本发明涉及多肽合成技术领域，尤其是涉及一种抗菌环肽thermoactinoamidea的化学合成方法。
背景技术：
全球耐药性细菌发病率的增加，迫使人类寻找有效的解决途径。天然抗生素的发现，在对抗耐药细菌方面发挥着极其重要的作用。在20多种批准的抗生素中，仅有3种(磺胺药物，喹诺酮和恶唑烷酮)不是基于天然抗生素结构研发的药物。研究生活在特殊环境中的微生物，更有可能发现新的天然抗生素。
thermoactinomidea是从冰岛嗜热细菌菌株iscar2354中分离出的一种由d型和l型氨基酸组成的新型环六肽，由6个氨基酸残基构成，结构为：cyclic[d-tyr-d-allo-ile-l-leu-d-leu-l-leu-l-val]，相对分子质量为714.47da。由于分离提纯方法成本高，且产量低，无法满足市场的需求。目前，国内外关于thermoactinomidea的合成方法尚未见文献报道，因此，如何采用化学合成的方法制备thermoactinomidea是目前研究的主要课题之一。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抗菌环肽thermoactinoamidea的化学合成方法，解决现有抗菌环肽thermoactinoamidea提取方法成本高，产量低的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：1.以fmoc-d-tyr(tbu)-oh等为原料合成直链六肽o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸。
2.使用pybop/hobt/nmm体系对得到的直链肽进行液相环合，最后利用95％三氟乙酸脱去o-叔丁基保护即可得到目标环肽thermoactinoamidea。
具体反应步骤为：
1)向反应管中加入fmoc-d-tyr(tbu)-oh、n,n-二异丙基乙胺和二氯三苯基氯树脂后通入氮气反应1-2h，反应完成后加入20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂；
2)向o-叔丁基-d-酪氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂中加入n-芴甲氧羰基-d-别异亮氨酸室温搅拌后，加入dipea、tbtu反应30-90min，加入20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂；
3)向o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂中加入n-芴甲氧羰基-亮氨酸室温搅拌后，加入dipea、tbtu反应30-90min，加入20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂；
4)向o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂中加入n-芴甲氧羰基-d-亮氨酸室温搅拌后，加入dipea、tbtu反应30-90min，加入20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂；
5)向o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂中加入n-芴甲氧羰基-亮氨酸室温搅拌后，加入dipea、tbtu反应30-90min，加入20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂；
6)向o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂中加入n-芴甲氧羰基-缬氨酸室温搅拌后，加入dipea、tbtu反应30-90min，加入20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂；
7)将o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂用三氟乙醇、乙酸、二氯甲烷的混合液脱去2-氯三苯甲基氯树脂，得到直链六肽o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸；
8)将直链o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸溶于无水二氯甲烷，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，1-羟基苯并三唑，n-甲基吗啉，冰浴下搅拌反应，生成环(o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸)肽；
9)将环(o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸)肽，在体积比19:1的tfa和水的混合液作用下脱去保护基得到抗菌环肽thermoactinoamidea。
采用上述技术方案的本发明与现有技术相比，产生的有益效果如下：通过本发明固相合成抗菌环肽thermoactinoamidea的方法，具有反应时间短，成本低，副产物少，且得率高的优点。经过试验验证，本方法制备出直链肽o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸的得率为84％，由直链肽环合后得到抗菌环肽thermoactinoamidea的得率为51％，因而总产率达到43％。
说明书或权利要就书中所使用的缩写含义列于下表：
以下将结合附图和实施例，对本发明进行较为详细的说明。
附图说明
图1为本发明的合成路线图。
图2为本发明中thermoactinoamidea的1h谱图。
1hnmr(400mhz,dmso),δ:9.27(s,1h),8.52～8.44(d,j＝8.0hz,1h),8.25～8.18(d,j＝8.4hz,1h),8.11～7.97(t,j＝15.8hz,3h),7.92～7.88(d,j＝8.0hz,1h),7.10～7.04(d,j＝8.8hz,2h),6.66～6.62(d,j＝8.0hz,2h),4.63～4.58(m,1h),4.38～4.31(m,2h),4.23～4.16(m,2h),3.61～3.57(m,1h),2.87～2.80(m,1h),2.70～2.62(m,1h),2.13～2.06(dd,j＝12.2,8.0hz,1h),1.73～1.65(m,1h),1.64～1.54(m,3h),1.52～1.40(m,7h),1.10～1.03(m,1h),0.93～0.77(m,30h)
图3为本发明中thermoactinoamidea的12c谱图。
12cnmr(100mhz,dmso),δ:174.34,172.20,171.85,171.12,171.00,156.36,130.57,128.03,115.37,57.42,54.77,50.96,50.50,41.41,41.27,40.56,40.35,40.15,39.94,39.73,39.52,39.31,36.98,30.42,24.64,24.58,24.41,23.59,23.46,23.36,22.19,22.11,21.69,18.87,18.86,17.44,15.61,11.26.
图4为本发明中thermoactinoamidea的质谱图。
具体实施方式
实施例，一种抗菌环肽thermoactinoamidea的化学合成方法，如图1所示，包括以下步骤：1)称取二氯三苯基氯树脂1000mg(载样量为1.03mmol/g)加入到固相合成反应管中，加入20mldmf浸泡0.5h，使树脂充分膨胀，然后抽去dmf。取322mgfmoc-d-tyr(tbu)-oh和754μldipea混溶于10mldcm，加入到抽干待用的二氯三苯基氯树脂中，通入氮气，反应1h，抽去反应液后，再分别用dcm和dmf各洗涤3遍，每次洗涤30s。加入20ml甲醇和dcm的混合液，甲醇和dcm的体积比为1:4，反应0.5h，对未反应完的二氯三苯基氯树脂进行封闭。再将上述步骤中的甲醇和dcm抽滤后，再分别用dcm和dmf洗涤3遍，抽干待用。为检测反应是否已经完成，可以随机取出十几粒树脂放入检测管中，滴加检测试剂，沸水浴1min，树脂无颜色变化，表明得到n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂。所述检测试剂的制备方法为：分别称量6g茚三酮溶于100ml无水乙醇；20ml无水乙醇加入80ml苯酚溶液；吡啶50ml，一起混合搅拌均匀得检测试剂。该产物再经过20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再分别用dcm和dmf洗涤3遍，去除残留的20％的哌啶。
2)将1092mgn-芴甲氧羰基-d-别异亮氨酸加入到步骤1获得的o-叔丁基-d-酪氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂溶液中，室温搅拌混合均匀，再加330.8μldipea，0.9mmol的tbtu，反应1h，得到n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，该产物再经过20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再分别用dcm和dmf冲洗3遍，去除残留的20％的哌啶。
3)将1092mgn-芴甲氧羰基-亮氨酸加入到步骤2获得的o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂溶液中，室温搅拌，再加330.8μl的dipea，0.9mmol的tbtu，反应1h，得到n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，该产物再经过20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再分别用dcm和dmf冲洗3遍，去除残留的20％的哌啶。
4)将1092mg的n-芴甲氧羰基-d-亮氨酸加入到步骤3获得的o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂溶液中，室温搅拌混合均匀，再加330.8μl的dipea，0.9mmol的tbtu，反应1h，得到n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，该产物再经过20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再分别用dcm和dmf冲洗3遍，去除残留的20％的哌啶。
5)将1092mg的n-芴甲氧羰基-亮氨酸加入到步骤4获得的o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂溶液中，室温搅拌混合均匀，再加330.8μl的dipea，0.9mmol的tbtu，反应1h，得到n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，该产物再经过20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再分别用dcm和dmf冲洗3遍，去除残留的20％的哌啶。
6)将1048.7mg的n-芴甲氧羰基-缬氨酸加入到步骤获得的o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再加330.8μl的dipea，0.9mmol的tbtu，反应1h，得到n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，该产物再经过20％的哌啶脱保护得到o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，再分别用dcm和dmf冲洗3遍，去除残留的20％的哌啶。
7)将步骤获得的o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂用三氟乙醇、乙酸和二氯甲烷的混合液脱去2-氯三苯甲基氯树脂，所述三氟乙醇、乙酸和二氯甲烷的比例为1：1：8，得到直链六肽o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸，利用减压蒸馏，先去除残留的三氟乙醇、乙酸和二氯甲烷等，再用高效液相色谱分离出纯的直链六肽o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸，冷冻干燥，得到白色粉末状的固体1863mg，理论投入量为2217mg，因此直链肽收率为84％。
8)取500mg的直链o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸溶于500ml无水二氯甲烷，然后加入1651.8mg的pybop，428.42mg的hobt，697μl的nmm，0℃下搅拌反应，生成环(o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸)肽，过sephadexlh-20凝胶柱对产物进行粗分离，再用高效液相色谱分离出纯的环(o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸)肽。
9)将步骤8获得的环(o-叔丁基-d-酪氨酸-d-别异亮氨酸-亮氨酸-d-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸)肽，在tfa溶液中脱去o-叔丁基，所述tfa溶液中tfa与水的比例为19：1。再用高效液相色谱分离出纯的环肽thermoactinoamidea，冷冻干燥，得到白色粉末状的固体255mg，理论收入量为500mg，因此由直链肽得到环肽thermoactinoamidea的收率为51％。
将得到的环肽thermoactinoamidea，用质谱和核磁检测环肽的分子量和结构(图2-4)，结果证明成功合成环肽thermoactinoamidea，总收率为43％。
以上结合附图对本发明进行了示例性描述。显然，本发明具体实现并不受上述方式的限制。只要是采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进；或未经改进，将本发明的上述构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。