本发明属于生物科技
技术领域：
，具体涉及一种定量检测充质干细胞中sox-2基因表达量的引物、质粒标准品及其检测方法。
背景技术：
sox基因家族的序列在真核细胞内高度保守，其编码一组与y染色体性别决定区高度相关的转录因子，调控早期胚胎发育、神经分化、性别导向、细胞生长等重要生命事件。在目前发现的20种sox基因中，sox-2属于b组b1亚组，定位于3q36.3-27，为单外显子结构，表达于胚胎干细胞，在胚胎发育的各个发育过程中起重要作用。有研究通过同源重组得到转基因sox-2缺失的纯合子胚胎，在着床后不久就会死亡，无法正常发育；在小鼠胚胎发育的过程中，sox-2基因表现出多样的动态表达；而研究发现sox-2还是诱导成体细胞转变为多能细胞的一个关键和必需的分子。因此，sox-2可作为细胞多能性的一个标志物。这种对干细胞干性起重要作用的基因同时在肿瘤发生和发展中也起一定作用。sox-2已被发现在多种肿瘤中高表达，dong等报道sox-2基因在小细胞肺癌患者血清中检出高水平的表达，前列腺癌细胞中表达水平也显著高于相应正常细胞；还有很多报道如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和神经内分泌癌等都发现sox-2基因的表达异常；因此，sox-2是调节肿瘤及胚胎干细胞参与各项生物学过程中的共同干性基因，广泛的调节着组织细胞及肿瘤细胞的生物学行为。综上所述，不论是干细胞所引领的再生医学研究和应用，还是肿瘤标志基因的研究中，都涉及到sox-2基因表达水平的测定，而如何快速、精确的监测就变得尤为重要了。近年来对于基因表达水平检测的要求和标准也越来越高，常规技术很难满足研究的要求，elisa检测需要1-2天且存在重复性问题，而传统pcr需要耗时7-8个小时，其结果由于酶体系的影响而产生的波动在呈指数增长的pcr中会被转化成产物量间很大的差异，而northern印迹法由于耗时较长，检测效率低，无法检出微小的基因表达变化。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种定量检测间充质干细胞中sox-2基因表达量的引物、质粒标准品及其检测方法，可有效解决现有sox-2基因表达量检测过程精度不足，耗时过长的问题。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种定量检测间充质干细胞中sox-2基因表达量的引物，引物包括：上游引物：5′-tgtcggagacggagaagcgg-3′；(seqidno：1)下游引物：5′-agcgtcttggttttccgccg-3′。(seqidno：2)一种定量检测间充质干细胞中sox-2基因表达量的质粒标准品，该质粒标准品通过以下方法制备得到：(1)提取间充质干细胞总rna，并反转录合成cdna；(2)以cdna为模板，采用权利要求1中所述引物进行pcr扩增，然后回收、纯化pcr扩增片段并克隆到载体中，制得质粒标准品。进一步地，步骤(1)中反转录体系为：totalrna0.1ng～5μg、oilgo1μl、5×reactionbuffer4μl、浓度为20u/μl的ribolockrnaseinhibitor1μl、10mmdntpmix2μl、浓度为200u/μl的revertaidm-mulvrt1μl，用nuclease-freewater补足至20μl。进一步地，步骤(1)中反转录条件为：阶段1：42℃60min；阶段2：70℃5min。进一步地，步骤(2)中pcr扩增体系为：primestarmaxpremix25μl、primerf3μl、primerr3μl、cdna100-150ng，用nuclease-freewater补足至20μl。进一步地，步骤(2)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共29个循环，最后72℃延伸5min。一种定量检测间充质干细胞中sox-2基因表达量的方法，包括以下步骤：(1)测量权利要求2中制备得到的质粒标准品的浓度，并计算其拷贝数；(2)10倍梯度稀释质粒标准品，并用权利要求1中所述引物进行pcr检测，得出各浓度质粒标准品的ct值，再建立标准曲线；(3)提取待测样品间充质干细胞总rna，并反转录合成cdna，以其cdna为模板，并用权利要求1中所述引物进行荧光定量pcr反应，得到待测样品ct值，再通过标准曲线计算出待测样品中sox-2基因的拷贝数。进一步地，步骤(2)和步骤(3)中pcr反应体系为：fastuniversal2xqpcrmastermix10μl、primerf0.8μl、primerr0.8μl、template1μl、rox-low0.4μl，用nuclease-freewater补足至20μl。进一步地，步骤(2)和步骤(3)中pcr反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性3s；60℃退火25s；共39个循环。本发明的有益效果为：采用本发明所提供的引物及标准品进行实时荧光定量pcr，能够在短时间内对间充质干细胞中sox-2基因表达拷贝进行绝对定量，且获得的定量数据是高度可重复的。这不仅节约了大量时间，还能够精确、灵敏的监控间充质干细胞中sox-2基因表达量的微小变化。附图说明图1为扩增片段电泳图；图2为质粒标准品测序图谱；图3为质粒标准品测序结果与sox-2基因序列比对结果；图4为梯度稀释的质粒标准品的荧光定量pcr扩增曲线图；图5为荧光定量pcr标准曲线；图6为荧光定量溶解曲线。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本
技术领域：
的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本
技术领域：
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。实施例1、设计引物根据ncbi数据库中sox-2基因序列信息，本发明针对sox-2基因表达量水平设计了特异性优异的引物，其引物序列如下：sox-2-f：5′-tgtcggagacggagaagcgg-3′；(seqidno：1)sox-2-r：5′-agcgtcttggttttccgccg-3′。(seqidno：2)2、总rna的提取及反转录合成cdna将间充质干细胞培养至汇合度为80％左右，用胰蛋白酶消化收集细胞，然后再用pbs冲洗三次后，通过trizol处理提取rna；再用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(购自thermoscientific公司，货号k1622)进行反转录，其反应体系见表1，其中，oligo(dt)引物浓度为100μm；反应条件为：阶段1：42℃60min；阶段2:70℃5min。即，step1:42℃for60min；step2:70℃for5min。表2反转录反应体系试剂用量totalrna0.1ng-5μgoilgo(dt)1μlwater，nuclease-freeupto20μl5×reactionbuffer4μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)1μl10mmdntpmix2μlrevertaidm-mulvrt(200u/μl)1μltotalvolume20μl3、pcr扩增以反转录合成的cdna为模板，进行目的片段的pcr扩增，其扩增反应体系见表2，反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共29个循环，最后72℃延伸5min。即，step1：95℃for2min；step2：95℃for30s；step3：60℃for15s；step4：72℃for10s；step5：gotostep2,29times；step6：72℃for5min。扩增结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果见图1，由图1可知，pcr扩增产物为112bp的单一条带，表明采用本发明方法设计的引物具有很好的特异性。表2pcr扩增体系试剂用量primestarmaxpremix25μlprimerf3μlprimerr3μlcdnanμl(100-150ng)water，nuclease-freeupto20μltotalvolume20μl4、制备质粒标准品将步骤3中所述的扩增片段回收并纯化，克隆至pgm-t载体上，冰上放置30min，加入至50μl的dh5a感受态细胞中，冰中放置30min，然后于42℃水浴90s后，再在冰中放置2-3min，并使离心管保持静置；其后加入950μl不含amp的lb液体培养基，在37℃、200r/min的条件下，振荡培养1h；取100μl培养物涂布于含有amp(100μg/ml)、x-gal(20mg/l)、iptg(100mmol/l)的lb琼脂固体培养基上，37℃下倒置培养14-16h，然后用灭菌接种针尖端挑取白色单菌落，接种于含3mlamp的lb液体培养基的玻璃试管中，于37℃、200r/min的条件下，摇床培养16-20h。保存菌种，然后按天根质粒提取试剂盒操作说明进行提取，同时对质粒标准品进行鉴定，并送华大基因测序，测序结果见图2，比对结果见图3。5、建立标准曲线根据拷贝数计算公式：拷贝数(cospies/ul)＝6.02×1023(cospies/mol)×质粒浓度(g/ul)/质粒分子质量(g/mol)计算得出步骤4中所述质粒标准品的拷贝数，经biodrop超微量核酸蛋白浓度分析仪测定质粒标准品的浓度为202.4ng/μl，然后10倍梯度稀释质粒标准品，使其拷贝数为5.90385×108～5.90385×105；利用步骤1中设计的引物(浓度为5pm/μl)和kapafastuniversal2xqpcrmastermix(购自kapa公司，货号kk4602)，在abiviiatm7进行荧光定量pcr反应，反应体系如表3所示。反应条件包括：95℃预变性3min；95℃变性3s；60℃退火25s；共39个循环。即，step1：95℃for3min；step2：95℃for3s；step3：60℃for25s；step4：gotostep2，39times；每个稀释度设置3次重复，质粒标准品扩增曲线见图4，经viiatm7软件自动分析获得标准曲线见图5，其具体参数见表4。表3real-timepcr反应体系表4标准曲线具体参数slop-3.302y-znter37.206r20.998eff％99.127error0.0856、sox-2基因表达量的检测(1)按照步骤4中所述方法制备待测质粒样品，然后经biodrop超微量核酸蛋白浓度分析仪测定待测质粒样品浓度为185.2ng/μl，再将其以10倍梯度稀释为5份待测质粒样品，分别为：待测质粒样品105、待测质粒样品106、待测质粒样品107和待测质粒样品108，根据拷贝数计算公式：拷贝数(cospies/ul)＝6.02×1023(cospies/mol)×质粒浓度(g/ul)/质粒分子质量(g/mol)，得到各个稀释度下待测质粒样品中的理想拷贝数分别为：5.40214×108、5.40214×107、5.40214×106、5.40214×105；(2)通过设计的引物，按照步骤5中所述pcr过程，分别对阴性对照、待测质粒样品105、待测质粒样品106、待测质粒样品107和待测质粒样品108进行荧光定量pcr检测，得到各稀释梯度待测质粒样品的ct值，然后通过步骤5中建立的标准曲线计算出各稀释梯度待测质粒样品中sox-2基因的拷贝数，其结果见表5。表5sox-2基因的表达量比较从表5的结果可以看出，待测质粒样品在五个稀释倍数下检测得到的目的基因拷贝数与理想拷贝数结果相符，无显著差异，证明本发明方法能够准确定量目的基因拷贝数，且重复性很好。综上所述，本发明的特异性定义为tm值的单一性，tm值与pcr扩增产物的序列有关，对于某一pcr扩增产物，其值是固定的。本方法溶解曲线结果如图6所示，证明本检测中采用的引物及方法特异性非常好，也具有很好的重复性。本发明的灵敏度及准确性定义为标准曲线的相关性及对样本进行独立重复检测得到同一结果的能力，标准曲线如图5所示，其具体参数如表5所示，可以看出标准曲线相关性为99.9％，扩增效率接近1，斜率在-3.3，表明标准曲线直线性非常好，定量也非常准确。而在对样本进行独立重复实验的结果也可以看出定量结果差异非常小，证明本方法的准确性和灵敏度都很好。本发明所提供的引物及标准品，具有特异性好、准确度高、灵敏度高、重复性好等优点，能够在短时间内对间充质干细胞中sox-2基因表达拷贝进行绝对定量，不仅节约了时间，还能够精确的监控间充质干细胞中sox-2基因的表达情况，为间充质干细胞的标志基因研究、肿瘤标志基因研究、细胞多能性研究及再生医学中间充质干细胞的应用提供帮助。序列表<110>成都中创清科医学检验所有限公司<120>定量检测充质干细胞中sox-2基因表达量的引物、质粒标准品及其检测方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgtcggagacggagaagcgg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agcgtcttggttttccgccg20当前第1页12