【技术领域】
本发明涉及可用于环孢菌素衍生物的开环以及随后用于制备环状多肽(更具体地说，是环状十一氨基酸肽例如阿拉泊韦(也称为deb025、debio025或debio))的新方法、新处理步骤和新中间体。
背景技术：
本发明涉及制备环状多肽例如环状十一氨基酸肽(例如阿拉泊韦)的方法。
如wo2006/038088所述，阿拉泊韦是一种用于治疗丙型肝炎病毒(hcv)感染或经hcv诱发的疾病的亲环素(cyp)抑制剂。而且，wo2009/042892描述了阿拉泊韦用于治疗多发性硬化症的方法；wo2009/098577描述了阿拉泊韦用于治疗肌肉萎缩症的方法；wo2008/084368描述了阿拉泊韦用于治疗ullrich型先天性肌肉萎缩症的方法。
wo00/01715描述了阿拉泊韦及其合成法。阿拉泊韦已被分配cas注册号254435-95-5。
j.f.guichoux在“denouveauxanaloguesdecycloposrineacommeagentanti-hiv-1”phdthesis,facultedessciencesdel’universitedelausanne,2002中，于wo2006/038088中以及于wo2008/084368中描述了实验室规模的阿拉泊韦制备方法。
以下表示的环状十一氨基酸肽为式(ia)的环状多肽，其中n＝2。
阿拉泊韦(式i)是一种式(ib)的环状十一氨基酸肽，其中n＝2，aa1为d-meala，aa2为etval。
通式：
环-(axx1-axx2-axx3-axx4-axx5-axx6-axx-7-axx8-axx9-axx10-axx11)应当包含来自专利申请wo2010/052559a1中在关键的sar片段处进行分段的实施例。
axx1＝mebmt、bmt、meleu、脱氧-mebmt、甲基氨基辛酸
axx2＝abu、ala、thr、val、nva
axx3＝sar
axx4＝meleu、val
axx5＝val、nva
axx6＝meleu、leu
axx7＝ala、abu
axx8＝d-ala
axx9＝meleu、leu
axx10＝meleu、leu
axx11＝meval、val、d-meval，
以及在wo2010/052559a1中包含的所有其他组合。
在最近几年，环孢菌素a(cya)已被用作各种可用于治疗发炎性或病毒性疾病的合成环状十一氨基酸肽的原料。环状十一氨基酸肽可以由菌株选育获得，然而获得大多数非天然衍生物需要化学转换，而其依赖于例如式(ia)或式(ib)的环状多肽的开环以及随后的氨基酸取代。
传统上，例如式(ia)的环状多肽以一种高度选择性的方法开环，氨基酸残基通过埃德曼降解反应移除，以获得作为重要中间体的开环的环状多肽(wenger,r.m.inpeptides1996；ramage,r.、epton,r.编辑；theeuropeanpeptidessociety,1996，第173页；wenger,r.m.等人，tetrahedronletters2000,41,7193.)。许多科学家及公司已经利用该可靠的选择性策略，其中纯环孢菌素a及通过柱层析色谱的纯化已经用于获得环状十一氨基酸肽。
而且，产物(例如开环的环孢菌素a)的纯化涉及一些通过硅胶进行液体层析法纯化的步骤。除了中等的获得总产率，该纯化方案的主要缺点在于层析法步骤的极高成本。文献中所述的衍生自环孢菌素a或其结构类似物的这类产物的大规模纯化方法通常涉及层析纯化或至少一次吸附层析的前期纯化。该前期纯化之后可进行例如萃取、逆流萃取和/或超临界流体萃取。
然而，由于需要高品质的昂贵前驱物，没有任何一种技术在所需的品质要求、在可接受的总产率以及在工业规模制造可接受的成本下获得关键性的开环的中间体方面会完全令人满意。
我们发现二甲氧基碳正离子(在诺华(novartis)专利申请ep0908461a1中描述用于头孢菌素(cephalosporine)衍生物的甲基化)在大环多肽的开环中进行与氧鎓离子(三甲基或三乙基氧鎓米尔文(meerwein)盐)相同的化学过程。新的反应条件可有利地在原位制备，因此可避免处理有毒及吸湿物质，可在多种溶剂(例如甲苯、二甲苯、苯甲醚)中进行，不需使用非必要的含氯溶剂(例如二氯甲烷或二氯乙烷)，也避免使用来自于有遗传毒性的表氯醇的氧鎓米尔文盐。专用的碳正离子四氟硼酸盐或经由三氟化硼与原酸酯衍生物(优选原甲酸三甲酯)的原位反应生成的活性物会获得所需的开环多肽(例如以下的化合物3)。
我们发现了一种在保持高度选择性的埃德曼降解反应的优势同时，能充分利用新确定的结晶型中间体的优势的改良方法。
以下公开内容提出了衍生自如下各物质的开环后新分离出的结晶型中间体：
和一种用于生产和通过例如结晶法来进行纯化的方法。该方法快速、实际并且能更高效地获得开环的环孢菌素a、环孢菌素b、环孢菌素d或环孢菌素g，并可用于生产环状十一氨基酸肽(例如阿拉泊韦)。而且，根据本公开内容的方法也可以应用于可经过相同顺序开环的其他环孢菌素。据发现，开环的环孢菌素盐(例如盐酸(hcl)、氟硼酸(hbf4)或六氟磷酸(hpf6))可在若干步骤内制成。
本发明提供了新颖的结晶型中间体，例如环孢菌素酯，例如乙酸酯、特戊酸酯，及开环的环孢菌素a、环孢菌素b、环孢菌素d或环孢菌素g的盐(例如hcl盐、hbf4盐或hpf6盐)，及生产它们的方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种制备式3的化合物或其盐的方法，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基以及r’是甲基或乙基。该方法包括以下步骤：使环孢菌素a酰基化以形成乙酰基环孢菌素a；使乙酰基环孢菌素a开环；及使已开环的乙酰基环孢菌素a结晶以获得式3的化合物。
本发明提供了一种制备式4的化合物或其盐的方法，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基以及r’是甲基或乙基。该方法包括以下步骤：使式3的化合物进行埃德曼(edman)降解；及接着使该化合物结晶以获得式4的化合物。
本发明提供一种制备式4的化合物或其盐的方法，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基以及r’是甲基或乙基。该方法包括以下步骤：使环孢菌素a酰基化以形成乙酰基环孢菌素a；使乙酰基环孢菌素a开环；及使已开环的乙酰基环孢菌素a结晶以获得式3的化合物
使式3的化合物进行埃德曼降解；及接着使该化合物结晶以获得式4的化合物或其盐。
本发明提供一种式3的化合物或其盐，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基以及r’是甲基或乙基。
本发明提供一种式4的化合物或其盐，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基以及r’是甲基或乙基。
【附图说明】
图1为化合物3的质子nmr谱图。
图2为化合物4的质子nmr谱图。
【具体实施方式】
以下反应图显示了基于本发明的用于制备环状多肽，更具体而言是环状十一氨基酸肽(例如阿拉泊韦)的一般方法；然而，该一般反应图也可用于制备环状多肽，更具体而言是衍生自环孢菌素a、b、d或g的环状十一氨基酸肽。
具体而言，可用如下方法制备阿拉泊韦：通过环孢菌素a(化合物1，其中r2为乙基)的酰基化以形成乙酰基环孢菌素a(2)；开环；结晶以获得化合物3、化合物3的埃德曼降解反应；结晶以获得以上所示的式4的化合物的方法将环孢菌素a转化为化合物4，及接着使化合物4环化以形成阿拉泊韦(如下所示)。
本发明具体涉及各部分中所描述的方法。同时本发明也独立地涉及在相应部分的过程顺序中所描述的每一个单一步骤。因此，文中所述的由一定顺序的步骤组成的任何方法的各个及每一个单一步骤自身是本发明的优选实施方式。因此，本发明也涉及那些将在本方法的任何步骤中作为中间体获得的化合物用作起始物质的本方法的实施方式。
本发明也涉及特定地开发用于制备本发明的化合物的中间体、其用途及其制备方法。
应注意，除非另有说明，否则在本专利申请中，在一个部分中所做的解释也可应用于其他部分。
环孢菌素a、环孢菌素b、环孢菌素d或环孢菌素g或它们的盐可通过例如发酵法制备。
在一个实施方式中，本发明涉及一种制备式3的化合物的方法，其包括以下步骤：使环孢菌素a、环孢菌素b、环孢菌素d或环孢菌素g酰基化以形成乙酰基环孢菌素a、b、d或g；开环；及结晶。
在一个实施方式中，本发明涉及一种制备式4的化合物或其盐的方法，其包括使式3的化合物进行埃德曼降解反应(本领域已熟知的一种反应)及使其结晶以获得式4的化合物。
本发明的另一个实施方式涉及一种制备式3或式4的化合物的方法，其中环孢菌素a的起始物质纯度为>80％(基于重量)。
本发明的另一个实施方式涉及一种制备式3或式4的化合物的方法，其中环孢菌素a的起始物质纯度为>85％(基于重量)。
本发明的另一个实施方式涉及一种制备式3或式4的化合物的方法，其中环孢菌素a的起始物质纯度为60至80％(以重量％分析)。
在以上所示的方法中，涉及具有新颖性和创造性的化合物。因此，本发明的进一步主题为以下所示的化合物。
式3的化合物或其盐，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基，r’是甲基或乙基，及r2是甲基、乙基或丙基。
式4的化合物或其盐，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基，r’是甲基或乙基，及r2是甲基、乙基或丙基。
式3的化合物或其盐，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基及r’是甲基或乙基。
式4的化合物或其盐，
其中r是甲基、乙基、丙基或苯基及r’是甲基或乙基。
以下实施例代表反应步骤、中间体及/或本发明的方法的优选实施方式，用以说明本发明但不限制其范围。
利用米尔文(merwein)盐制备化合物3hbf4盐
在20-25℃下，使乙酰基环孢菌素a(100g按现状)与四氟硼酸三甲基氧鎓(32g)在二氯甲烷(180ml)中反应。20h之后，加入乙腈(200ml)及水(650ml)进行水解。3h之后，在20-25℃下，分液，反应混合物通过用2-甲基-四氢呋喃(二氯甲烷/2-甲基-四氢呋喃的溶剂交换)的共沸蒸馏干燥。然后，所需产物从2-甲基-四氢呋喃(900ml)和2-甲氧基-2-甲基丙烷(400ml)中结晶，并得到呈白色结晶型粉末的化合物3hbf4(63.9g，干燥后，纯度>92％)。0.69,(3h,d,j＝6.6hz)；0.71,(3h,d,j＝6.5hz)；0.81,(6h,m)；[0.82..0.89],(24h,m)；0.90,(3h,d,j＝6.6hz)；0.93,(3h,d,j＝6.6hz)；1.16,(6h,m)；[1.23..1.50],(4h,m)；1.52,(1h,m)；[1.32..1.73],(8h,m)；1.59,(3h,d,j＝6.0hz)；1.65,(2h,m)；1.65,2.13,(2h,m)；1.93,1.94,(3h,s)；2.03,(1h,m)；2.19,(1h,m)；2.45,(3h,s)；2.72,(3h,s)；2.84,(3h,s)；2.86,(3h,s)；2.99,(3h,s)；3.02,(3h,s)；3.06,(3h,s)；3.62,3.68,(3h,s)；3.78,(1h,m)；3.87,4.53,(1h,d,j＝17.2hz,18.6hz)；4.10,4.26,(1h,d,j＝18.6hz,16.8hz)；4.23,(1h,m)；4.60,(1h,m)；4.62,(1h,m)；4.66,(1h,m)；5.02,(1h,m)；5.13,(1h,dd,j＝11.3hz,4.7hz)；5.26,(1h,m)；5.29,(1h,m)；5.32,(1h,m)；5.36,(1h,m)；5.39,(2h,m)；7.72,(1h,d,j＝7.3hz)；8.14,(1h,d,j＝7.3hz)；8.21,8.35,(1h,d,j＝7.3hz,8.1hz)；8.85,(2h,s,br)；8.96,(1h,d,j＝8.4hz)。
利用原甲酸三甲酯及三氟化硼乙醚制备化合物3hbf4盐
在-15℃下，将溶于二氯甲烷(20ml)中的乙酰基环孢菌素a(10g)的溶液加入到四氟硼酸二甲氧基碳的浆液中，该浆液是在-20℃下，将三氟化硼(2ml)缓慢滴加到原甲酸三甲酯(2ml)溶于二氯甲烷(20ml)的溶液中而产生。滴加之后，浆液可升温到室温并保持搅拌20h。之后，加入乙腈(10ml)及水(10ml)。在0℃下搅拌2h之后，两相分开。接着，用水洗涤有机相之后，将溶剂换成2-甲基-四氢呋喃并利用2-甲氧基-2-甲基丙烷使其饱和，可获得呈白色固体的化合物3，并在真空下干燥(5.1g，>90％纯度)(参见图1)。
化合物hbf4盐的制备方法：
将之前制备的化合物3的盐(34.62g)与碳酸钠(4.8g)、甲苯(50ml)和水(50ml)一起加入反应器。在20-25℃下搅拌所得混合物30分钟，两相分离。在20-25℃下，历时1h逐滴滴加异硫氰酸苯酯(3.81g)并搅拌所得反应混合物直到完成。接着，加入甲醇(20ml)及48％氟硼酸水溶液(2.5g)，并继续搅拌混合物1h。然后加入水(25ml)，分液。再利用甲苯(50ml)萃取水层，接着用2-甲基-四氢呋喃(100ml)萃取。共沸干燥有机萃取物并使所需产物自2-甲基-四氢呋喃(100ml)和2-甲氧基-2-甲基丙烷(50ml)中结晶，以获得呈白色结晶型粉末的化合物4hbf4。(约30g，干燥之后，纯度>93％)。(参见图2)。
0.69,(3h,d,j＝6.2hz)；0.73,(3h,d,j＝7.0hz)；0.81,(3h,t,j＝7.3hz,7.3hz)；0.82,(3h,m)；0.85,(9h,m)；0.88,(6h,m)；0.91,(3h,d,j＝7.0hz)；0.93,(3h,d,j＝6.6hz)；0.99,(3h,d,j＝7.0hz)；1.17,(6h,d,j＝6.6hz)；[1.30..1.55],(9h,m)；1.60,(3h,d,j＝5.5hz)；[1.56..1.72],(4h,m)；1.93,1.95(3h,s)；2.09,(1h,m)；2.14,(1h,m)；2.20,(1h,m)；2.74,(3h,s)；2.82,3.06,(3h,s)；2.84,(3h,s)；2.87,(3h,s)；2.94,(3h,s)；3.02,(3h,s)；3.63,3.68,(3h,s)；3.88,4.52,(1h,d,j＝17.2hz,18.6hz)；4.10,4.24,(1h,d,j＝18.7hz,m)；4.24,(2h,m)；4.39,4.62,(1h,m)；4.66,(1h,m)；5.02,(1h,m)；5.08,(1h,m)；5.26,(2h,m)；5.32,(1h,m)；5.37,(1h,m)；5.39,(2h,m)；7.84,8.51(1h,d,j＝7.3hz,8.1hz)；7.98,(3h,s,br)；8.07,8.18(1h,d,j＝7.7hz,7.3hz)；8.13,8.27,(1h,d,j＝7.3hz,8.1hz)。
阿拉泊韦的制法：
在15℃下，将前述的中间体4(约109g)分批加入到甲苯和碳酸钠/水的混合物中并在15℃下搅拌3小时。分离水相。在0℃下，加入二肽(约28g)和n-羟基苯并三唑一水合物(8.1g)。将水(2.5ml)加入混合物并在-10℃下加入n-甲基吗啉(17.9g)，接着在-10℃下加入溶于甲苯的二环己基碳二亚胺(21.9g)的溶液并在该温度下搅拌3小时。历时10小时将反应混合物加热至0℃。在完成后，过滤反应混合物并用5％碳酸钠溶液、5％盐溶液、2m盐酸及10％盐溶液萃取滤液。再次过滤有机相并在50℃真空下浓缩。
在20至40℃下，将硼氢化钠(0.59g)溶于二乙二醇二甲醚(14.3g)中。将浑浊液冷却到12–16℃。在该温度下加入甘胺酸(0.59g)。在12–16℃下，将溶于约6g甲苯中的先前制备的产物(6.2g)的溶液加入到白色悬浮液中。接着，在12–16℃下，通过加入溶于甲苯中的甲醇加速还原反应。加入过程是被控制的，并分为3部分实施。继续搅拌反应3小时，并在10–20℃的内温下加到淬灭溶液(乙酸水溶液)中。加入的速度需要根据氢气逸出速度调整(无积聚)。分液，利用水萃取上层有机产物相，并随后浓缩。
在50℃下，将之前制备的产物(5g)溶于甲苯(约5g)中并历时40至60分钟加入到硫酸(0.8g)的甲醇(50ml)溶液中。在约2小时之后，将溶液冷却至15–20℃，并加入溶于甲醇的25％苄基三甲基氢氧化铵(约12g)(放热反应)。2小时之后，加入水并在22℃下搅拌混合物约20小时。完成后，将溶液冷却到10–15℃，用水稀释并用稀硫酸中和。在分离上层甲苯相之后，通过蒸馏移除下层产物相中的甲醇。利用乙酸乙酯萃取油状分离产物，再利用水和盐溶液按序洗涤，利用稀硫酸将ph调节到7.0–7.5。然后共沸蒸干有机相，在0–5℃的冷庚烷上沉淀。过滤产物悬浮液，用庚烷洗涤并在60℃真空下干燥。
在40℃下，历时约10h，将溶于二氯甲烷中的“十一氨基酸肽氨基酸”前驱物(5至13％的最终总质量)和溶于二氯甲烷的dcc同时地连续加入到溶于二氯甲烷中的cl-hobt和nmm的混合物中。加入完成后，继续搅拌混合物2h，过滤以除去dcu盐，浓缩以获得阿拉泊韦粗产物。