本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地，本申请提供了一种检测靶核酸序列的方法，所述方法能够同时检测多种靶核酸序列在样品中的存在。此外，本申请还提供了一种探针组，和包含一种或多种所述探针组的试剂盒，所述探针组和试剂盒可用于实施本发明的方法。
背景技术：
实时pcr是用于检测核酸的一种常用方法，其操作简便，应用广泛。并且，通过利用多重实时pcr，可在单个反应管内同时检测多个靶序列，这不仅提高了检测效率，也降低了成本。在实时pcr方法中，可通过使用荧光标记的寡核苷酸探针来对靶序列进行检测。一般而言，荧光标记的探针特异性地与用于pcr扩增的两条引物之间的靶序列结合，以避免由引物二聚体的非特异性扩增而导致的干扰信号，提高检测结果的特异性。对于多重实时pcr而言，当使用多种靶序列特异性的寡核苷酸探针时，可使用不同的荧光基团标记每一个寡核苷酸探针，由此，通过检测每一个探针所携带的独特荧光信号，可以检测每一个探针所特异性识别的靶序列。在实时pcr方法中，可通过两种模式来对靶序列进行检测，即，实时检测模式和扩增后的熔解曲线分析(也称为post-pcrmca模式)。在实时检测模式中，靶序列的检测和pcr扩增同时进行，无需进行额外的步骤。因此，实时检测模式简便直接。但是，这种模式在单轮检测中能检测的最大靶序列的数目受限于实时pcr仪器的荧光检测通道的数目，一般不超过6个。在mca模式中，需要在pcr扩增后进行一个额外的步骤，即，分析由探针与靶序列构成的双链体的熔点。mca模式可通过荧光颜色和/或熔点来识别或区分靶序列。因此，mca模式虽然相对较为繁琐(即，增加了一个额外的步骤)，但其在单轮检测中能检测的最大靶序列的数目有所提高。然而，基于荧光探针检测的多重实时pcr也存在一些问题。首先，荧光探针的制备涉及复杂的化学修饰和纯化过程，其成本大大高于非标记探针。因此，多个荧光探针的使用会导致检测成本的增加。其次，在多重实时pcr法中，多个荧光探针的共存会使反应体系的背景荧光增加，这进而可导致检测灵敏度的下降。因此，需要对多重实时pcr法进行改进，以期通过尽可能少的荧光探针来检测尽可能多的靶序列。faltin等人(clinicalchemistry2012,58(11):1546-1556)描述了一种基于“媒介子探针”的实时pcr检测方法。在传统的实时pcr检测方法中，针对每一个靶序列，均需要使用一个靶序列特异的荧光探针。然而，在faltin等人报道的方法中，针对每一个靶序列，需要使用两个探针：一个非荧光标记的靶序列特异的媒介子探针，以及另一个不与靶序列结合的荧光标记的探针(荧光探针)；其中，媒介子探针由位于3'-端的靶特异性序列和位于5'-端的标签序列(媒介子)组成；荧光探针由包含媒介子杂交位点的3'-端单链序列以及包含淬灭基团和荧光基团的、具有发夹结构的5'-端序列构成，淬灭基团和荧光基团均位于发夹结构的臂上且相互靠近，从而发生荧光淬灭。在pcr过程中，媒介子探针通过靶特异性序列与靶序列结合，并且其5'-端的标签序列(媒介子)保持单链游离状态；随后，媒介子探针在具有5'-核酸酶活性的dna聚合酶的作用下发生酶切，释放出带有3'-oh的媒介子。随后，释放的媒介子结合至荧光探针中的媒介子杂交位点，并被聚合酶延伸，导致标记有淬灭基团的序列被切除或被置换，进而造成荧光基团与淬灭基团的分离，引起荧光强度的增加。faltin等人描述的方法的特点在于，荧光信号的产生依赖于两个探针：媒介子探针和荧光探针；其中，媒介子探针用作杂交探针，本身是非荧光标记的；荧光探针用于产生荧光信号，其与媒介子特异性结合，但不与靶序列结合。在该方法中，荧光探针可被用作通用探针。例如，当使用单重实时pcr来检测多个靶序列时，可以使用各自携带独特的靶特异性序列但含有相同的媒介子序列的多个媒介子探针以及一个相同的荧光探针来分别进行pcr反应。此外，对于多重实时pcr而言，当无需识别或区分每一个靶序列时，也可以使用具有相同媒介子序列的多个媒介子探针和一个荧光探针来实现多个靶序列的筛查。与传统的实时pcr方法相比，faltin等人的方法可以使用一个通用的荧光探针来对多个靶序列进行检测，而无需针对每一个靶序列合成一个独特的荧光探针，这显著降低了检测成本。然而，faltin等人的方法也存在着明显的缺陷。特别地，当将faltin等人的方法用于进行需要区分每一个靶序列的多重实时pcr时，针对每一个靶序列都需要设计一个携带靶特异性序列的媒介子探针和一个对应的、带有独特荧光信号的荧光探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时pcr相比，faltin等人的方法需要使用双倍数目的探针。相应地，整个反应体系变得更为复杂，检测成本也变得更高。例如，faltin等人公开了同时检测hpv18和人类actb基因的双重pcr法，其中使用了2条媒介子探针和2条荧光探针；相比之下，传统的双重实时pcr法仅需要使用2条荧光探针。类似的例子还见于wadles等人(biotechniques2016,61(3):123-8)，其中描述了一个五重pcr体系，该体系共使用了5条媒介子探针和5条荧光报告探针。相比之下，传统的五重实时pcr法仅需要使用5条荧光探针。在这种情况下，与传统多重实时pcr相比，faltin等人的方法更加复杂，并且成本高昂。us2013/0109588a1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时pcr测定，其与faltin等人的方法类似，通过两条探针(pto探针，其对应于媒介子探针；和cto探针，其对应于荧光探针)来实现对靶序列的检测。相应地，us2013/0109588a1的方法具有与faltin等人的方法相似的优点和缺点。特别地，当将该专利申请中描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时pcr时，针对每一个靶序列需要分别设计一条pto探针和一条cto探针；即，使用双倍数目的探针。例如，该专利申请描述了同时检测奈瑟氏淋球菌和金黄色葡萄球菌的双重实时pcr，其中即使用了2条pto探针和2条cto探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时pcr相比，us2013/0109588a1的方法更加复杂，并且成本高昂。us2014/0057264a1公开了另一种使用两个探针的实时pcr方法。在该方法中，荧光信号是因标记探针的切割而产生的，因此，该方法仅能用于实时检测模式，而不能用于mca模式。此外，与faltin等人的方法类似，当将us2014/0057264a1中描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时pcr时，针对每一个靶序列需要分别设计两条探针，这导致反应体系更加复杂，并且成本高昂。us2015/0072887a1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时pcr测定，其通过3条探针来实现对靶序列的检测。然而，当将该专利申请描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时pcr时，针对每一个靶序列需要分别设计3条探针，这导致反应体系更加复杂，并且成本高昂。类似的使用3条探针的实时pcr测定还公开于us2015/0167060a1和us2016/0060690a1中。然而，这些方法与us2015/0072887a1中公开的方法类似，在用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时pcr时，比传统实时pcr法更复杂且成本更高。总的来说，与传统实时pcr法相比，使用两条或三条探针的经改良的实时pcr方法(例如faltin等人的方法)在实施单重实时pcr或者无需识别或区分每一个靶序列的多重实时pcr时，具有显著的优点：即，可使用携带相同媒介子序列但不同靶特异性序列的多条媒介子探针以及一条通用的荧光探针，从而可显著降低检测成本。但是，当实施需要区分每一个靶序列的多重实时pcr时，这些经改良的实时pcr方法就需要使用双倍乃至三倍数目的探针，反而比传统实时pcr法更加复杂，成本更高。因此，需要开发新的实时pcr测定方法，以便能够以更简单的反应体系、更低的检测成本来实施需要区分每一个靶序列的多重实时pcr。技术实现要素：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中所使用的，术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”是指待检测的目标核酸序列。在本申请中，术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”具有相同的含义，并且可互换使用。如本文中所使用的，术语“媒介子探针”是指，从5'至3'方向含有媒介子序列(mediatorsequence)和靶向序列(targetingsequence；即，靶特异性序列)的单链核酸分子。在本申请中，媒介子序列不含与靶核酸序列互补的序列，靶特异性序列包含与靶核酸序列互补的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，媒介子探针通过靶特异性序列与靶核酸序列杂交或退火(即，形成双链结构)，并且媒介子探针中的媒介子序列不与所述靶核酸序列杂交，而处于游离状态(即，保持单链结构)。如本文中所使用的，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”是指，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，能够与靶核酸序列选择性/特异性杂交或退火的序列，其包含与靶核酸序列互补的序列。在本申请中，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”具有相同的含义，并且可互换使用。易于理解的是，靶向序列或靶特异性序列对于靶核酸序列是特异性的。换言之，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，靶向序列或靶特异性序列仅与特定的靶核酸序列杂交或退火，而不与其他的核酸序列杂交或退火。如本文中所使用的，术语“媒介子序列”是指，媒介子探针中不与靶核酸序列互补的一段寡核苷酸序列，其位于靶特异性序列的上游(5'端)。在本申请中，针对每一种靶核酸序列，设计或提供一条独特的媒介子探针，其具有独特的媒介子序列(换言之，所使用的所有媒介子探针中的媒介子序列彼此不同)；由此，每一种靶核酸序列与一条独特的媒介子探针(独特的媒介子序列)相对应。因此，通过检测所述独特的媒介子序列，可以检测与之相对应的靶核酸序列。如本文中所使用的，术语“上游寡核苷酸序列”是指，包含与靶核酸序列互补的序列的一段寡核苷酸序列，其在允许核酸杂交(或退火)或扩增的条件下，能够与靶核酸序列杂交(或退火)，并且，当与靶核酸序列杂交时，其位于媒介子探针的上游。如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(waston-crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。例如，在本申请中，上游寡核苷酸序列和媒介子探针中的靶特异性序列各自包含与靶核酸序列互补(例如实质上互补或完全互补)的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，上游寡核苷酸序列和媒介子探针中的靶特异性序列将选择性地/特异性地与靶核酸序列杂交或退火。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。例如，在本申请中，媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列。因此，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，媒介子序列不与靶核酸序列杂交或退火，无法形成双链体，而是处于游离状态(即，保持单链结构)。如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。如本文中所使用的，“允许核酸杂交的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，并且可通过常规的方法来确定。例如，具有互补序列的两条核酸分子可在合适的杂交条件下发生杂交。此类杂交条件可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的ph值、成分和离子强度等，并且可根据互补的两条核酸分子的长度和gc含量来确定。例如，当互补的两条核酸分子的长度相对较短和/或gc含量相对较低时，可采用低严紧的杂交条件。当互补的两条核酸分子的长度相对较长和/或gc含量相对较高时，可采用高严紧的杂交条件。此类杂交条件是本领域技术人员熟知的，并且可参见例如josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)；和m.l.m.anderson,nucleicacidhybridization,springer-verlagnewyorkinc.n.y.(1999)。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。相应地，表述“允许核酸杂交的条件”和“允许核酸退火的条件”也具有相同的含义，并且可互换使用。如本文中所使用的，表述“允许核酸扩增的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，允许核酸聚合酶(例如dna聚合酶)以一条核酸链为模板合成另一条核酸链，并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的，并且可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的ph值、成分、浓度和离子强度等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001))。在本发明的方法中，“允许核酸扩增的条件”优选地为核酸聚合酶(例如dna聚合酶)的工作条件。如本文中所使用的，表述“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，允许核酸聚合酶(例如dna聚合酶)以一条核酸链为模板延伸另一条核酸链(例如引物或探针)，并形成双链体的条件。此类条件是本领域技术人员熟知的，并且可涉及下列因素：温度，杂交缓冲液的ph值、成分、浓度和离子强度等等。可通过常规方法来确定合适的核酸扩增条件(参见例如josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001))。在本发明的方法中，“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”优选地为核酸聚合酶(例如dna聚合酶)的工作条件。在本申请中，表述“允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件”和“允许核酸延伸的条件”具有相同的含义，并且可互换使用。如本文中所使用的，表述“允许切割媒介子探针的条件”是指，允许具有5'核酸酶活性的酶切割杂交至靶核酸序列上的媒介子探针，并释放出含有媒介子序列或其部分的核酸片段的条件。在本发明的方法中，允许切割媒介子探针的条件优选地为具有5'核酸酶活性的酶的工作条件。例如，当使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶时，允许切割媒介子探针的条件可以为所述核酸聚合酶的工作条件。各种酶的工作条件可由本领域技术人员通过常规方法确定，并且通常可涉及下列因素：温度，缓冲液的ph值，成分，浓度，离子强度等。备选地，可使用酶的制造商所推荐的条件。如本文中所使用的，术语“核酸变性”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，双链核酸分子解离为单链的过程。表述“允许核酸变性的条件”是指，使得双链核酸分子解离为单链的条件。此类条件可由本领域技术人员常规地确定(参见例如josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001))。例如，可通过加热，碱处理，尿素处理，酶促方法(例如使用解旋酶的方法)等常规技术来使核酸变性。在本申请中，优选地，在加热的条件下使核酸变性。例如，可通过加热至80-105℃，从而使核酸变性。如本文中所使用的，术语“上游”用于描述两条核酸序列(或两个核酸分子)的相对位置关系，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，表述“一条核酸序列位于另一条核酸序列的上游”意指，当以5'至3'方向排列时，与后者相比，前者位于更靠前的位置(即，更接近5'端的位置)。如本文中所使用的，术语“下游”具有与“上游”相反的含义。如本文中所使用的，术语“荧光探针“是指携带荧光基团、且能够产生荧光信号的一段寡核苷酸。在本申请中，荧光探针被用作检测探针。如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如thejournalofmoleculardiagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(tm值)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的tm值就越高。因此，通过检测双链体的tm值，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“tm值”具有相同的含义，并且可互换使用。检测方法因此，在一个方面，本发明提供了一种检测至少两种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其包括以下步骤：(1)在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与第一上游寡核苷酸序列、第一媒介子探针、第二上游寡核苷酸序列和第二媒介子探针接触，其中，(i)所述第一上游寡核苷酸序列包含与第一靶核酸序列互补的序列；并且，所述第一媒介子探针从5'至3'方向包含第一媒介子序列和第一靶特异性序列，其中，所述第一媒介子序列包含不与第一靶核酸序列互补的序列，并且，所述第一靶特异性序列包含与第一靶核酸序列互补的序列；并且，当与第一靶核酸序列杂交时，第一上游寡核苷酸序列位于第一靶特异性序列的上游；(ii)所述第二上游寡核苷酸序列包含与第二靶核酸序列互补的序列；并且，所述第二媒介子探针从5'至3'方向包含第二媒介子序列和第二靶特异性序列，其中，所述第二媒介子序列包含不与第二靶核酸序列互补的序列，并且，所述第二靶特异性序列包含与第二靶核酸序列互补的序列；并且，当与第二靶核酸序列杂交时，第二上游寡核苷酸序列位于第二靶特异性序列的上游；并且，(iii)所述第一媒介子序列与所述第二媒介子序列不同；并且，(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；(3)在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与检测探针接触，所述检测探针从3'至5'方向包含，与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列，与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列，以及模板序列(templatingsequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述第一靶核酸序列和第二靶核酸序列是否存在于所述样品中。在本发明方法的步骤(1)中，由于所述第一上游寡核苷酸序列包含与第一靶核酸序列互补的序列，并且所述第一靶特异性序列包含与第一靶核酸序列互补的序列，因此，当存在第一靶核酸序列时，所述第一上游寡核苷酸序列和所述第一媒介子探针都与所述第一靶核酸序列杂交。类似地，由于所述第二上游寡核苷酸序列包含与第二靶核酸序列互补的序列，并且所述第二靶特异性序列包含与第二靶核酸序列互补的序列，因此，当存在第二靶核酸序列时，所述第二上游寡核苷酸序列和所述第二媒介子探针都与所述第二靶核酸序列杂交。在本发明方法的步骤(2)中，当存在第一靶核酸序列时，所述第一上游寡核苷酸序列和所述第一媒介子探针都与所述第一靶核酸序列杂交。进一步，由于所述第一媒介子序列包含不与第一靶核酸序列互补的序列，因此，第一媒介子探针中的第一媒介子序列处于游离状态，而不与第一靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，第一媒介子序列或其部分会因第一上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第一靶核酸序列杂交的第一媒介子探针上切割下来，形成第一媒介子片段。类似地，当存在第二靶核酸序列时，第二上游寡核苷酸序列和第二媒介子探针都与第二靶核酸序列杂交，并且第二媒介子探针中的第二媒介子序列处于游离状态，而不与第二靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，第二媒介子序列或其部分会因第二上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第二靶核酸序列杂交的第二媒介子探针上切割下来，形成第二媒介子片段。在本发明方法的步骤(3)中，当存在第一媒介子片段时，由于第一媒介子片段包含第一媒介子序列或其部分，且检测探针包含与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列，因此，所述第一媒介子片段与所述检测探针杂交。类似地，当存在第二媒介子片段时，由于第二媒介子片段包含第二媒介子序列或其部分，且检测探针包含与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列，因此，所述第二媒介子片段与所述检测探针杂交。在本发明方法的步骤(4)中，当存在第一媒介子片段时，由于所述第一媒介子片段与所述检测探针杂交，并且所述检测探针包含额外的序列(例如，模板序列)，因此，核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第一媒介子片段，形成第一双链体。类似地，当存在第二媒介子片段时，由于所述第二媒介子片段与所述检测探针杂交，并且所述检测探针包含额外的序列(例如，模板序列)，因此，核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第二媒介子片段，形成第二双链体。在本发明方法的步骤(5)中，当存在第一双链体时，可检测到与第一双链体对应的熔解峰。因此，可通过与第一双链体对应的熔解峰的存在或不存在，确定第一靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。例如，当检测到或未检测到与第一双链体对应的熔解峰时，确定第一靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。类似地，可通过与第二双链体对应的熔解峰的存在或不存在，确定第二靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。例如，当检测到或未检测到与第二双链体对应的熔解峰时，确定第二靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。特别地，在本发明的方法中，由于所使用的第一媒介子序列与第二媒介子序列不同，因此，所形成的第一媒介子片段与第二媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体在结构(序列)上也不同于包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体。相应地，第一双链体将具有与第二双链体不同的熔点(tm值)。因此，在熔解曲线分析中，第一双链体显示出与第二双链体不同的熔解峰。由此，通过检测第一双链体或第二双链体的熔解峰，可判断第一靶核酸序列或第二靶核酸序列在样品中的存在。另外，由于第一媒介子序列、第二媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算第一双链体与第二双链体各自的熔点(tm值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有第一双链体或第二双链体的熔点(tm值)的熔解峰，可判断第一靶核酸序列或第二靶核酸序列在样品中的存在。基于与上述相同的原理，通过设计更多的媒介子探针，本发明的方法可用于同时检测更多的靶核酸序列。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了第一上游寡核苷酸序列、第一媒介子探针、第二上游寡核苷酸序列和第二媒介子探针之外，还在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与第三上游寡核苷酸序列和第三媒介子探针接触，其中，所述第三上游寡核苷酸序列包含与第三靶核酸序列互补的序列；并且，所述第三媒介子探针从5'至3'方向包含第三媒介子序列和第三靶特异性序列，其中，所述第三媒介子序列包含不与第三靶核酸序列互补的序列，并且，所述第三靶特异性序列包含与第三靶核酸序列互补的序列；并且，当与第三靶核酸序列杂交时，第三上游寡核苷酸序列位于第三靶特异性序列的上游；并且，所述第三媒介子序列与所述第一和第二媒介子序列不同；并且，在步骤(3)中，所使用的检测探针还包含与第三媒介子序列或其部分互补的第三捕获序列，其位于所述模板序列的下游。在此类实施方案中，在步骤(1)中，当存在第三靶核酸序列时，所述第三上游寡核苷酸序列和所述第三媒介子探针与所述第三靶核酸序列杂交。进一步，在步骤(2)中，当存在第三靶核酸序列时，第三媒介子序列或其部分因第三上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第三靶核酸序列杂交的第三媒介子探针上切割下来，形成第三媒介子片段。进一步，在步骤(3)和(4)中，当存在第三媒介子片段时，所述第三媒介子片段与所述检测探针杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第三媒介子片段，形成第三双链体。更进一步，在步骤(5)中，当检测到或未检测到与第三双链体对应的熔解峰时，确定第三靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。类似地，在本发明的方法中，由于所使用的第一、第二和第三媒介子序列不同，因此，所形成的第一媒介子片段、第二媒介子片段和第三媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体、包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体、包含第三媒介子片段的延伸产物和检测探针的第三双链体在结构(序列)上彼此不同。相应地，所述第一、第二和第三双链体具有彼此不同的熔点(tm值)。因此，在熔解曲线分析中，所述第一、第二和第三双链体显示出彼此可区分的三个熔解峰。由此，通过检测第一、第二和第三双链体的熔解峰，可判断第一、第二和第三靶核酸序列在样品中的存在。另外，由于第一、第二、和第三媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算第一、第二和第三双链体各自的熔点(tm值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有第一、第二或第三双链体的熔点(tm值)的熔解峰，可判断第一、第二或第三靶核酸序列在样品中的存在。在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了第一上游寡核苷酸序列、第一媒介子探针、第二上游寡核苷酸序列、第二媒介子探针、第三上游寡核苷酸序列和第三媒介子探针之外，还将所述样品与第四上游寡核苷酸序列和第四媒介子探针接触，其中，所述第四上游寡核苷酸序列包含与第四靶核酸序列互补的序列；并且，所述第四媒介子探针从5'至3'方向包含第四媒介子序列和第四靶特异性序列，其中，所述第四媒介子序列包含不与第四靶核酸序列互补的序列，并且，所述第四靶特异性序列包含与第四靶核酸序列互补的序列；并且，当与第四靶核酸序列杂交时，第四上游寡核苷酸序列位于第四靶特异性序列的上游；并且，所述第四媒介子序列与所述第一、第二和第三媒介子序列不同；并且，在步骤(3)中，所使用的检测探针还包含与第四媒介子序列或其部分互补的第四捕获序列，其位于所述模板序列的下游。在此类实施方案中，在步骤(1)中，当存在第四靶核酸序列时，所述第四上游寡核苷酸序列和所述第四媒介子探针与所述第四靶核酸序列杂交。进一步，在步骤(2)中，当存在第四靶核酸序列时，第四媒介子序列或其部分因第四上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从与第四靶核酸序列杂交的第四媒介子探针上切割下来，形成第四媒介子片段。进一步，在步骤(3)和(4)中，当存在第四媒介子片段时，所述第四媒介子片段与所述检测探针杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸第四媒介子片段，形成第四双链体。更进一步，在步骤(5)中，当检测到或未检测到与第四双链体对应的熔解峰时，确定第四靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。类似地，在本发明的方法中，由于所使用的第一、第二、第三和第四媒介子序列不同，因此，所形成的第一媒介子片段、第二媒介子片段、第三媒介子片段和第四媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，包含第一媒介子片段的延伸产物和检测探针的第一双链体、包含第二媒介子片段的延伸产物和检测探针的第二双链体、包含第三媒介子片段的延伸产物和检测探针的第三双链体、包含第四媒介子片段的延伸产物和检测探针的第四双链体在结构(序列)上彼此不同。相应地，所述第一、第二、第三和第四双链体具有彼此不同的熔点(tm值)。因此，在熔解曲线分析中，所述第一、第二、第三和第四双链体显示出彼此可区分的四个熔解峰。由此，通过检测第一、第二、第三和第四双链体的熔解峰，可判断第一、第二、第三和第四靶核酸序列在样品中的存在。另外，由于第一、第二、第三和第四媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算第一、第二、第三和第四双链体各自的熔点(tm值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有第一、第二、第三或第四双链体的熔点(tm值)的熔解峰，可判断第一、第二、第三或第四靶核酸序列在样品中的存在。类似地，可使用更多的上游寡核苷酸序列和更多的媒介子探针来实施本发明的方法。例如，在某些实施方案中，可使用至少5种上游寡核苷酸序列、至少5种媒介子探针以及一种检测探针来实施本发明的方法，其中，每一种上游寡核苷酸序列包含与一种靶核酸序列互补的序列；并且，每一种媒介子探针从5'至3'方向包含一种媒介子序列和一种靶特异性序列，其中，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与一种靶核酸序列互补的序列；由此，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列和媒介子探针均能够与该靶核酸序列杂交；并且，当与该靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述媒介子探针的靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，所述检测探针包含模板序列，以及位于所述模板序列的下游、且分别与每一种媒介子探针中的媒介子序列或其部分互补的多个序列。在此类实施方案中，本发明的方法可用于同时检测至少5种靶核酸序列。在某些实施方案中，本发明的方法可使用至少6种上游寡核苷酸序列、至少6种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少7种上游寡核苷酸序列、至少7种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少8种上游寡核苷酸序列、至少8种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少9种上游寡核苷酸序列、至少9种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少10种上游寡核苷酸序列、至少10种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少12种上游寡核苷酸序列、至少12种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少15种上游寡核苷酸序列、至少15种媒介子探针以及一种检测探针；优选地，至少20种上游寡核苷酸序列、至少20种媒介子探针以及一种检测探针；其中，所述上游寡核苷酸序列、媒介子探针以及检测探针如上文所定义。在此类实施方案中，本发明的方法可用于同时检测至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种靶核酸序列。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其中，n为≥2的整数(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；(3)在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与检测探针接触，所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templatingsequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。在此类实施方案的步骤(1)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列(即，包含与该靶核酸序列互补的序列的上游寡核苷酸序列)，以及与该靶核酸序列对应的媒介子探针(即，其靶特异性序列包含与该靶核酸序列互补的序列的媒介子探针)都与该靶核酸序列杂交。进一步，在此类实施方案的步骤(2)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列以及媒介子探针都与该靶核酸序列杂交，但是所述媒介子探针中的媒介子序列处于游离状态，而不与该靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，所述媒介子探针(与该靶核酸序列对应的媒介子探针)中的媒介子序列或其部分因与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从所述媒介子探针上切割下来，形成与该靶核酸序列对应的媒介子片段。进一步，在此类实施方案的步骤(3)和(4)中，当存在与某一种靶核酸序列对应的媒介子片段时，所述媒介子片段与所述检测探针杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述检测探针为模板，延伸所述媒介子片段，形成与所述靶核酸序列对应的双链体。更进一步，在此类实施方案的步骤(5)中，当检测到或未检测到与某一种靶核酸序列对应的双链体的熔解峰时，确定所述靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。特别地，在此类实施方案中，由于所使用的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同，因此，所形成的每一种媒介子片段具有不同的序列，并且杂交至所述检测探针的不同位置。由此，由媒介子片段的延伸产物和检测探针构成的每一种双链体具有彼此不同的结构(序列)。相应地，每一种双链体具有彼此不同的熔点(tm值)。因此，在熔解曲线分析中，每一种双链体显示出彼此不同的熔解峰。由此，通过检测某一种双链体的熔解峰，可判断与该双链体对应的靶核酸序列在样品中的存在。另外，由于每一种媒介子序列以及检测探针的序列均是已知的或预先确定的，因此，可以预先计算每一种双链体各自的熔点(tm值)。由此，通过在熔解曲线分析中检测具有某一种双链体的熔点(tm值)的熔解峰，可判断与该双链体对应的靶核酸序列在样品中的存在。以上针对本发明方法的基本原理进行了简要概述，现参照本发明方法的各个步骤，对本发明方法进行详细的阐释和举例说明。关于步骤(1)和(2)在本发明的方法中，样品中的靶核酸序列(例如第一或第二靶核酸序列；如果存在的话)首先与对应的上游寡核苷酸序列(例如第一或第二上游寡核苷酸序列)和对应的媒介子探针(例如第一或第二媒介子探针)杂交。在本发明的方法中，样品可以是任何待检测的样品。例如，在某些优选的实施方案中，样品包含或是dna(例如基因组dna或cdna)。在某些优选的实施方案中，样品包含或者是rna(例如mrna)。在某些优选的实施方案中，样品包含或者是核酸的混合物(例如dna的混合物，rna的混合物，或者dna和rna的混合物)。在本发明的方法中，待检测的靶核酸序列不受限于其序列组成或长度。例如，所述靶核酸序列可以是dna(例如基因组dna或cdna)或rna分子(例如mrna)。此外，待检测的靶核酸序列可以是单链的或双链的。当待检测的样品或靶核酸序列为mrna时，优选地，在进行本发明的方法之前，进行逆转录反应，以获得与所述mrna互补的cdna。关于逆转录反应的详细描述可参见例如，josephsam-brook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)。待检测的样品或靶核酸序列可获自任何来源，包括但不限于原核生物，真核生物(例如原生动物，寄生虫，真菌，酵母，植物，动物包括哺乳动物和人类)或病毒(例如herpes病毒，hiv，流感病毒，eb病毒，肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒等)或类病毒。待检测的样品或靶核酸序列还可以是任何形式的核酸序列，例如基因组序列，人工分离或片段化的序列，合成的序列等。在本发明的某些实施方案中，媒介子探针可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，媒介子探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。在本发明的方法中，媒介子探针不受其长度的限制。例如，媒介子探针的长度可以为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。媒介子探针中的靶特异性序列可以是任何长度，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。例如，媒介子探针中的靶特异性序列的长度可以为10-140nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。媒介子探针中的媒介子序列可以是任何长度，只要其能够与检测探针特异性杂交并进行延伸。例如，媒介子探针中的媒介子序列的长度可以为5-140nt，例如5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt。在某些优选的实施方案中，媒介子探针中的靶特异性序列的长度为10-100nt(例如，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)，并且，媒介子序列的长度为5-100nt(例如，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)。在某些优选的实施方案中，媒介子探针具有3'-oh末端。在某些优选的实施方案中，媒介子探针的3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如媒介子探针)的3'-末端。例如，可通过对媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-oh进行修饰，以封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭媒介子探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将媒介子探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭媒介子探针的3'-末端。在本发明的某些实施方案中，上游寡核苷酸序列可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，上游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。在本发明的方法中，上游寡核苷酸序列不受其长度的限制，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。例如，上游寡核苷酸序列的长度可以为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。在本发明的方法中，允许核酸杂交的条件可由本领域技术人员常规地确定。例如，可根据待检测的靶核酸序列、所使用的上游寡核苷酸序列、媒介子探针中的靶特异性序列确定合适的杂交条件。在本发明的某些实施方案中，所述允许核酸杂交的条件是这样的严紧条件，其使得上游寡核苷酸序列以及媒介子探针中的靶特异性序列通过碱基互补配对与对应的靶核酸序列杂交，并且，媒介子探针中的媒介子序列不与所述靶核酸序列杂交。在某些优选的实施方案中，在高严紧条件下，将样品与各种上游寡核苷酸序列和各种媒介子探针接触。在本发明的方法中，在将样品与各种上游寡核苷酸序列和各种媒介子探针接触后，需要诱导媒介子探针的切割，以释放含有媒介子序列或其部分的片段(即，媒介子片段)。在一般情况下，可使用具有5'核酸酶活性的酶，利用与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸序列或其延伸产物，诱导与靶核酸序列杂交的媒介子探针的切割。特别地，在步骤(1)中，当媒介子探针与靶核酸序列接触时，其所包含的靶特异性序列与靶核酸序列杂交并形成双链结构，而媒介子序列不与靶核酸序列杂交，保持单链结构。因此，可利用具有5'核酸酶活性的酶来切割这种包含双链结构和单链结构的寡核苷酸，并释放具有单链结构的片段。在本发明的某些实施方案中，可通过两种方式来诱导媒介子探针的切割：(a)不依赖于上游寡核苷酸序列的延伸的方式；和(b)依赖于上游寡核苷酸序列的延伸的方式。特别地，在上游寡核苷酸序列和媒介子探针与靶核酸序列杂交后，如果上游寡核苷酸序列和媒介子探针足够接近，使得具有5'核酸酶活性的酶能够诱导对媒介子探针的切割，那么所述酶将结合至上游寡核苷酸序列，并切割媒介子探针，而无需进行延伸反应(即，方式a)。相反地，在与靶核酸序列杂交后，如果上游寡核苷酸序列远离媒介子探针，那么先使用核酸聚合酶，以靶核酸序列为模板，催化上游寡核苷酸序列的延伸，随后具有5'核酸酶活性的酶结合至上游寡核苷酸序列的延伸产物，并切割媒介子探针(即，方式b)。因此，在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游邻近。在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列直接诱导具有5'核酸酶活性的酶切割媒介子探针，而无需进行延伸反应。因此，在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游探针，其以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。如本文中所使用的，术语“邻近”意欲表示，两条核酸序列彼此相邻，形成缺口。在某些优选的实施方案中，邻近的两条核酸序列(例如，上游寡核苷酸序列和媒介子探针)相距不超过30nt，例如不超过20nt，例如不超过15nt，例如不超过10nt，例如不超过5nt，例如4nt，3nt，2nt，1nt。在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游寡核苷酸序列与媒介子探针的靶特异性序列具有部分重叠的序列。在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列直接诱导具有5'核酸酶活性的酶切割媒介子探针，而无需进行延伸反应。因此，在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的上游探针，其以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。在某些优选的实施方案中，所述部分重叠的序列的长度为1-10nt，例如1-5nt，或1-3nt。在某些优选的实施方案中，在与靶核酸序列杂交后，上游寡核苷酸序列位于媒介子探针的上游远端。在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列被核酸聚合酶延伸，随后所产生的延伸产物诱导具有5'核酸酶活性的酶切割媒介子探针。因此，在此类实施方案中，上游寡核苷酸序列即为特异于靶核酸序列的引物，其用于起始延伸反应，并以依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。如本文中所使用的，术语“远端”意欲表示，两条核酸序列彼此远离，例如相距至少30nt，至少50nt，至少80nt，至少100nt或更长。因此，在某些优选的实施方案中，所述上游寡核苷酸序列为特异于靶核酸序列的引物或者特异于靶核酸序列的探针。所述引物适合于以依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。所述探针适合于以不依赖于延伸的方式诱导媒介子探针的切割。利用上游寡核苷酸来诱导切割下游寡核苷酸的各种方法是本领域技术人员已知的，并且可用于本发明。关于此类方法的详细描述可参见例如，美国专利5,210,015,5,487,972,5,691,142,5,994,069和7,381,532，以及美国申请us2008/0241838。在某些实施方案中，媒介子探针上的切割位点位于媒介子序列与靶特异性序列的连接处(即，与靶核酸杂交的序列和不与靶核酸杂交的序列的连接处)。在此类实施方案中，酶对媒介子探针的切割将释放出包含完整媒介子序列的片段。在某些实施方案中，媒介子探针上的切割位点位于媒介子序列的3'-末端区域内(即，位于媒介子序列的3'-末端的上游，且例如距离媒介子序列的3'-末端数个核苷酸，例如1-3个核苷酸)。在此类实施方案中，酶对媒介子探针的切割将释放出包含媒介子序列的一部分(5'-末端部分)的片段。因此，在本发明的某些实施方案中，媒介子片段包含完整的媒介子序列，或者媒介子序列的一部分(5'-末端部分)，例如包含媒介子序列的5'-末端的至少5nt，至少8nt，至少10nt，至少20nt，至少30nt，至少40nt，至少50nt，例如5-50nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt。在本申请中，可使用各种具有5'核酸酶活性的酶来实施本发明的方法。在某些优选的实施方案中，所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'外切核酸酶活性的酶。在某些优选的实施方案中，所述具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性(例如5'外切核酸酶活性)的核酸聚合酶(例如，dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶)。在某些实施方案中，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶的使用是特别有利的，因为所述聚合酶既能够以靶核酸序列为模板，催化上游寡核苷酸序列的延伸，而且能够诱导媒介子探针的切割。在某些优选的实施方案中，具有5'核酸酶活性的dna聚合酶为热稳定的dna聚合酶，其可获自各种细菌物种，例如，thermusaquaticus(taq),thermusthermophiles(tth),thermusfiliformis,thermisflavus,thermococcusliteralis,thermusantranildanii,thermuscaldophllus,thermuschliarophilus,thermusflavus,thermusigniterrae,thermuslacteus,thermusoshimai,thermusruber,thermusrubens,thermusscotoductus,thermussilvanus,thermusthermophllus,thermotogamaritima,thermotoganeapolitana,thermosiphoafricanus,thermococcuslitoralis,thermococcusbarossi,thermococcusgorgonarius,thermotogamaritima,thermotoganeapolitana,thermosiphoafricanus,pyrococcuswoesei,pyrococcushorikoshii,pyrococcusabyssi,pyrodictiumoccultum,aquifexpyrophilus和aquifexaeolieus。特别优选地，所述具有5'核酸酶活性的dna聚合酶为taq聚合酶。备选地，在步骤(2)中，可使用两种不同的酶：核酸聚合酶和具有5'核酸酶活性的酶。在此类实施方案中，核酸聚合酶用于以靶核酸序列为模板催化上游寡核苷酸序列的延伸，且具有5'核酸酶活性的酶结合至上游寡核苷酸序列的延伸产物，并催化媒介子探针的切割。在某些优选的实施方案中，在步骤(1)和/或(2)中，还将样品与特异于靶核酸序列的下游寡核苷酸序列(或下游引物)接触。在某些实施方案中，核酸聚合酶和下游寡核苷酸序列(或下游引物)的使用是特别有利的。特别地，核酸聚合酶能够以靶核酸序列为模板，以上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列为引物，产生额外的靶核酸序列，从而可提高本发明方法的灵敏度。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，除了上文所定义的上游寡核苷酸序列和媒介子探针之外，针对待检测的每一种靶核酸序列，还提供一种下游寡核苷酸序列；其中，所述下游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述下游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的下游；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针和下游寡核苷酸序列接触。例如，当本发明的方法用于检测第一和第二靶核酸序列时，可提供第一和第二下游寡核苷酸序列，其分别包含与第一和第二靶核酸序列互补的序列。类似地，可针对第三靶核酸序列提供第三下游寡核苷酸序列，其包含与第三靶核酸序列互补的序列。还可针对第四靶核酸序列提供第四下游寡核苷酸序列，其包含与第四靶核酸序列互补的序列。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，将步骤(1)的产物与核酸聚合酶(特别优选地，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶)接触。在进一步优选的实施方案中，在允许核酸扩增的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触。在此类实施方案中，核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物，对靶核酸序列进行扩增。并且，在靶核酸的扩增过程中，核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性，诱导对杂交至靶核酸序列的媒介子探针的切割，从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。可使用各种具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶来实施本发明的方法，特别是上文所描述的那些核酸聚合酶。在本申请中，特别优选地，所使用的核酸聚合酶为模板依赖性核酸聚合酶(例如模板依赖性dna聚合酶)。在本发明的某些实施方案中，下游寡核苷酸序列可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，下游寡核苷酸序列包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。在本发明的方法中，下游寡核苷酸序列不受其长度的限制，只要其能够与靶核酸序列特异性杂交。例如，下游寡核苷酸序列的长度可以为15-150nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt。在某些优选的实施方案中，以对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，对于某一靶核酸序列，使用等量的上游和下游寡核苷酸序列进行扩增。在某些优选的实施方案中，以不对称扩增的方式对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，对于某一靶核酸序列，使用不等量的上游和下游寡核苷酸序列进行扩增。在某些实施方案中，上游寡核苷酸序列相对于下游寡核苷酸序列而言是过量的(例如过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，例如过量1-10倍)。在某些实施方案中，下游寡核苷酸序列相对于上游寡核苷酸序列而言是过量的(例如过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，例如过量1-10倍)。在某些优选的实施方案中，以三步法对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，每一轮的核酸扩增需要经过三个步骤：在第一温度下进行核酸变性，在第二温度下进行核酸退火，以及在第三温度下进行核酸延伸。在某些优选的实施方案中，以两步法对靶核酸序列进行扩增。在此类实施方案中，每一轮的核酸扩增需要经过两个步骤：在第一温度下进行核酸变性，以及在第二温度下进行核酸退火和延伸。适合于进行核酸变性、核酸退火和核酸延伸的温度可由本领域技术人员通过常规方法容易地确定(参见例如，josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001))。在本发明的方法中，所使用的媒介子探针与靶核酸序列通常是一一对应的。换言之，针对每一种待检测的靶核酸序列，提供了一种独特的媒介子探针。然而，易于理解的是，上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列与靶核酸序列之间并不需要是一一对应的。例如，在某些情况下，所检测的样品为dna文库，并且文库中的所有片段的一端或者两端均包含相同的接头。在此情况下，可以使用相同的上游寡核苷酸序列来进行延伸，或者，可使用相同的上游寡核苷酸序列和/或下游寡核苷酸序列来进行扩增，并进而诱导媒介子探针的切割。因此，在本发明的方法中，针对不同的靶核酸序列，可以使用相同或者不同的上游寡核苷酸序列；和/或，可以使用相同或者不同的下游寡核苷酸序列。例如，第一、第二、第三和第四上游寡核苷酸序列可以是相同或不同的。第一、第二、第三和第四下游寡核苷酸序列也可以是相同或不同的。此外，当在步骤(2)中使用具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶时，还可采用hands策略来提高核酸扩增的效率(参见例如nucleicacidsresearch,1997,25(16):3235-3241)。例如，在某些优选的实施方案中，可在所有的上游寡核苷酸序列和下游寡核苷酸序列的5'端引入一段相同的寡核苷酸序列，随后利用与所述相同的寡核苷酸序列互补的通用引物(其用量通常远远大于上游和下游寡核苷酸序列的用量)来进行扩增。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，所提供的所有上游寡核苷酸序列(例如，第一、第二、第三和第四上游寡核苷酸序列)和下游寡核苷酸序列(例如，第一、第二、第三和第四下游寡核苷酸序列)在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列，并且，还提供一种通用引物，所述通用引物具有与所述相同的寡核苷酸序列互补的序列；然后，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列、媒介子探针、下游寡核苷酸序列和通用引物接触。在某些优选的实施方案中，所述相同的寡核苷酸序列的长度为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。相应地，所述通用引物的长度可以为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。随后，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，将步骤(1)的产物与核酸聚合酶(特别优选地，具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶)接触。在进一步优选的实施方案中，在允许核酸扩增的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶接触。在此类实施方案中，核酸聚合酶将以上游和下游寡核苷酸为引物，对靶核酸序列进行初步扩增，获得初步扩增的产物；随后，利用通用引物对初步扩增的产物进行再次扩增。并且，在整个扩增过程中，核酸聚合酶通过其自身的5'核酸酶活性，切割杂交至靶核酸序列或初步扩增的产物的媒介子探针，从而释放包含媒介子序列或其部分的媒介子片段。在本发明的某些实施方案中，通用引物可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，通用引物包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，通用引物包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，通用引物包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。在本发明的方法中，通用引物不受其长度的限制，只要其能够与上游和下游寡核苷酸序列中包含的所述相同的寡核苷酸序列特异性杂交。例如，通用引物的长度可以为8-50nt，例如8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。关于步骤(3)和(4)在步骤(2)中，具有5'核酸酶活性的酶对杂交至靶核酸序列的媒介子探针进行切割，释放出含有媒介子序列或其部分的媒介子片段，其随后在步骤(3)中与检测探针发生杂交。在本申请中，检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列。由此，在步骤(4)中，在核酸聚合酶的作用下，检测探针用作模板，用于延伸媒介子片段；而媒介子片段用作引物，用于起始延伸反应；并且在延伸反应结束后，媒介子片段的延伸产物与检测探针杂交在一起，形成核酸双链体。在本发明的方法中，检测探针包含与多个媒介子序列或其部分互补的多个捕获序列(例如，与第一媒介子序列或其部分互补的第一捕获序列，与第二媒介子序列或其部分互补的第二捕获序列，与第三媒介子序列或其部分互补的第三捕获序列，和/或与第四媒介子序列或其部分互补的第四捕获序列)。易于理解的是，各个捕获序列可以以任何顺序排列。例如，第一捕获序列可以位于第二捕获序列的上游(5'端)或下游(3'端)。例如，检测探针可以从3'至5'方向依次包含，第一捕获序列和第二捕获序列；或者，第二捕获序列和第一捕获序列。类似地，检测探针可以以任何排列顺序包含其他捕获序列(例如，第一、第二、第三、第四捕获序列)。此外，各个捕获序列可以以任何方式排列。例如各个捕获序列可以以相邻的方式或以间隔有连接序列的方式排列。例如，第一捕获序列可以和第二捕获序列相邻排列；或者，二者之间可间隔有连接序列(在本文中也简称为“接头”)；或者，二者之间可存在重叠。类似地，检测探针可以以任何排列方式包含其他捕获序列(例如，第一、第二、第三、第四捕获序列)。在某些情况下，以重叠的方式排列各个捕获序列是特别有利的。在此类实施方案中，可对多个媒介子序列进行设计，以使不同的媒介子序列包含重叠序列。例如，可以设计第一媒介子序列和第二媒介子序列，使得第一媒介子序列的3'末端部分具有与第二媒介子序列的5'末端部分相同的序列。相应地，在检测探针中，与第一媒介子序列互补的第一捕获序列的5'末端部分具有与第二媒介子序列互补的第二捕获序列的3'末端部分相同的序列。由此，检测探针可以以3'至5'方向包含第一捕获序列和第二捕获序列，并且二者可以以重叠的方式进行排列。在此情况下，重叠的序列即为第一和第二捕获序列共有的相同序列或其部分。通过以重叠的方式排列捕获序列，可使得检测探针在预定的长度内包含更多个捕获序列，从而可以与更多个媒介子片段杂交。换言之，通过以重叠的方式排列捕获序列，单个检测探针可以与更多个媒介子探针组合使用。如上文所描述的，在本发明的方法中，单个检测探针与至少2个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)媒介子探针组合使用。因此，在某些优选的实施方案中，单个检测探针的用量相对于单个媒介子探针是过量的(例如，过量至少1倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍)。此类实施方案在某些情况下是有利的，因为整个反应体系包含足够的检测探针与释放的媒介子片段杂交，介导媒介子片段延伸，并形成双链体。如上文所描述的，媒介子片段可含有完整的媒介子序列或其部分。当媒介子片段包含有完整的媒介子序列时，所述检测探针优选地可包含与所述媒介子序列互补的序列。当媒介子片段包含有媒介子序列的部分(5'-末端部分)时，所述检测探针优选地可包含与所述媒介子序列的部分(5'-末端部分)互补的序列，或者，与完整的媒介子序列互补的序列。在某些优选的实施方案中，所述检测探针包含与所述媒介子序列互补的序列。此类检测探针在某些情况下是特别有利的，因为其既能够与含有完整的媒介子序列的媒介子片段杂交，也能够与含有媒介子序列的部分(5'-末端部分)的媒介子片段杂交。然而，应当理解的是，所述检测探针也可包含仅与媒介子片段的一部分(通常为3'-末端部分)互补的序列，只要检测探针能够与媒介子片段稳定地杂交，并起始延伸反应。此外，除了捕获序列和模板序列之外，检测探针还可在3'端(即，在捕获序列的下游)包含额外的序列。所述额外的序列通常包含不与媒介子片段互补的序列，不参与和媒介子片段的杂交。根据本发明，检测探针中的模板序列可以包含任何序列，并且，其位于各个捕获序列的上游(5'端)，从而可用作模板用于延伸媒介子片段。在某些优选的实施方案中，所述模板序列包含与媒介子探针(媒介子序列和靶特异性序列)不互补的序列。此类模板序列在某些情况下是特别有利的，因为其可以提高媒介子片段与检测探针的杂交特异性，避免媒介子片段杂交至不期望的位置，从而避免产生不期望的双链体。在本发明的某些实施方案中，检测探针可以包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(pna)或锁核酸)，或其任何组合组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含或者由天然的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成。在某些优选的实施方案中，检测探针包含经修饰的核苷酸，例如经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。在某些优选的实施方案中，检测探针包含非天然的核苷酸，例如脱氧次黄嘌呤，肌苷，1-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或锁核酸(lna)。在本发明的方法中，检测探针不受其长度的限制。例如，检测探针的长度可以为15-1000nt，例如15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。检测探针中的捕获序列可以是任何长度，只要其能够与媒介子片段特异性杂交。例如，检测探针中的捕获序列的长度可以为10-500nt，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-150nt，150-200nt，200-250nt，250-300nt，300-350nt，350-400nt，400-450nt，450-500nt。检测探针中的模板序列可以是任何长度，只要其能够用作延伸媒介子片段的模板。例如，检测探针中的模板序列的长度可以为1-900nt，例如1-5nt，5-10nt，10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt。在某些优选的实施方案中，检测探针中的捕获序列的长度为10-200nt(例如，10-190nt，10-180nt，10-150nt，10-140nt，10-130nt，10-120nt，10-100nt，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)，并且，模板序列的长度为5-200nt(例如，10-190nt，10-180nt，10-150nt，10-140nt，10-130nt，10-120nt，10-100nt，10-90nt，10-80nt，10-50nt，10-40nt，10-30nt，10-20nt)。在某些优选的实施方案中，检测探针具有3'-oh末端。在某些优选的实施方案中，检测探针的3'-末端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭核酸(例如检测探针)的3'-末端。例如，可通过对检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh进行修饰，以封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，从而封闭检测探针的3'-末端。在某些实施方案中，可通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。在本发明的方法中，媒介子片段与检测探针杂交，并由此起始核酸聚合酶的延伸反应。虽然未被切割的媒介子探针也能够通过媒介子序列与检测探针杂交，但是媒介子探针还包含靶特异性序列，其位于媒介子序列下游并且不与检测探针杂交(即，处于游离状态)，从而核酸聚合酶不能延伸与检测探针杂交的媒介子探针。如上文所描述的，检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。在某些优选的实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针。在此类实施方案中，当检测探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针不发出信号。进一步，当所述检测探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述检测探针发出信号。此类自淬灭检测探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述检测探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述检测探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述检测探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；而当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在检测探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在检测探针的内部，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在检测探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在检测探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述检测探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针不发出信号；并且，当所述检测探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述检测探针发出信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离，例如10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距不超过80nt，不超过70nt，不超过60nt，不超过50nt，不超过40nt，不超过30nt，或不超过20nt。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团相距至少5nt，至少10nt，至少15nt，或至少20nt。因此，可在检测探针的任何合适的位置标记报告基团和淬灭基团，只要所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号即可。然而，在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的至少一种位于检测探针的末端(例如5'或3'末端)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端或者距离5'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的3'末端或者距离3'末端1-10nt的位置，并且报告基团和淬灭基团相距合适的距离，使得在检测探针与其互补序列杂交之前，淬灭基团能够吸收或淬灭报告基团的信号。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团可相距如上文所定义的距离(例如10-80nt或更长的距离)。在某些优选的实施方案中，报告基团和淬灭基团中的一种位于检测探针的5'末端，并且另一种位于3'末端。在本发明的方法中，所述报告基团和淬灭基团可以是本领域已知的任何合适的基团或分子，其具体实例包括但不限于cy2tm(506),yo-protm-l(509),yoyotm-l(509),calcein(517),fitc(518),fluorxtm(519),alexatm(520),rhodamine110(520),oregongreentm500(522),oregongreentm488(524),ribogreentm(525),rhodaminegreentm(527),rhodamine123(529),magnesiumgreentm(531),calciumgreentm(533),to-protm-l(533),totol(533),joe(548),bodipy530/550(550),dil(565),bodipytmr(568),bodipy558/568(568),bodipy564/570(570),cy3tm(570),alexatm546(570),tritc(572),magnesiumorangetm(575),phycoerythrinr&b(575),rhodaminephalloidin(575),calciumorangetm(576),pyroniny(580),rhodamineb(580),tamra(582),rhodamineredtm(590),cy3.5tm(596),rox(608),calciumcrimsontm(615),alexatm594(615),texasred(615),nilered(628),yo-protm-3(631),yoyotm-3(631),r-phycocyanin(642),c-phycocyanin(648),to-protm-3(660),t0t03(660),diddilc(5)(665),cy5tm(670),thiadicarbocyanine(671),cy5.5(694),hex(556),tet(536),biosearchblue(447),calfluorgold540(544),calfluororange560(559),calfluorred590(591),calfluorred610(610),calfluorred635(637),fam(520),fluorescein(520),fluorescein-c3(520),pulsar650(566),quasar570(667),quasar670(705)，和quasar705(610)。括号中的数字表示最大发射波长，单位为nm。此外，报告基团和淬灭基团的各种合适配对是本领域已知的，参见例如pesceetal.,editors,fluorescencespectroscopy(marceldekker,newyork,1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach(marceldekker,newyork,1970)；berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2ndedition(academicpress,newyork,1971)；griffiths,colorandconstitutionofoiganicmolecules(academicpress,newyork,1976)；bishop,editor,indicators(peigamonpress,oxford,1972)；haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes,eugene,1992)；pringsheim,fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers,newyork,1949)；haugland,r.p.,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,6thedition(molecularprobes,eugene,oreg.,1996)；美国专利3,996,345和4,351,760。在某些优选的实施方案中，所述报告基团为荧光基团。在此类实施方案中，报告基团发出的信号即为荧光，并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如，能够吸收所述荧光的另一荧光分子，或者能够淬灭所述荧光的淬灭剂)。在某些优选的实施方案中，所述荧光基团包括但不限于各种荧光分子，例如alex-350,fam,vic,tet,calgold540,joe,hex,calfluororange560,tamra,calfluorred590,rox,calfluorred610,texasred,calfluorred635,quasar670,cy3,cy5,cy5.5,quasar705等。在某些优选的实施方案中，所述淬灭基团包括但不限于各种淬灭剂，例如dabcyl、bhq(例如bhq-1或者bhq-2)、eclipse、和/或tamra等。在本发明的方法中，还可以对检测探针进行修饰，例如使其具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性。例如，可在检测探针的主链中引入抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-o-氨基丙基修饰，2'-o-烷基修饰，2'-o-烯丙基修饰，2'-o-丁基修饰，和1-(4'-硫代-pd-呋喃核糖基)修饰。在本发明的方法中，检测探针可以是线性的，或者可具有发夹结构。在某些优选的实施方案中，所述检测探针是线性的。在某些优选的实施方案中，所述检测探针具有发夹结构。发夹结构可以是天然的，也可以是人工引入的。此外，可使用本领域中的常规方法来构建具有发夹结构的检测探针。例如，可通过在检测探针的2个末端(5'端和3'端)添加互补的2段寡核苷酸序列，从而使得检测探针可形成发夹结构。在此类实施方案中，互补的2段寡核苷酸序列构成发夹结构的臂(茎)。发夹结构的臂可具有任何期望的长度，例如臂的长度可以是2-15nt，例如3-7nt，4-9nt，5-10nt，6-12nt。此外，在本发明的方法中，步骤(3)中的“杂交”、“核酸杂交”以及“允许核酸杂交的条件”可如上文所定义。使用步骤(3)的产物和核酸聚合酶来进行步骤(4)。在步骤(4)中，在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，核酸聚合酶将以检测探针为模板，对杂交至检测探针的媒介子片段进行延伸，并由此形成双链体。如上文所详细描述的，每一种媒介子探针各自包含独特的媒介子序列，并且在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，释放出包含独特的媒介子序列或其部分的媒介子片段。随后，每一种媒介子片段杂交至检测探针的不同位置(即，与对应的媒介子序列或其部分互补的捕获序列)，被核酸聚合酶延伸，并与检测探针一起形成双链体。由此，针对每一种媒介子探针，当存在其对应的靶序列时，在步骤(4)中将产生一种独特的双链体，其包含检测探针(作为一条链)和对应于该媒介子探针的媒介子片段的延伸产物(作为另一条链)。因此，步骤(4)中所产生的每一种双链体具有彼此不同的结构(序列)，因而具有彼此不同的tm值，并在熔解曲线分析中显示出彼此不同的熔解峰。在某些优选的实施方案中，步骤(4)中所使用的核酸聚合酶为模板依赖性核酸聚合酶(例如，dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶)。在某些优选的实施方案中，所述核酸聚合酶为热稳定的dna聚合酶，其可获自各种细菌物种，例如，thermusaquaticus(taq),thermusthermophiles(tth),thermusfiliformis,thermisflavus,thermococcusliteralis,thermusantranildanii,thermuscaldophllus,thermuschliarophilus,thermusflavus,thermusigniterrae,thermuslacteus,thermusoshimai,thermusruber,thermusrubens,thermusscotoductus,thermussilvanus,thermusthermophllus,thermotogamaritima,thermotoganeapolitana,thermosiphoafricanus,thermococcuslitoralis,thermococcusbarossi,thermococcusgorgonarius,thermotogamaritima,thermotoganeapolitana,thermosiphoafricanus,pyrococcuswoesei,pyrococcushorikoshii,pyrococcusabyssi,pyrodictiumoccultum,aquifexpyrophilus和aquifexaeolieus。特别优选地，所述模板依赖性核酸聚合酶为taq聚合酶。在某些优选的实施方案中，步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的酶为具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶，并且与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶相同。在某些优选的实施方案中，步骤(2)中所使用的具有5'核酸酶活性的酶与步骤(4)中所使用的核酸聚合酶是不同的。例如，在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用第一核酸聚合酶来催化上游寡核苷酸序列的延伸，并且使用具有5'核酸酶活性的酶来催化媒介子探针的切割，随后在步骤(4)中使用第二核酸聚合酶来催化媒介子片段的延伸。在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用具有5'核酸酶活性的第一核酸聚合酶来催化上游寡核苷酸序列的延伸以及媒介子探针的切割，随后在步骤(4)中使用第二核酸聚合酶来催化媒介子片段的延伸。然而，特别优选地，在步骤(2)和(4)中使用相同的酶。例如，可使用具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶)，在步骤(2)中催化上游寡核苷酸序列的延伸和媒介子探针的切割，并且在步骤(4)中催化媒介子片段的延伸。在本发明的方法中，可根据需要，重复进行步骤(1)-(4)中的一个或多个步骤。在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(2)的重复进行可产生更多的媒介子片段，用于后续的步骤(即，步骤(3)-(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(3)-(5)。在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(4)的重复进行可产生更多的包含检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体，用于后续的步骤(即，步骤(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(5)。在某些优选的实施方案中，本发明方法的步骤(1)-(4)可通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行：(a)提供一种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列、一种媒介子探针和一种下游寡核苷酸序列；并且，任选地，提供一种通用引物；其中，所述检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物如上文所定义；(b)将待检测的样品与所提供的检测探针，上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；(c)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；(d)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；(e)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和(f)任选地，重复步骤(c)-(e)一次或多次。在此类实施方案中，在步骤(c)中，样品中的所有核酸分子将解离为单链状态；随后，在步骤(d)中，互补的核酸分子(例如，上游寡核苷酸序列与靶核酸序列或下游寡核苷酸序列的延伸产物，下游寡核苷酸序列与靶核酸序列或上游寡核苷酸序列的延伸产物，媒介子探针与靶核酸序列或其扩增产物，媒介子探针或因媒介子探针的切割而产生的媒介子片段与检测探针，通用引物与上游/下游寡核苷酸序列或上游/下游寡核苷酸序列的延伸产物)将退火或杂交在一起，形成双链体；随后，在步骤(e)中，具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶将延伸杂交至靶核酸序列的上游/下游寡核苷酸序列，切割杂交至靶核酸序列的媒介子探针的游离5'末端，延伸杂交至检测探针的媒介子片段，延伸杂交至上游/下游寡核苷酸序列的延伸产物的通用引物。由此，通过步骤(c)-(e)的循环，可实现靶核酸序列的扩增，媒介子探针的切割，以及含有检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体的形成，从而完成本发明方法的步骤(1)-(4)。易于理解的是，核酸聚合酶不会延伸杂交至检测探针的媒介子探针，因为位于媒介子探针3'端的靶特异性序列不能与检测探针杂交，处于游离状态。此外，优选地，媒介子探针的3'端是封闭的，从而可避免媒介子探针的不期望的延伸，例如避免杂交至靶核酸序列或检测探针的媒介子探针的延伸。步骤(c)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中，在步骤(c)中，在80-105℃(例如，80-85℃，85-90℃，90-95℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃，101℃，102℃，103℃，104℃，或105℃)的温度下温育步骤(b)的产物，从而使核酸变性。在某些优选的实施方案中，在步骤(c)中，温育步骤(b)的产物10s-5min，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。步骤(d)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中，在步骤(d)中，在35-70℃(例如，35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70℃)的温度下温育步骤(c)的产物，从而允许核酸退火或杂交。在某些优选的实施方案中，在步骤(d)中，温育步骤(c)的产物10s-5min，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min。步骤(e)的温育时间和温度可以由本领域技术人员常规地确定。在某些优选的实施方案中，在步骤(e)中，在35-85℃(例如，35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃)的温度下温育步骤(d)的产物，从而允许核酸延伸。在某些优选的实施方案中，在步骤(e)中，温育步骤(d)的产物10s-30min，例如10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min。在某些实施方案中，可在不同的温度下进行步骤(d)和(e)，即在不同的温度下进行核酸的退火和延伸。在某些实施方案中，可在相同的温度下进行步骤(d)和(e)，即在相同的温度下进行核酸的退火和延伸。在此情况下，可将步骤(d)和(e)合并为一个步骤。在本发明的方法中，可重复步骤(c)-(e)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次。在某些情况下，步骤(c)-(e)的多次重复是有利的，因为其能够扩增靶核酸序列，提高检测的灵敏度。然而，易于理解的是，当重复步骤(c)-(e)一次或次时，每一个循环的步骤(c)-(e)所使用的条件不必是相同的。例如，可使用一种条件来进行前5个循环的步骤(c)-(e)，随后使用另一种条件来进行剩余循环的步骤(c)-(e)。步骤(5)在根据本发明方法的步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。如上文所论述的，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。在某些实施方案中，可对步骤(4)的产物进行逐渐的升温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(4)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(4)的产物从45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)逐渐升温至75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。升温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，升温的速率可以为：每步骤升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒升温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。在某些实施方案中，可对步骤(4)的产物进行逐渐的降温并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得步骤(4)的产物的信号强度随着温度变化而变化的曲线。例如，可将步骤(4)的产物从75℃或更高的温度(例如，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃)逐渐降温至45℃或更低的温度(例如，不超过45℃，不超过40℃，不超过35℃，不超过30℃，不超过25℃)，并实时监测检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得所述报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线。降温的速率可以由本领域技术人员常规地确定。例如，降温的速率可以为：每步骤降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)，并且每步骤维持0.5-15s(例如0.5-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s)；或者每秒降温0.01-1℃(例如0.01-0.05℃、0.05-0.1℃、0.1-0.5℃、0.5-1℃、0.04-0.4℃，例如0.01℃、0.02℃、0.03℃、0.04℃、0.05℃、0.06℃、0.07℃、0.08℃、0.09℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃或1.0℃)。随后，可对获得的曲线进行求导，从而获得步骤(4)的产物的熔解曲线。根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，可确定对应于该熔解峰(熔点)的媒介子片段的存在。随后，通过媒介子片段中的媒介子序列与靶核酸序列的对应关系，可确定与所述媒介子片段对应的靶核酸序列的存在。例如，当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第一媒介子片段延伸产物的第一双链体的熔解峰时，可确定第一靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。类似地，当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第二媒介子片段延伸产物的第二双链体的熔解峰时，可确定第二靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第三媒介子片段延伸产物的第三双链体的熔解峰时，可确定第三靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。当熔解曲线分析的结果显示，存在或不存在对应于包含检测探针和第四媒介子片段延伸产物的第四双链体的熔解峰时，可确定第四靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。由此，本发明的方法通过使用一种检测探针和至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)媒介子探针，即可实现对至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)靶核酸序列的同时检测(多重检测)。不拘于理论限制，熔解曲线分析的分辨率或精度可达到0.5℃或更高。换言之，熔解曲线分析能够区分熔点相差仅0.5℃或更低(例如0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃)的两个熔解峰。因此，在本发明方法的某些实施方案中，任意的两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)之间的熔点差异可以为至少0.5℃(例如，通过设计第一媒介子序列、第二媒介子序列以及检测探针的序列)，从而所述任意的两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)可通过熔解曲线分析来区分和辨别。然而，出于便于区分和辨别的目的，两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)的更大的熔点差异在某些情况下是优选的。因此，在本发明方法的某些实施方案中，两个双链体(例如第一双链体与第二双链体)之间的熔点差异可以为任何期望的值(例如至少0.5℃，至少1℃，至少2℃，至少3℃，至少4℃，至少5℃，至少8℃，至少10℃，至少15℃，或至少20℃)，只要所述熔点差异能够通过熔解曲线分析来区分和辨别即可。一种或多种检测探针的同时使用在上文描述的方法中，使用了一种检测探针即实现了对多种靶核酸序列的多重检测。然而，易于理解的是，本发明的方法并不限于所使用的检测探针的数目。本发明的方法可以使用一种或多种检测探针(例如，至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，或更多种检测探针)。并且，基于与上述相同的原理，针对每一种检测探针可设计至少两种或更多种(例如，2种，3种，4种，5种，6种，7种，8种，9种，10种，11种，12种，13种，14种，15种，16种，17种，18种，19种，20种，或更多种检测探针)的媒介子探针，由此，本发明的方法能够用于同时检测多种靶核酸序列的存在，并且本发明方法能够同时检测的靶核酸序列的最大数目远远超过了所使用的检测探针的数目，等于针对每一种检测探针设计的媒介子探针的数目之和(即，所使用的全部媒介子探针的数目)。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其中，n为≥2的整数(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；(3)提供m种检测探针，并且在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触，其中，m为小于n且大于0的整数，并且每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templatingsequence)；并且，所述m种检测探针包含至少n种捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的n种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。在此类实施方案的步骤(1)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列(即，包含与该靶核酸序列互补的序列的上游寡核苷酸序列)，以及与该靶核酸序列对应的媒介子探针(即，其靶特异性序列包含与该靶核酸序列互补的序列的媒介子探针)都与该靶核酸序列杂交。进一步，在此类实施方案的步骤(2)中，当存在某一种靶核酸序列时，与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列以及媒介子探针都与该靶核酸序列杂交，但是所述媒介子探针中的媒介子序列处于游离状态，而不与该靶核酸序列杂交。在这种情况下，在具有5'核酸酶活性的酶的作用下，所述媒介子探针(与该靶核酸序列对应的媒介子探针)中的媒介子序列或其部分因与该靶核酸序列对应的上游寡核苷酸序列或其延伸产物的存在而被从所述媒介子探针上切割下来，形成与该靶核酸序列对应的媒介子片段。进一步，在此类实施方案的步骤(3)和(4)中，当存在与某一种靶核酸序列对应的媒介子片段时，所述媒介子片段与互补的检测探针(即，含有与该媒介子片段中的媒介子序列或其部分互补的捕获序列的检测探针)杂交，并且，所述核酸聚合酶将以所述互补的检测探针为模板，延伸所述媒介子片段，形成与所述靶核酸序列对应的双链体。更进一步，在此类实施方案的步骤(5)中，当检测到或未检测到与某一种靶核酸序列对应的双链体的熔解峰时，确定所述靶核酸序列存在于或不存在于所述样品中。在此类实施方案的步骤(3)中，所述m种检测探针包含至少n种捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的n种媒介子探针的媒介子序列或部分互补；由此，步骤(2)中产生的任一种媒介子片段都能够与至少一种检测探针(其包含与该媒介子片段中的媒介子序列或其部分互补的捕获序列)杂交，并形成双链体，用于后续的延伸和检测。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针包含n种捕获序列，其分别与n种媒介子探针的媒介子序列或部分互补。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针彼此之间不包含相同的捕获序列。在此情况下，针对每一种媒介子探针，有且仅有一种检测探针(其包含与该媒介子探针中的媒介子序列互补的捕获序列)与源自该媒介子探针的媒介子片段杂交，并且在延伸反应后，仅产生一种双链体。随后，通过在步骤(5)中检测该双链体的存在，可判断与所述媒介子探针对应的靶核酸序列的存在。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针彼此之间可以包含相同的捕获序列。在此情况下，针对每一种媒介子探针，可能存在一种或多种的检测探针(其都包含与该媒介子探针中的媒介子序列互补的捕获序列)与源自该媒介子探针的媒介子片段杂交，并且在延伸反应后，产生一种或多种的双链体。随后，通过在步骤(5)中检测所述一种或多种的双链体的存在，可判断与所述媒介子探针对应的靶核酸序列的存在。在此类实施方案的步骤(5)中，可通过双链体的熔点和/或检测探针中的报告基团来对双链体进行区分和辨别。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针包含相同的报告基团。在此情况下，可对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一双链体的存在，进而确定与该双链体对应的靶核酸序列的存在。在某些优选的实施方案中，所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同。在此情况下，当对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时，可分别实时监测每一种报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线。随后，可根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一双链体的存在，进而确定与该双链体对应的靶核酸序列的存在。在某些示例性实施方案中，可使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种检测探针(也即，m为≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥8、≥10的整数)。在某些示例性实施方案中，可使用1-6种检测探针(也即，m为1-6的整数；例如，m为1、2、3、4、5或6)。进一步优选地，所使用的检测探针各自标记有不同的报告基团。例如，在某些示例性实施方案中，本发明的方法可使用第一和第二检测探针，其分别标记有第一报告基团和第二报告基团。由此，在步骤(5)中，分别实时监测第一报告基团和第二报告基团的信号随温度的变化，从而获得第一熔解曲线和第二熔解曲线。随后，根据第一(或第二)熔解曲线中的熔解峰，可判断包含第一(或第二)检测探针的双链体的存在，并进而确定对应于与第一(或第二)检测探针杂交的媒介子片段的靶核酸序列的存在。在某些示例性实施方案中，本发明的方法使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、或至少10种检测探针；以及，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少8种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种媒介子探针。由此，本发明的方法可实现对多种靶核酸序列的同时检测(多重检测)，其中可检测的靶核酸序列的最大数目等于所使用的媒介子探针的数目。例如，在本申请的实施例6中，本发明的方法使用3种检测探针和20种媒介子探针，实现了对20种靶核酸序列的同时检测(二十重检测)。还易于理解的是，针对使用一种检测探针的方法而详细描述的各种技术特征同样可应用于使用两种或更多种检测探针的方法。例如，上文针对待检测的样品、靶核酸序列、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、检测探针、允许核酸杂交的条件、允许切割媒介子探针的条件、具有5'核酸酶活性的酶、允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件、核酸聚合酶、熔解曲线分析、步骤的重复等所作的各种详细描述均可应用于使用两种或更多种检测探针的方法。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的使用两种或更多种检测探针的方法可涉及如上文所详细描述的任一项或多项技术特征，或所述技术特征的任何组合。例如，如上文所描述的，可根据需要，重复进行步骤(1)-(4)中的一个或多个步骤。在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(2)的重复进行可产生更多的媒介子片段，用于后续的步骤(即，步骤(3)-(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(2)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(3)-(5)。在某些优选的实施方案中，重复进行步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤。易于理解，步骤(1)-(4)的重复进行可产生更多的包含检测探针和媒介子片段的延伸产物的双链体，用于后续的步骤(即，步骤(5))。因此，在某些优选的实施方案中，通过下列方案来进行本发明的方法：重复步骤(1)-(4)一次或多次，并且在每一次重复之前，进行一次核酸变性的步骤；随后进行步骤(5)。在某些优选的实施方案中，本发明方法的步骤(1)-(4)可通过包含下述步骤(a)-(f)的方案来进行：(a)提供m种检测探针，并且针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列、一种媒介子探针和一种下游寡核苷酸序列；并且，任选地，提供一种通用引物；其中，所述检测探针、媒介子探针、上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列和通用引物如上文所定义；(b)将待检测的样品与所提供的检测探针，上游寡核苷酸序列，媒介子探针和下游寡核苷酸序列，以及具有5'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶(例如，dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶)混合；并且任选地，添加通用引物；(c)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；(d)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；(e)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和(f)任选地，重复步骤(c)-(e)一次或多次。关于步骤(a)-(f)，其已详细描述于上文中。探针组和试剂盒在另一个方面，本发明提供了一种探针组(probeset)，其包含一种检测探针，以及至少两种的媒介子探针，其中，所述媒介子探针各自独立地从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述靶特异性序列包含与一种靶核酸序列互补的序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；和所述检测探针从3'至5'方向包含，与每一种媒介子序列或其部分互补的捕获序列，以及模板序列(templatingsequence)；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。在某些优选的实施方案中，所述探针组包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、或至少20种媒介子探针。在某些优选的实施方案中，所有媒介子探针各自靶向不同的靶核酸序列。在某些优选的实施方案中，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；并且，所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。易于理解的是，此类探针组可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对媒介子探针和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于探针组中的媒介子探针和检测探针。因此，在某些优选的实施方案中，所述探针组包含如上文所定义的媒介子探针。在某些优选的实施方案中，所述探针组包含如上文所定义的检测探针。在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含一种或多种如上文所定义的探针组。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种探针组。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针包含相同的报告基团。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒中的所有检测探针所包含的报告基团彼此不同。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含1-6种探针组。优选地，所述试剂盒中的所有检测探针所包含的报告基团彼此不同。进一步优选地，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同，并且，所述试剂盒中的所有媒介子探针所包含的靶特异性序列彼此不同。易于理解的是，此类试剂盒可用于实施上文所详细描述的本发明方法。因此，上文针对媒介子探针和检测探针所详细描述的各种技术特征同样可应用于试剂盒中的媒介子探针和检测探针。并且，此类试剂盒还可包含实施本发明方法所需的其他试剂。例如，在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含如上文所定义的上游寡核苷酸序列、下游寡核苷酸序列、通用引物、具有5'核酸酶活性的酶、核酸聚合酶、或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还可包含，用于进行核酸杂交的试剂、用于进行媒介子探针切割的试剂、用于进行核酸延伸的试剂、用于进行核酸扩增的试剂、或其任何组合。此类试剂可由本领域技术人员常规地确定，并且包括但不限于，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dntps、水、包含离子(例如mg2+)的溶液、单链dna结合蛋白(singlestranddna-bindingprotein，ssb)、或其任何组合。本领域技术人员基于本申请所详细描述的原理，可对本发明技术方案的各种技术特征进行修饰、替换或组合，而不背离本发明的精神和范围。所有此类技术方案以及其变形都涵盖在本申请的权利要求书或其等同物的范围内。发明的有益效果与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：(1)本发明的方法能够在仅使用一种标记探针(即，检测探针)的情况下，实现对多种靶核酸序列的同时检测(多重检测)。(2)本发明的方法能够实现对多种靶核酸序列的同时检测(多重检测)，并且能够同时检测靶核酸序列的最大数目远远超出了所使用的标记探针(即，检测探针)的数目。因此，本发明提供了一种简单、高效、低成本的多重检测法。本发明方法能够检测的靶核酸序列的最大数目不受限于所使用的标记探针(即，检测探针)的数目。也即，本发明方法能够基于相对有限数目的标记探针(即，检测探针)实现对显著更多数量的靶核酸序列的同时检测(多重检测)，这是特别有利的。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明图1示意性地描述了本发明方法的示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。图1a示意性地描述了使用1种检测探针和5种媒介子探针来检测5种靶核酸分子的示例性实施方案。在该实施方案中，提供一种自淬灭检测探针(其携带荧光基团和淬灭基团)，并且针对每一种靶核酸分子(t1-t5)，分别设计并提供一条上游引物(上游引物1-5)，一条下游引物(下游引物1-5)，以及一条媒介子探针(媒介子探针1-5)；其中，每一条媒介子探针各自包含一个独特的媒介子序列(媒介子序列1-5)，其能够与所述检测探针杂交。每一个媒介子序列与所述检测探针杂交的位置是独特的，但彼此可存在重叠区域。例如，如图1a所显示的，媒介子序列1在检测探针上的杂交位置与媒介子序列2存在重叠，媒介子序列4在检测探针上的杂交位置与媒介子序列5存在重叠，而媒介子序列3在检测探针上的杂交位置与其他媒介子序列均不存在重叠。在检测过程中，5种上游引物、5种下游引物、5种媒介子探针分别与各自对应的靶核酸分子杂交(退火)；随后，在核酸聚合酶的作用下，所有的上游引物和下游引物分别被延伸，并且每一种上游引物(上游引物1-5)的延伸导致对应的媒介子探针(媒介子探针1-5)被具有5'核酸酶活性的酶切割，从而释放出媒介子片段(媒介子片段1-5)；随后，媒介子片段1-5分别杂交至检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生5种延伸产物；这5种延伸产物各自具有不同的长度，并且与检测探针一起形成了5种具有不同tm值的双链体。由此，通过熔解曲线分析，可确定具有特定tm值的双链体的存在，并进而可确定与该双链体对应的靶核酸分子的存在。因此，在本发明的方法中，可使用1种检测探针和5种媒介子探针实现对5种靶核酸分子的检测。图1b示意性地描述了使用2种检测探针和10种媒介子探针来检测10种靶核酸分子(t1-t10)的示例性实施方案。在该实施方案中，提供两种自淬灭检测探针(第一和第二检测探针)，其各自携带不同的荧光基团(荧光基团1-2)和不同的淬灭基团(淬灭基团1-2)；并且针对每一种靶核酸分子(t1-t10)，分别设计并提供一条上游引物(上游引物1-10)，一条下游引物(下游引物1-10)，以及一条媒介子探针(媒介子探针1-10)；其中，每一条媒介子探针各自包含一个独特的媒介子序列(媒介子序列1-10)，并且媒介子序列1-5能够与第一检测探针杂交，媒介子序列6-10能够与第二检测探针杂交。每一个媒介子序列与检测探针杂交的位置是独特的，但彼此可存在重叠区域。例如，如图1b所显示的，媒介子序列1在第一检测探针上的杂交位置与媒介子序列2存在重叠，媒介子序列4在第一检测探针上的杂交位置与媒介子序列5存在重叠，媒介子序列3在第一检测探针上的杂交位置与其他媒介子序列均不存在重叠；媒介子序列6在第二检测探针上的杂交位置与媒介子序列7在重叠，媒介子序列9在第二检测探针上的杂交位置与媒介子序列10存在重叠，媒介子序列8在第二检测探针上的杂交位置与其他媒介子序列均不存在重叠。在检测过程中，10种上游引物、10种下游引物、10种媒介子探针分别与各自对应的靶核酸分子杂交(退火)；随后，在核酸聚合酶的作用下，所有的上游引物和下游引物分别被延伸，并且每一种上游引物(上游引物1-10)的延伸导致对应的媒介子探针(媒介子探针1-10)被具有5'核酸酶活性的酶切割，从而释放出媒介子片段(媒介子片段1-10)；随后，媒介子片段1-5分别杂交至第一检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生5种延伸产物；这5种延伸产物各自具有不同的长度，并且与第一检测探针一起形成了5种具有不同tm值的双链体。类似地，媒介子片段6-10分别杂交至第二检测探针的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生另外的5种延伸产物；这5种延伸产物各自具有不同的长度，并且与第二检测探针一起形成了另外5种具有不同tm值的双链体。随后，分别利用第一和第二检测探针上的荧光基团(荧光基团1-2)进行熔解曲线分析，可确定具有特定tm值的双链体的存在，并进而可确定与该双链体对应的靶核酸分子的存在。因此，在本发明的方法中，可使用2种检测探针和10种媒介子探针实现对10种靶核酸分子的检测。图2显示了使用媒介子探针braf-mp1和线性荧光探针up-l2的4个实时pcr反应的扩增曲线，其中，反应a使用具有5'→3'外切酶活性的taqdna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图2a)；反应b使用具有5'→3'外切酶活性taqdna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图2b)；反应c使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图2c)；反应d使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图2d)；并且，在图2a-2d中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图3显示了使用媒介子探针braf-mp1和具有发夹结构的荧光探针up-mb的4个实时pcr反应的扩增曲线，其中，反应a使用具有5'→3'外切酶活性的taqdna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图3a)；反应b使用具有5'→3'外切酶活性taqdna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图3b)；反应c使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图3c)；反应d使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图3d)；并且，在图3a-3d中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图4显示了使用媒介子探针braf-mp1以及荧光探针up-l2(图4a)或up-mb(图4b)的4个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线，其中，图4a的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-l2和聚合酶taq；图4b的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，在图4a-4b的测定中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图5显示了使用媒介子探针(braf-mp1、braf-mp2、或braf-mp3)以及线性荧光探针up-l2的3个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，图5a的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-l2和聚合酶taq；图5b的测定使用了媒介子探针braf-mp2、荧光探针up-l2和聚合酶taq；图5c的测定使用了媒介子探针braf-mp3、荧光探针up-l2和聚合酶taq；并且，在图5a-5c的测定中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图6显示了使用媒介子探针(braf-mp1、braf-mp2、或braf-mp3)以及发夹荧光探针up-mb的3个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，图6a的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-mb和聚合酶taq；图6b的测定使用了媒介子探针braf-mp2、荧光探针up-mb和聚合酶taq；图6c的测定使用了媒介子探针braf-mp3、荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，在图6a-6c的测定中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图7显示了以指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna为模板的5个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针braf-mp2、发夹荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图8显示了以对称扩增(图8a)或不对称扩增(图8b)方式进行的实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针braf-mp2、发夹荧光探针up-mb、聚合酶taq和指定用量(100ng、10ng、1ng或100pg)的293t细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图9显示了以两步法(图9a)或三步法(图9b)进行扩增的实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针braf-mp2、发夹荧光探针up-mb、聚合酶taq以及指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图10显示了以携带野生型kras基因或突变型kras基因的质粒或水为模板的3个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针kras-mp2、发夹荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，图中的黑色实线表示以携带野生型kras基因的质粒为模板的实验结果；灰色实线表示以携带突变型kras基因的质粒为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图11显示了使用2条媒介子探针和1条荧光探针的实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用4条引物(braf-f、braf-r、kras-f和kras-r)、2条媒介子探针(braf-mp2和kras-mp3)、发夹荧光探针up-mb、聚合酶taq以及指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图12显示了使用4条媒介子探针和1条荧光探针的实时pcr反应的熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用表4中描述的9条引物、4条媒介子探针、1条荧光探针、聚合酶taqhs以及指定用量(100ng、10ng、1ng、或100pg)的获自正常男性的细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图13显示了使用20条媒介子探针和6条荧光探针的83个实时pcr反应的熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用表5中描述的41条引物、20条媒介子探针、6条荧光探针、聚合酶taqhs以及获自正常男性的细胞基因组dna(共计83份样品)；图13a表示获自rox检测通道的熔解曲线；图13b表示获自fam检测通道的熔解曲线；图13c表示获自cy5检测通道的熔解曲线；并且，图中的实线表示以细胞基因组dna(83份样品)为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图14显示了利用二十重post-pcrmca测定对92份样品进行检测所获得的代表性实验结果；其中，黑色实线表示的是以y染色体上出现了微缺失的男性的细胞基因组dna为模板的实验结果；灰色实线表示的是以正常男性的细胞基因组dna为模板的实验结果；黑色虚线表示的是以正常女性的细胞基因组dna为模板的实验结果；灰色虚线表示的是以水为模板的实验结果。具体实施方式现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。应当理解的是，这些实施例只是用于说明本发明的原理和技术效果，而并不是表示本发明的所有可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数。本领域技术人员可以根据本发明的原理，利用其它类似的材料或反应条件来实施其他技术方案。此类技术方案没有脱离本发明描述的基本原理和概念，并且涵盖在本发明的范围内。实施例1.使用媒介子探针和荧光探针的实时pcr测定在本实施例中，以braf基因为示例性的待检靶序列，建立了一种使用媒介子探针和荧光探针的实时pcr测定，并评估了线性荧光探针和发夹荧光探针(即，具有发夹结构的荧光探针)用于所述实时pcr测定的效果。所使用的荧光探针(线性或发夹)均为自淬灭荧光探针，其一端标记有荧光基团(例如rox)，另一端标记有淬灭基团(例如bhq2)。简言之，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr，所述pcr反应体系包括1×buffera(67mmtris-hcl,16.6mm(nh4)2so4,6.7μmedta和0.085mg/mlbsa)，3.0mmmgcl2，0.2mmdntps，2.0u的聚合酶taq(岭兰生物科技有限公司，上海)或klentaq1(abbioscience，英国)，各400nm的上游引物和下游引物，0或200nm的媒介子探针，200nm的荧光探针(线性或发夹)，0.1μl单链结合蛋白(singlestranddna-bindingprotein，ssb)，以及5μl的293t细胞基因组dna。实时pcr的反应条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s和61℃，1min)；并且，在61℃采集荧光。所使用的实验仪器为bio-radcfx96实时pcr仪(bio-rad，美国)。所使用的引物和探针均由上海生物工程有限公司合成。所使用的引物和探针的序列示于表1中。表1：所使用的引物和探针的序列注：-c7nh2用于封闭媒介子探针的3'-oh(下同)。实验结果如图2-3所示。图2显示了使用媒介子探针braf-mp1和线性荧光探针up-l2的4个实时pcr反应的扩增曲线，其中，反应a使用具有5'→3'外切酶活性的taqdna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图2a)；反应b使用具有5'→3'外切酶活性taqdna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图2b)；反应c使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图2c)；反应d使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图2d)；并且，在图2a-2d中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图2的结果显示，只有反应a产生了实时pcr荧光信号，反应b、c和d均无荧光信号产生。这些结果表明，在使用具有5'→3'外切酶活性的聚合酶(例如taq聚合酶)的情况下，可使用媒介子探针和线性荧光探针来进行实时pcr。图3显示了使用媒介子探针braf-mp1和具有发夹结构的荧光探针up-mb的4个实时pcr反应的扩增曲线，其中，反应a使用具有5'→3'外切酶活性的taqdna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图3a)；反应b使用具有5'→3'外切酶活性taqdna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图3b)；反应c使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及200nm的媒介子探针(图3c)；反应d使用不具有5'→3'外切酶活性的klentaq1dna聚合酶以及0nm的媒介子探针(图3d)；并且，在图3a-3d中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图3的结果显示，只有反应a产生了实时pcr荧光信号，反应b、c和d均无荧光信号产生。这些结果表明，在使用具有5'→3'外切酶活性的聚合酶(例如taq聚合酶)的情况下，可使用媒介子探针和具有发夹结构的荧光探针来进行实时pcr。实施例2.使用媒介子探针和荧光探针的post-pcrmca测定在本实施例中，以braf基因为示例性的待检靶序列，评估了线性荧光探针和发夹荧光探针用于post-pcrmca法的效果。如实施例1中所述，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr。所使用的pcr反应体系与实施例1相同。所使用的pcr反应条件为：95℃，5min；50个循环的(95℃，20s和61℃，1min)；和35℃，10min；并且，在61℃采集荧光。在pcr完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；45℃，2min；随后按0.5℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从45℃升温至95℃，并在此过程中采集荧光信号。实验结果如图4所示。图4显示了使用媒介子探针braf-mp1以及荧光探针up-l2(图4a)或up-mb(图4b)的4个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线，其中，图4a的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-l2和聚合酶taq；图4b的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，在图4a-4b的测定中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图4的结果显示，当使用包含媒介子探针和荧光探针(线性或发夹)的反应体系来进行实时pcr以及随后的mca时，在实验组中，均可在78℃左右检测到目标峰。这些结果表明，可使用媒介子探针和荧光探针(线性或发夹)来进行post-pcrmca测定。另外，图4的结果还显示，当使用线性荧光探针进行mca测定时，可在60℃左右检测到非特异性峰(其代表由媒介子探针与线性荧光探针形成的双链体)。相比之下，当使用发夹荧光探针进行mca测定时，该非特异性峰显著减弱。这些结果表明，发夹荧光探针具有比线性荧光探针更好的特异性。因此，在某些情况下，发夹荧光探针可能是优选的。实施例3.媒介子序列的长度的选择在本实施例中，设计并合成了具有不同长度的媒介子序列的多条媒介子探针，并利用实施例2中描述的方法，评估了媒介子序列的长度对post-pcrmca测定的影响。简言之，设计并合成了3条媒介子探针，其所包含的媒介子序列的长度分别为19，15和13个碱基。这3条媒介子探针的具体序列如表2所示。表2：媒介子探针的序列媒介子探针序列(5′→3′)seqidno:braf-mp1aaatcgttctgggctctacgctacagtgaaatctcgatggagtgggtcc-c7nh23braf-mp2aaatcgttctgggctctacagtgaaatctcgatggagtgggtcc-c7nh26braf-mp3aaatcgttctgggcagtgaaatctcgatggagtgggtcc-c7nh27如实施例2中所述，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr以及随后的mca测定。除了所使用的媒介子探针外，所使用的pcr反应体系、pcr反应条件以及mca测定条件均与实施例2相同。实验结果如图5-6所示。图5显示了使用媒介子探针(braf-mp1、braf-mp2、或braf-mp3)以及线性荧光探针up-l2的3个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，图5a的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-l2和聚合酶taq；图5b的测定使用了媒介子探针braf-mp2、荧光探针up-l2和聚合酶taq；图5c的测定使用了媒介子探针braf-mp3、荧光探针up-l2和聚合酶taq；并且，在图5a-5c的测定中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图6显示了使用媒介子探针(braf-mp1、braf-mp2、或braf-mp3)以及发夹荧光探针up-mb的3个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，图6a的测定使用了媒介子探针braf-mp1、荧光探针up-mb和聚合酶taq；图6b的测定使用了媒介子探针braf-mp2、荧光探针up-mb和聚合酶taq；图6c的测定使用了媒介子探针braf-mp3、荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，在图6a-6c的测定中，实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图5-6的结果显示，三种具有不同长度的媒介子序列的媒介子探针与荧光探针(线性或发夹)一起，均可用于进行post-pcrmca测定。因此，这些结果表明，可根据实际需要，选择各种合适长度的媒介子探针来实施post-pcrmca测定法。另外，图5-6的结果还显示，随着媒介子探针的媒介子长度缩短，非特异性峰的tm值逐渐减小，且信号强度不断降低。因此，可根据实际需要，对媒介子探针的媒介子长度进行适度的优化，以减少非特异性峰的干扰。此外，图5-6的结果还显示，当使用线性荧光探针进行mca测定时，可检测到非特异性峰(其代表由媒介子探针与线性荧光探针形成的双链体)。相比之下，当使用发夹荧光探针进行mca测定时，该非特异性峰的信号显著减弱或甚至不存在。这些结果表明，发夹荧光探针具有比线性荧光探针更好的特异性，能够更有效地克服因媒介子探针与荧光探针之间杂交而导致的非特异性峰的干扰。因此，在某些情况下，发夹荧光探针可能是优选的。实施例4.基于媒介子探针与发夹荧光探针的post-pcrmca测定的灵敏度在本实施例中，考察了基于媒介子探针和发夹荧光探针的post-pcrmca测定的灵敏度。简言之，如实施例2中所述，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr以及随后的mca测定，其中，所使用的媒介子探针为braf-mp2，所使用的荧光探针为up-mb，所使用的聚合酶为taq，所使用的模板为293t细胞基因组dna(其用量为100ng、10ng、1ng、100pg或10pg，每个用量设置3个重复)。除了基因组dna的用量外，所使用的pcr反应体系、pcr反应条件以及mca测定条件均与实施例2相同。结果如图7所示。图7显示了以指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna为模板的5个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针braf-mp2、发夹荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图7的结果显示，在使用低至10pg的基因组dna作为模板的情况下，基于媒介子探针和荧光探针的post-pcrmca测定仍然能够检测到特异性目的峰。这表明，所述post-pcrmca测定的灵敏度极高，可以用于检测单个人类基因组。实施例5.pcr扩增条件的选择在本实施例中，评估了pcr扩增条件对基于媒介子探针和发夹荧光探针的post-pcrmca测定的影响。(1)对称扩增与不对称扩增简言之，如实施例4中所述，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr以及随后的mca测定，其中，所使用的媒介子探针为braf-mp2，所使用的荧光探针为up-mb，所使用的聚合酶为taq，所使用的模板为指定用量(100ng、10ng、1ng或100pg)的293t细胞基因组dna。除了引物的浓度外，所使用的pcr反应体系、pcr反应条件以及mca测定条件均与实施例4相同。在对称pcr中，所使用的引物为，浓度各自为400nm的上游引物和下游引物。在不对称pcr中，所使用的引物为，800nm的上游引物(该引物与探针反向，即其延伸产物与探针结合)和80nm的下游引物。实验结果如图8所示。图8显示了以对称扩增(图8a)或不对称扩增(图8b)方式进行的实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针braf-mp2、发夹荧光探针up-mb、聚合酶taq和指定用量(100ng、10ng、1ng或100pg)的293t细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图8的结果显示，在对称扩增或不对称扩增的条件下，基于媒介子探针和荧光探针的post-pcrmca测定都能够检测到特异性目的峰；并且在两种条件下，pcr的cq值和mca测定所产生的特异性峰都无显著差别。因此，在所述的post-pcrmca测定中，可以以对称或不对称的方式来进行pcr扩增。(2)两步法pcr与三步法pcr简言之，如实施例4中所述，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr以及随后的mca测定，其中，所使用的媒介子探针为braf-mp2，所使用的荧光探针为up-mb，所使用的聚合酶为taq，所使用的模板为指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna。除了pcr反应的条件外，所使用的pcr反应体系以及mca测定条件均与实施例4相同。两步法pcr所使用的扩增条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s和61℃，1min)。三步法pcr所使用的扩增条件为：95℃，5min；然后50个循环的(95℃，20s；61℃，40s；和72℃，20s)。实验结果如图9所示。图9显示了以两步法(图9a)或三步法(图9b)进行扩增的实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针braf-mp2、发夹荧光探针up-mb、聚合酶taq以及指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图9的结果显示，在两步法pcr或三步法pcr的条件下，基于媒介子探针和荧光探针的post-pcrmca测定都能够检测到特异性目的峰。此外，图9的结果还显示，在两步法pcr的条件下，所述post-pcrmca测定可用于检测低至10pg的基因组dna；在三步法pcr的条件下，所述post-pcrmca测定可用于检测低至100pg的基因组dna。这些结果表明，在所述的post-pcrmca测定中，可以以两步法或三步法的方式来进行pcr扩增；并且，当使用两步法来进行pcr扩增时，所述post-pcrmca测定具有更高的灵敏度。实施例6.靶序列变异对基于媒介子探针与发夹荧光探针的post-pcrmca测定的影响基于媒介子探针和发夹荧光探针的post-pcrmca测定的一个特点是，所检测到的熔点由媒介子序列与荧光探针决定，而与靶序列无关。因此，即使所要检测的靶序列中存在变异，导致靶序列与媒介子探针中的靶特异性序列不是完全匹配(例如存在一个或数个碱基的错配)，只要媒介子探针在实时pcr的退火/延伸过程中能够与靶序列结合，那么所述的post-pcrmca测定就能够检测到特异性峰，并且该特异性峰的熔点保持不变。为了验证这一特点，在本实施例中，评估了靶序列变异/突变对基于媒介子探针和发夹荧光探针的post-pcrmca测定的影响。简言之，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr，所述pcr反应体系包括1×buffera(67mmtris-hcl,16.6mm(nh4)2so4,6.7μmedta和0.085mg/mlbsa)，3.0mmmgcl2，0.2mmdntps，2.0u的聚合酶taq，各400nm的上游引物和下游引物，200nm的媒介子探针kras-mp2，200nm的荧光探针up-mb，0.1μl单链结合蛋白(ssb)，以及5μl的携带野生型kras基因或突变型kras基因的质粒(用作模板)。所使用的引物和探针的序列示于表3中。表3：所使用的引物和探针的序列与野生型kras基因比，突变型kras基因的外显子2中存在一个g→a的碱基突变，用于模拟靶序列的变异。所使用的媒介子探针中的靶特异性序列与野生型kras基因的序列完全匹配，而与突变型kras基因存在一个错配。实时pcr的反应条件为：95℃，5min；50个循环的(95℃，20s和61℃，1min)；以及35℃，10min；并且，在61℃采集荧光。在pcr完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；45℃，2min；随后按0.5℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从45℃升温至95℃，并在此过程中采集rox荧光信号。所使用的实验仪器为bio-radcfx96实时pcr仪(bio-rad，美国)。实验结果如图10所示。图10显示了以携带野生型kras基因或突变型kras基因的质粒或水为模板的3个实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用媒介子探针kras-mp2、发夹荧光探针up-mb和聚合酶taq；并且，图中的黑色实线表示以携带野生型kras基因的质粒为模板的实验结果；灰色实线表示以携带突变型kras基因的质粒为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图10的结果显示，在使用携带野生型或突变型kras基因的质粒作为模板的情况下，基于媒介子探针和荧光探针的post-pcrmca测定均能够检测到特异性目的峰，并且在所述的两种情况下，所检测到的特异性目的峰的熔点相同。这些实验结果表明，基于媒介子探针和荧光探针的post-pcrmca测定能够耐受一定的靶序列变异/突变；并且，只要靶序列的变异或突变不影响媒介子探针在实时pcr的退火/延伸过程中与变异/突变的靶序列的结合，那么所述的post-pcrmca测定就仍然能够用于检测该变异/突变的靶序列，并且所检测到的特异性峰的熔点保持不变。实施例7.双重检测在本实施例中，利用两条媒介子探针和一条荧光探针，在单次的post-pcrmca测定中实现了对2个靶序列的同时检测和区分(即，双重检测)。在本实验中，以braf基因和kras基因为示例性的待检靶序列，以指定用量的293t细胞基因组dna为待检样品。简言之，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr，所述pcr反应体系包括1×buffera(67mmtris-hcl,16.6mm(nh4)2so4,6.7μmedta和0.085mg/mlbsa)，3.0mmmgcl2，0.2mmdntps，2.0u的聚合酶taq，各400nm的引物braf-f(seqidno:1)、braf-r(seqidno:2)、kras-f(seqidno:8)和kras-r(seqidno:9)，100nm的媒介子探针braf-mp2(seqidno:6，其包含特异于braf基因的靶特异性序列)，200nm的媒介子探针kras-mp3(5'-ctctctaggacaggtggtggcgtaggcaagagtgc-c7nh2-3'(seqidno:11)；其包含特异于kras基因的靶特异性序列)，200nm的荧光探针up-mb(seqidno:5)，0.1μl单链结合蛋白(ssb)，以及指定用量的293t细胞基因组dna(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg；每个用量设置3个重复)。所使用的pcr反应条件和mca测定条件如实施例6所述。结果如图11所示。图11显示了使用2条媒介子探针和1条荧光探针的实时pcr反应的扩增曲线和熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用4条引物(braf-f、braf-r、kras-f和kras-r)、2条媒介子探针(braf-mp2和kras-mp3)、发夹荧光探针up-mb、聚合酶taq以及指定用量(100ng、10ng、1ng、100pg或10pg)的293t细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以293t细胞基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图11的结果显示，在熔解曲线中出现了可彼此区分的两个特异性峰(标注为braf的峰以及标注为kras的峰)，其熔点分别对应于由荧光探针up-mb与媒介子探针braf-mp2或kras-mp3中媒介子序列的延伸产物构成的双链体。这一结果表明，利用两条媒介子探针和一条荧光探针，可在单次的post-pcrmca测定中实现对2个靶序列的同时检测和区分(即，双重检测)。此外，图11的结果还显示，所述双重post-pcrmca测定的灵敏度极高(检测极限可低至10pg基因组dna)，可以用于检测单个人类基因组。实施例8.四重检测在本实施例中，利用四条媒介子探针和一条荧光探针，在单次的post-pcrmca测定中实现了对4个靶序列的同时检测和区分(即，四重检测)。在本实验中，以y染色体上的三个检测位点(sy82、sy86和sy242)以及一个内参基因(zfx/y基因)为示例性的待检靶序列，以指定用量的获自正常男性的细胞基因组dna为待检样品。简言之，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr，所述pcr反应体系包括1×buffera(67mmtris-hcl,16.6mm(nh4)2so4,6.7μmedta和0.085mg/mlbsa)，11.0mmmgcl2，0.7mmdntps，5.0u的聚合酶taqhs(takara，大连)，如表4所示的引物(8条引物和1条通用扩增引物)和探针(4条媒介子探针和1条荧光探针)，以及指定用量的获自正常男性的细胞基因组dna(100ng、10ng、1ng、或100pg；每个用量设置3个重复)。所使用的pcr反应条件如下：95℃，5min；4个循环的(95℃，20s和61℃，1min)；46个循环的(95℃，20s和62℃，1min)；以及35℃，30min。在pcr完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：95℃，2min；40℃，2min；随后按0.4℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从40℃升温至95℃，并在此过程中采集rox荧光信号。所使用的实验仪器为bio-radcfx96实时pcr仪(bio-rad，美国)。结果如图12所示。图12显示了使用4条媒介子探针和1条荧光探针的实时pcr反应的熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用表4中描述的9条引物、4条媒介子探针、1条荧光探针、聚合酶taqhs以及指定用量(100ng、10ng、1ng、或100pg)的获自正常男性的细胞基因组dna；并且，图中的实线表示以基因组dna为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图12的结果显示，在熔解曲线中出现了可彼此区分的四个特异性峰(分别标注为242、zf、82和86的四个峰)，其熔点分别对应于由所述荧光探针与媒介子探针242-mp、zf-mp、82-mp和86-mp中媒介子序列的延伸产物构成的双链体。这一结果表明，利用四条媒介子探针和一条荧光探针，可在单次的post-pcrmca测定中实现对4个靶序列的同时检测和区分(即，四重检测)。此外，图12的结果还显示，所述四重post-pcrmca测定的灵敏度高(检测极限可低至100pg基因组dna)。实施例9.二十重检测在本实施例中，利用20条媒介子探针和6条荧光探针，在单次的post-pcrmca测定中实现了对20个靶序列的同时检测和区分(即，二十重检测)。在本实验中，以y染色体上的18个检测位点(sy242、sy82、sy86、sy152、sy145、sy84、sy124、sy127、sy128、sy133、sy143、sy134、sy155、sy154、sy157、sy254、sy239和sy255)以及两个内参基因(sry基因和zfx/y基因)为示例性的待检靶序列，并且，以获自83个正常男性的细胞基因组dna为待检样品。简言之，使用25-μl的pcr反应体系来进行实时pcr，所述pcr反应体系包括1×buffera(67mmtris-hcl,16.6mm(nh4)2so4,6.7μmedta和0.085mg/mlbsa)，11.0mmmgcl2，0.7mmdntps，5.0u的聚合酶taqhs(takara，大连)，如表5所示的引物(40条引物和1条通用扩增引物)和探针(20条媒介子探针和6条荧光探针)，以及5μl的细胞基因组dna。在所述的6条荧光探针中，荧光探针up1和up2标记有rox和bhq2，其荧光信号通过rox通道进行检测；荧光探针up3和up4标记有fam和bhq1，其荧光信号通过fam通道进行检测；荧光探针up5和up6标记有cy5和bhq2，其荧光信号通过cy5通道进行检测。媒介子探针82-mp、86-mp、242-mp、zf-mp中的媒介子序列能够与荧光探针up1结合，且分别用于检测靶序列sy82、sy86、sy242、zfx/y。媒介子探针152-mp、145-mp、84-mp、sry-mp中的媒介子序列能够与荧光探针up2结合，且分别用于检测靶序列sy152、sy145、sy84、sry。媒介子探针124-mp、127-mp、128-mp中的媒介子序列能够与荧光探针up3结合，且分别用于检测靶序列sy124、sy127、sy128。媒介子探针133-mp、143-mp、134-mp中的媒介子序列能够与荧光探针up4结合，且分别用于检测靶序列sy133、sy143和sy134。媒介子探针155-mp、154-mp、157-mp中的媒介子序列能够与荧光探针up5结合，且分别用于检测靶序列sy155、sy154、sy157。媒介子探针254-mp、239-mp、255-mp中的媒介子序列能够与荧光探针up6结合，且分别用于检测靶序列sy254、sy239和sy255。在本实验中，以获自83个正常男性的细胞基因组dna为待检样品(共计83份样品)，进行了83个实时pcr反应。所使用的pcr反应条件如下：95℃，5min；4个循环的(95℃，20s和61℃，1min)；46个循环的(95℃，20s和62℃，1min)；以及35℃，30min。在pcr完成后，按照下述程序进行熔解曲线分析：以0.1℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从45℃升温至98℃；随后在45℃维持2min；随后，以0.04℃/step的升温速率(每个step的维持时间是5s)，将反应体系的温度从45℃升温至98℃。在mca测定的整个过程中，采集3个检测通道(rox、fam和cy5)的荧光信号。所使用的实验仪器为bio-radcfx96实时pcr仪(bio-rad，美国)。结果如图13所示。图13显示了使用20条媒介子探针和6条荧光探针的83个实时pcr反应的熔解曲线；其中，所述实时pcr反应使用表5中描述的41条引物、20条媒介子探针、6条荧光探针、聚合酶taqhs以及获自正常男性的细胞基因组dna(共计83份样品)；图13a表示获自rox检测通道的熔解曲线；图13b表示获自fam检测通道的熔解曲线；图13c表示获自cy5检测通道的熔解曲线；并且，图中的实线表示以细胞基因组dna(83份样品)为模板的实验结果；虚线表示以水为模板的实验结果(阴性对照)。图13的结果显示，在获自rox检测通道的熔解曲线中出现了可彼此区分的8个特异性峰(分别标注为242、zf、82、86、152、145、sry、84的8个峰)，其熔点分别对应于由荧光探针up1或up2与媒介子探针242-mp、zf-mp、82-mp、86-mp、152-mp、145-mp、sry-mp、84-mp中媒介子序列的延伸产物构成的双链体；在获自fam检测通道的熔解曲线中出现了可彼此区分的6个特异性峰(分别标注为124、127、128、133、143、134的6个峰)，其熔点分别对应于由荧光探针up3或up4与媒介子探针124-mp、127-mp、128-mp、133-mp、143-mp、134-mp中媒介子序列的延伸产物构成的双链体；在获自cy5检测通道的熔解曲线中出现了可彼此区分的6个特异性峰(分别标注为155、154、157、254、239、255的6个峰)，其熔点分别对应于由荧光探针up5或up6与媒介子探针155-mp、154-mp、157-mp、254-mp、239-mp、255-mp中媒介子序列的延伸产物构成的双链体。这些实验结果表明，利用20条媒介子探针和6条荧光探针，可在单次的post-pcrmca测定中实现对20个靶序列的同时检测和区分(即，二十重检测)。此外，图13的结果还显示，对于所检测的83份样品，所获得的83条熔解曲线的形状基本一致，并且这些熔解曲线中的20个特异性峰的tm值几乎完全相同(cv<0.5％)。这表明，所述的二十重post-pcrmca测定具有极佳的重复性和可靠性。为了进一步验证上述方法的可靠性，我们还使用上述方法对另外的92份样品进行了盲测。在所述的92份样品中，33份是获自不同正常男性的细胞基因组dna；58份是获自y染色体上出现了微缺失的不同男性的细胞基因组dna；1份是获自正常女性的细胞基因组dna。使用如上所述的二十重post-pcrmca测定对这92份样品进行检测。随后，使用传统的pcr-琼脂糖凝胶电泳法对这92份样品进行再次检测。结果显示，二十重post-pcrmca测定的检测结果与传统的pcr-琼脂糖凝胶电泳法的检测结果完全一致。这再次表明，本发明的二十重post-pcrmca测定具有极佳的可靠性。上述二十重post-pcrmca测定的一些典型的检测结果如图14所示。图14显示了利用二十重post-pcrmca测定对92份样品进行检测所获得的代表性实验结果；其中，黑色实线表示的是以y染色体上出现了微缺失的男性的细胞基因组dna为模板的实验结果；灰色实线表示的是以正常男性的细胞基因组dna为模板的实验结果；黑色虚线表示的是以正常女性的细胞基因组dna为模板的实验结果；灰色虚线表示的是以水为模板的实验结果。这些实验结果再次表明，利用20条媒介子探针和6条荧光探针，可在单次的post-pcrmca测定中实现对20个靶序列的同时检测和区分(即，二十重检测)。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表<110>厦门大学<120>一种检测靶核酸序列的方法<130>idc170010<160>78<170>patentinversion3.5<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1tgttttcctttacttactacacctcag27<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2tcagtggaaaaatagcctcaattc24<210>3<211>49<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>3aaatcgttctgggctctacgctacagtgaaatctcgatggagtgggtcc49<210>4<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>4ttgtcacctgtcctagagagcgtagagcccagaacgattt40<210>5<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>5cccggcttgtcacctgtcctagagagcgtagagcccagaacgatttgccggg52<210>6<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>6aaatcgttctgggctctacagtgaaatctcgatggagtgggtcc44<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>7aaatcgttctgggcagtgaaatctcgatggagtgggtcc39<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8attataaggcctgctgaaaatgac24<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9gcaccagtaatatgcatattaaaac25<210>10<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>10aaatcgttctgggctctacgtggtagttggagctggtggcgt42<210>11<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>11ctctctaggacaggtggtggcgtaggcaagagtgc35<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12gcaagccctcacgtagcgaa20<210>13<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>13cgagcaaaaagaagtgtgagaggtgtgatgagctcg36<210>14<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14gcaagccctcacgtagcgaaatcctgcccttctgaatctc40<210>15<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15gcaagccctcacgtagcgaactgatggatgatgggatgtttg42<210>16<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>16cacctctcacatgtatttagcagcaacatggctagaactggagg44<210>17<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17gcaagccctcacgtagcgaagccccttaaacaacaacct39<210>18<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>18gcaagccctcacgtagcgaaacagggagaagacagcatct40<210>19<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>19tcatcacacctctgagatcaagctatggccagggctgg38<210>20<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>20gcaagccctcacgtagcgaagcaatggagtagccagaca39<210>21<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>21gcaagccctcacgtagcgaatctgccactaaactgtaagctc42<210>22<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>22cgcacttcttttgatggggggcaaggctgacagc34<210>23<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>23gcaagccctcacgtagcgaagaaataccgctgtactgactg41<210>24<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>24gcaagccctcacgtagcgaaggaaagttcttgctgtggac40<210>25<211>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