ser Tyr Thr Gly Arg Lys Gln
485 490 495
Gln Tyr Val Tyr Cys Thr Leu Gly Asn Thr Lys Ile Lys Gly Ile Val
500 505 510
Lys Phe Asp Leu Gln Ile Glu Pro Glu Ala Gly Lys Thr Met Leu Glu
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Val Gly Gly Asn Val Gln Gly Ile Phe Glu Leu Gly Pro Arg Arg Tyr
530 535 540
Gly Ser Glu Ala Ile Phe Val Pro Cys Gln Pro Gly Ile Lys Ser Asp
545 550 555 560
Glu Asp Asp Gly Tyr Leu Ile Phe Phe Val His Asp Glu Asn Asn Gly
565 570 575
Lys Ser Glu Val Asn Val Ile Asp Ala Lys Thr Met Ser Ala Glu Pro
580 585 590
Val Ala Val Val Glu Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His Ala
595 600 605
Leu Phe Leu Asn Glu Glu Glu Leu Gln Lys His Gln Ala Glu Thr
610 615 620
<210> 4
<211> 767
<212> PRT
<213> AS4(AS4)
<400> 4
Met Glu Ser Pro Ala Thr Lys Leu Pro Ala Pro Leu Leu Met Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ser Pro Phe Leu Leu Pro Ser Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ile Phe
20 25 30
Leu Pro Arg Lys Leu Gly Pro Leu Pro Pro Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Asn
35 40 45
Cys Cys His Pro Lys Ser Arg Ser Ile Ser Val Val Ser Met Ala Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Ala Phe Val Tyr Leu Leu Ser Gly Asn
100 105 110
Ser Ala Ala Asp Arg Ser Ser Ser Ser Gly Arg Arg Arg Arg Lys Glu
115 120 125
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130 135 140
Pro Ser Asp His Leu Pro Ile His Gly Ser Leu Pro Glu Cys Leu Asn
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Gly Val Phe Leu Arg Val Gly Pro Asn Pro Lys Phe Ala Pro Val Ala
165 170 175
Gly Tyr Asn Trp Val Asp Gly Asp Gly Met Ile His Gly Leu Arg Ile
180 185 190
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195 200 205
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Arg Thr Thr Leu Lys Val Ile Asp Ile Ser Tyr Gly Arg Gly Thr Gly
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Ala His Pro Lys Ile Asp Pro Leu Thr Asp Glu Met Phe Thr Phe Gly
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Ser Phe His Pro Thr Lys Arg Ala Arg Ile Gly Val Leu Pro Arg Tyr
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Ala Lys Asp Glu His Pro Ile Arg Trp Phe Asp Leu Pro Ser Cys Phe
405 410 415
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