一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法与流程

文档序号：15857751发布日期：2018-11-07 11:16阅读：331来源：国知局

本发明涉及一种鲢鳙通用微卫星荧光多重pcr的方法，适用于鲢鳙群体遗传变异和亲子鉴定等研究，属于水产养殖领域中水产动物种质鉴定技术领域。

背景技术

鲢(hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(hypophthalmichthysnobilis)为鲤科鱼类中的近缘物种，作为中国重要土著鱼类，广泛分布于各大江河湖泊中。两者均属虑食性鱼类，是净水渔业的重要生物资源，在目前水环境保护和治理中具有重要生态价值。同时，两者作为中国传统大宗淡水鱼养殖品种，具有悠久的养殖历史，养殖体量大，在中国淡水渔业中占有极其重要的经济地位。因此，对鲢鳙种质资源的有效保护和利用具有重要意义。然而，受水利设施建设、环境污染、过度捕捞等影响，鲢和鳙的野生资源受到严重冲击，近年来野生资源量呈急剧下降趋势。此外，由于成鱼个体大、繁殖周期长等特点，两种鱼的选育实施难度较大，在其养殖业中良种覆盖率较低，亲本来源对野生资源的依赖程度较大。目前，鳙尚未获得选育良种，且养殖群体正面临生长减慢、抗病力下降和遗传多样性降低等种质退化的风险。因此，开展对鲢鳙的群体种质评估，并基于群体资源开展品种改良和选育工作，有助于减少对野生资源的依赖，并为其渔业养殖的可持续发展提供保障。

中国鱼类遗传育种工作开展较多，并有很多成功案例，对中国水产养殖业健康可持续发展起到重要支撑作用。其中，群体选育是开展水产动物育种最简单的方法，主要基于目标性状和表型进行逐代选择，相对省时省力，在许多环境下可获得较快遗传进展，被广泛应用于鱼类育种；且在群体选育中，通常涉及一些种群间(或群体)间的交配组合涉及。鲢和鳙在中国广泛分布，具有较多的地域种群(或群体)，可为开展其遗传改良研究提供物质基础。此外，家系选育也是鱼类遗传改良中常用的育种技术，通过建立大量家系，掌握繁殖后代的家系数和系谱关系，有利于逐代选择中的交配方案制定，可有效降低近交概率并提高选择压力。然而，鲢鳙的亲本个体大、保种成本高、构建大量家系比较困难，加之鲢鳙的产卵量大，繁殖行为基础数据匮乏，目前尚未见报道有群体或家系选育相关工作的开展。

针对以上提及的实际问题，本发明设想借助微卫星分子标记(microsatellite)开展鲢鳙的群体遗传研究和亲子鉴定等研究。一方面，可以了解目前鲢鳙的种质资源遗传现状，为开展选育工作提供背景数据；另一方面，通过构建亲子鉴定技术，为开展家系选育提供技术支持。在过去的几十年里，对中国鲢鳙群体的野生资源的遗传多样性研究也有较多开展，如基于形态学、同工酶和分子标记等方面的遗传比较，可为开展群体选育提供基础参考；其中也有采用微卫星标记开展的群体遗传研究，但检测技术多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在分辨率和准确性上存在提高和改进的空间。而微卫星标记作为动物系谱鉴定常用的分子标记，在鲢鳙的亲子鉴定研究中尚未见报道；因此，筛选适合的微卫星标记并用于构建鲢鳙亲子鉴定技术具有重要的现实意义。

近年来，随着分子检测技术的不断发展，对微卫星标记等位基因的分型技术也越来越精确和高效，已由传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方法，逐步发展到毛细管电泳检测技术；其中，结合应用荧光基团(fam和hex等)修饰引物和高密度dna内参标记(gs500和rox500等)开展的测序仪毛细管电泳检测技术越来越多被用于微卫星标记的分型中，具有分辨率高、准确率高、重复性好和便于高通量检测等优点。此外，随着生物试剂稳定性的不断提高，多重pcr技术的摸索和构建也越来越便利，该方法也逐渐被应用于微卫星标记的扩增中，能有效提高实验效率并降低实验成本。

综合以上的考虑，该发明结合鳙遗传连锁图谱相关文献信息(zhuetal.,2014)并从ncbi网站下载微卫星序列，依据不同长度区间的目的片段标准，重新设计引物，利用鲢鳙个体dna进行pcr扩增，并通过筛选扩增效率高、多重组合和引物浓度优化等步骤摸索构建多重pcr体系，扩增效果采用2.5％琼脂糖凝胶电泳进行检验。最后，对上游引物5'端进行荧光基团修饰(fam或hex)，再利用鲢鳙个体dna进行多重pcr扩增，产物通过abi3730xl全自动dna测序仪进行毛细管电泳检测，各位点对应个体上的等位基因条带大小通过genemapperv4.0软件进行读取，最终可用于群体遗传变异研究和亲子鉴定分析。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种鲢鳙通用的微卫星荧光多重pcr方法，可用于两种鱼的群体遗传和亲子鉴定等研究。

本发明的技术方案，一种鲢鳙通用微卫星荧光多重pcr的方法，首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚-氯仿的方法提取基因组dna，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重pcr体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。

具体过程如下：

(1)鲢鳙样本采集及dna的制备：分别收集鲢鳙鳍条样本，保存于无水乙醇中；采用传统酚-氯仿的方法提取基因组dna，通过1.0～1.5％琼脂糖凝胶电泳检测质量和纯度，利用紫外分光光度仪测量核酸浓度，最终稀释至20～50ng/μl，并保存于0～4℃。

(2)鲢鳙微卫星引物设计和筛选：基于鳙遗传连锁图谱文献信息(zhuetal.,2014)和从ncbi下载的相关微卫星序列，根据目的扩增片段长度差异的要求，利用primerpremier6.0软件设计引物，并送生物公司合成。相关引物通过步骤(1)获得的dna为模板进行pcr扩增，扩增产物利用2.0～2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，保留扩增效果好的引物对。

(3)鲢鳙微卫星多重pcr摸索和优化：基于步骤(2)筛选获得的引物对，首先将扩增条带长度差异的进行两两组合进行2重pcr扩增，再依次进行3对和4对引物的组合摸索。扩增产物通过2.0～2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并根据扩增效果调整多重pcr体系中各引物对的浓度。最终获得扩增条带清晰的3组4重pcr体系，共涉及12个微卫星标记，各位点及其引物信息如表1所示。其中，多重pcr体系1的4个微卫星位点分别为arsd684、hysd61-5、hysd9-2和arsd549；多重pcr体系2的4个微卫星位点分别为arsd380、arsd443、hysd3112-1和arsd639；多重pcr体系3的4个微卫星位点分别为hym435、arsd86、arsd291和arsd99。

(4)对引物进行荧光修饰及扩增验证：对步骤(3)所述位点的正向引物5'端进行荧光基团修饰(fam或hex)，并以步骤(1)获得的dna为模板，按照步骤(3)构建的3组4重pcr体系进行pcr扩增，扩增产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行等位基因分型。

本发明所述鲢鳙通用的3组4重pcr体系扩增产物的2.5％琼脂糖凝胶检测结果如图1所示。其中，标注m的电泳条带为d2000dnamarker(tiangen)，标注1-1、1-2和1-3的电泳条带为多重pcr体系1的3个样本重复，标注2-2、2-2和2-3的电泳条带为多重pcr体系2的3个样本重复，标注3-1、3-2和3-3的电泳条带为多重pcr体系3的3个样本重复。

步骤(4)中所述的多重pcr产物的分型是采用abi3730xl全自动dna测序仪毛细管电泳检测，以gs500为内标，通过genemapperv4.0软件读取个体各位点的等位基因大小信息(bp)，具体结果如图2所示。

该图分别展示了体系1、体系2和体系3的4重pcr体系的各位点扩增条带大小结果，横坐标为基于gs500内标为参考的条带大小(bp)，纵坐标为荧光修饰信号的识别强度，从图中可以看出各体系中的相邻位点的扩增片段存在较大的间隔。

在上述的鲢鳙通用的微卫星荧光多重pcr方法中：步骤(2)中所述设计引物的目的片段长度差异，是指100～180bp、180～260bp、260～340bp和340～420bp的4个不同区间长度，尽量避免相邻位点的扩增条带出现重叠。

步骤(2)所述微卫星引物筛选的pcr扩增体系包含2×taqmastermix(cwbio)10μl、dna模板(20～50ng/μl)1μl和上下游引物(10μm)各0.5μl，并用ddh2o补充至20μl。

步骤(2)中所述微卫星引物筛选的pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

步骤(3)所述3组4重pcr体系所涉及的12个微卫星位点和引物信息如表1所示。

步骤(3)和步骤(4)所述的3组4重pcr体系包含2×taqmastermix(cwbio)12.5μl、dna模板(50ng/μl)2μl和引物混合液2.2～2.8μl(用量如表1所示)，用ddh2o补充至25μl。

步骤(3)和步骤(4)中所述多重pcr反应程序与步骤(2)引物筛选中采用的pcr程序相同。

步骤(4)所述荧光修饰方法为对多重pcr体系4个位点中目的长度相邻的位点采用不同荧光基团进行修饰(fam和hex，如表1所示)，便于利用不同颜色分辨相邻位点的扩增条带。

表1鲢鳙3组4重pcr体系的微卫星位点及引物信息表

注:f表示正向引物，r表示反向引物；荧光修饰标记在正向引物5’端。

本发明的有益效果：本发明的优点在于该发明所涉及的12个微卫星位点适用于鲢和鳙两种鱼的dna扩增，能有效提高其应用范围；且所述3组4重pcr体系能有效降低实验和检测成本、提高工作效率。此外，发明基于扩增片段长度差异和荧光修饰不同，规避了相邻位点扩增条带的重叠和混淆；且利用abi3730xl全自动dna测序仪进行毛细管电泳检测，可有效提高检测的精确度、准确性和可重复性，有利于大规模和批量化的实验操作。该发明所述方法可为鲢鳙群体遗传和亲子鉴定等相关研究提供可靠的技术支持。

附图说明

图1为本发明所述鲢鳙通用的3组4重pcr体系扩增产物的2.5％琼脂糖凝胶检测结果。

图2为本发明所述鲢鳙通用的3组4重pcr体系扩增产物通过genemapperv4.0软件的读取结果。

图3为实施例1中鲢鳙4个群体的主坐标分析图。

图4为实施例1中鲢鳙180尾个体的主坐标分析图。

图5不同微卫星点数与亲子鉴定成功率对应关系图。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1用于鲢和鳙基于微卫星标记的群体遗传变异分析

(1)于长江下游分别收集鲢和鳙各2个群体，每个群体45尾样本，共计4个群体180个体，并利用酚-氯仿法进行基因组dna提取，经1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，利用紫外分光光度计进行浓度检测，并稀释到50ng/μl，保存于0℃。

(2)基于4个鲢鳙群体共计180个体的dna，利用本发明所述3组荧光修饰的4重pcr体系进行pcr扩增。

(3)对pcr扩增产物随机抽样，经2.5％琼脂糖凝胶电泳合格后，利用abi3730xl全自动dna测序仪进行毛细管电泳检测，基于gs500内标参照，利用genemapperv4.0软件进行扩增条带长度进行读取。

(4)利用excel表整理每一个体对应12个微卫星位点的等位基因型数据，并转换相应格式，利用cervus3.0软件统计各位点在鲢和鳙中的等位基因数(k)、表观杂合度(ho)、期望杂合度(he)和多态信息含量(pic)等遗传参数，结果如表2所示；并利用genalex6.5软件基于4个鲢鳙群体及180尾个体间的遗传距离进行主坐标分析(principalcoordinatesanalysis，pcoa)，结果如图3和图4所示。

根据以上分析结果，可以看出该发明所述的12微卫星位点，能有效用于鲢鳙的群体遗传变异和种质鉴定等研究。

表2鲢鳙12个通用微卫星位点的遗传多样性参数统计

实施例2用于对鳙人工繁殖亲本和子代的亲子鉴定分析

(1)利用12雄和12雌的鳙成熟个体，按照部分因子交配设计(partialfactormatingdesign,gjedrem2005)开展人工繁殖，分成4个交配小组，每组3对亲本，组合内1尾雌鱼(或雄鱼)与2尾雄鱼(或雌鱼)进行人工授精。受精卵混合孵化，并进行常规化鱼苗培育。

(2)亲本和子代的样本采集，在人工繁殖过程中剪取24尾亲本鳍条样本，利用无水乙醇进行固定保存；并采集192尾子代夏花鱼苗(～30日龄)的全鱼，利用无水乙醇进行固定保存。

(3)利用酚-氯仿法对上述24尾亲本和192尾子代样本进行基因组dna提取，经1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，利用紫外分光光度计进行浓度检测，并稀释到50ng/μl，保存于0℃。

(4)基于上述亲本和子代个体的dna，利用发明所述3组荧光修饰的4重pcr体系进行pcr扩增。

(5)对pcr扩增产物随机抽样，经2.5％琼脂糖凝胶电泳合格后，利用abi3730xl全自动dna测序仪进行毛细管电泳检测，基于gs500内标参照，利用genemapperv4.0软件进行扩增条带长度进行读取。

(6)利用excel表整理亲本和子代个体对应12个微卫星位点的等位基因型数据，并转换相应格式，采用cervus3.0软件开展亲子鉴定分析。鉴定结果显示如表3所示，对186尾个体获得准确鉴定(置信度95％)，鉴定成功率为96.88％，鉴定成功个体的系谱关系符合人工繁殖的交配设计方案，准确率达100％。如图5所示，根据不同位点数的分析，发现采用7个以上位点，就可以达到较高的鉴定成功率(90％左右及以上)。因此，该发明所述3组4重pcr体系方法，能够满足鲢鳙遗传育种工作中对系谱构建的需要。

表3鳙亲本和子代的亲子鉴定结果(置信度95％)

然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。

序列表

<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120>一种鲢鳙通用微卫星荧光多重pcr的方法

<141>2018-05-30

<160>24

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>21

<212>dna