本发明属于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定技术领域，具体涉及一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法。
背景技术
微卫星dna是指基因组中由短的重复单元(一般为1～6个碱基)组成的dna串联重复序列，又被称作简单重复序列(simplesequencerepeat,ssrs)，广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，而且分布比较均匀，平均每10kb的dna序列中就会出现一个微卫星序列，再加上ssr的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性，由于ssr的两端有一段保守的dna序列，根据这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物，对ssr进行pcr扩增。
中药牡丹皮(moutancortex)来源于毛茛科植物牡丹(paeoniasuffruticosaandr.)的干燥根皮，具有清热凉血，活血化瘀的功效。
然而现有的药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的过程中仍然存在着一些不合理的因素，现有的药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的不是很准确合理，存在很大的误差，如何为药用牡丹和油用牡丹种质来源区分提供了有效可靠的鉴定手段，以及解决中药牡丹皮的种质来源鉴定方案越来越被重视，为此本发明提供一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，以解决上述背景技术中提出的现有的药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的过程中仍然存在着一些不合理的因素，现有的药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的不是很准确合理，存在很大的误差问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，所述鉴定方法如下：
步骤一：选取药用牡丹和油用牡丹作为验证样本；
步骤二：选择仪器与试药，nas-99分光光度计、bc-submidi电泳槽、bg-power300c电泳电源、1-14离心机、veritypcr仪、凝胶成像仪、dhp-9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、hiseq2500，内切酶haeiii(nebr0108m)、hi-di去离子甲酰胺、pop-7胶、10×buffer(4311320)、platinumtaq酶(thermo，10966026)；
步骤三：引物设计与多态性引物筛选，采用改良ctab法提取样品dna，凝胶电泳检测质量，对合成的44对不同引物进行扩增，
步骤四：将步骤三所述的44对不同引物进行扩增，tp-m13-ssr扩增反应体系为10μl，降落扩增程序；
步骤五：将步骤四所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；
步骤六：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；
步骤七：将步骤六所述筛选后获得5对多态性引物tp-m13-ssr所检测的不同药用牡丹和油用牡丹栽培种质在不同ssr位点的多态性原始数据；
步骤八：观察验证原始测序峰图可以看出，利用筛选的ssr引物对20份不同种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中，tp-m13-ssr扩增反应体系为10μl，包括primers(5um)各0.3μl、10×pcrbuffer1μll、dntp(10mm)0.8μl、taq酶(5u/ul)0.12μl、dna模板1μl以及ddh2o6.48μl。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中，降落扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，起始退火62℃30s，10个循环，其中每个循环下降1℃；94℃再次变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤六中，基于二核苷酸重复序列开发的引物c77878可以较好地区分两种栽培牡丹，不同产地药用牡丹扩增后等位基因长度约为169bp、171bp、173bp、175bp或177bp，二核苷酸重复次数为4-5次，而油用牡丹扩增后等位基因长度约为169bp和171bp，二核苷酸重复次数为1-2次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明结构科学合理，使用安全方便，采用illuminahiseq4000高通量测序平台对5年生药用牡丹“凤丹”根皮转录组进行测序的数据中，对检测到ssr序列进行筛选和引物设计，通过多态性筛选，设计合成m13加尾引物在不同来源药用牡丹和油用牡丹种质样本中进行多态性验证，并对获得的具有多态性产物再次测序，分析其序列长度，开发出一对微卫星分子标记引物，可以较好地应用于鉴别药用牡丹和油用牡丹种质，为药用牡丹和油用牡丹种质来源区分提供了有效可靠的鉴定手段，为解决中药牡丹皮的种质来源鉴定提供了一种新的手段。
附图说明
图1为实验用不同来源药用牡丹和油用牡丹栽培种质一览表；
图2为药用牡丹和油用牡丹多态性引物序列及长度一览表；
图3为药用牡丹与油用牡丹多态性引物统计表；
图4为tp-m13-ssr(c77878)所检测的药用牡丹和油用牡丹种质的ssr位点多态性图，从上至下依次为药用牡丹，油用牡丹；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于药用牡丹和油用牡丹种质鉴定的方法，包括如下步骤：
步骤一：选取药用牡丹和油用牡丹作为验证样本；
步骤二：选择仪器与试药，nas-99分光光度计、bc-submidi电泳槽、bg-power300c电泳电源、1-14离心机、veritypcr仪、凝胶成像仪、dhp-9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、hiseq2500，内切酶haeiii(nebr0108m)、hi-di去离子甲酰胺、pop-7胶、10×buffer(4311320)、platinumtaq酶(thermo，10966026)；
步骤三：引物设计与多态性引物筛选，采用改良ctab法提取样品dna，凝胶电泳检测质量，对合成的44对不同引物进行扩增，
步骤四：将步骤三所述的44对不同引物进行扩增，tp-m13-ssr扩增反应体系为10μl，包括primers(5um)各0.3μl、10×pcrbuffer1μl、dntp(10mm)0.8μl、taq酶(5u/ul)0.12μl、dna模板1μl以及ddh2o6.48μl，降落扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，起始退火62℃30s，10个循环，其中每个循环下降1℃，94℃再次变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存；
步骤五：将步骤四所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；
步骤六：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物，基于二核苷酸重复序列开发的引物c77878可以较好地区分两种栽培牡丹，不同产地药用牡丹扩增后等位基因长度约为169bp、171bp、173bp、175bp或177bp，二核苷酸重复次数为4-5次，而油用牡丹扩增后等位基因长度约为169bp和171bp，二核苷酸重复次数为1-2次；
步骤七：将步骤六所述筛选后获得5对多态性引物tp-m13-ssr所检测的不同药用牡丹和油用牡丹栽培种质在不同ssr位点的多态性原始数据；
步骤八：观察验证原始测序峰图可以看出，利用筛选的ssr引物对20份不同种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小，药用牡丹的栽培品种“凤丹”转录组数据ssr分析结果显示，“凤丹”根皮转录组中ssr种类较为丰富，主要以单核苷酸重复为主，其次是二、三、四核苷酸重复，研究对含有单核苷酸及二、三、四核苷酸重复序列且长度在100-300bp长度范围的基因片段进行加m13接头的引物设计。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。