本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法。
背景技术：
：控制同一性状的双隐性基因多由基因组加倍或基因复制产生，在异源四倍体植物中最为常见，如普通烟草、甘蓝型油菜、硬粒小麦等，偶见于二倍体植物，如水稻、玉米等。这类基因由于完全冗余的生物学功能，单个基因的突变不能导致相应的隐性表型。分子标记是当前基因定位最主要和最可靠的手段，在利用分子标记定位控制同一性状的双隐性基因方面，根据所使用的分离群体，目前主要有两种方法：一种是利用f2或bc1f1分离群体，把2个基因作为数量性状位点(quantitativetraitloci，qtls)进行定位。该方法由于获得分离群体较快，故可快速获得定位结果，但定位精度较低，通常不用于基因的精细定位与图位克隆。利用这种方法定位的基因有2个水稻育性恢复基因rf3、rf(u)和2个硬粒小麦黄绿叶基因ygld1、ygld2等(lietal.2013；yaoetal.1997)。另一种是利用多代回交的方法，先将2个显性等位基因通过回交分离到不同的单株之中，然后通过与隐性纯合突变体杂交配制单个基因分离的群体，再分别对其定位。该方法精度较高，常用于基因的精细定位与图位克隆；但由于通常在回交高代进行定位，故花费时间较长。利用这种方法定位的基因有1个甘蓝型油菜雄性不育基因ms2和1个印度芥菜的三室长角果基因mc1等(leietal.2007；xuetal.2013)。基于当前现状，开发一种结合上述两种方法优点(简单、快速、高效)的新的基因定位方法，无疑会大大加快双隐性基因精细定位和图位克隆的进程，从而有利于重要多倍体作物的功能基因组学研究和分子标记辅助育种。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何快速定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法。本发明提供的用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法包括如下步骤：(1)将突变体植株与野生型植株杂交，得到f1代植株，将所述f1代植株与所述突变体植株杂交，得到bc1f1分离群体；所述突变体植株具有表型a，所述野生型植株具有表型b，所述表型a和所述表型b为同一性状且表型相反；(2)用分子标记对控制同一性状的双隐性基因分别进行初定位，分别获取其在基因组中的初步位置；(3)选取其中一个基因位点，根据其初步位置开发分子标记并基于所述bc1f1分离群体中与所述突变体植株具有相同表型的突变型单株进行精细定位，得到其精细定位区间；(4)在所述精细定位区间内，比对所述野生型植株与所述突变体植株的序列差异，获得候选基因a；(5)通过对所述野生型植株与所述突变体植株的基因组序列进行比对分析，获得所述候选基因a的同源基因，即候选基因b；所述候选基因a和所述候选基因b即为控制同一性状的双隐性基因。上述方法中，所述(1)中，为了增加双亲间的多态性，便于更高效地开发用于基因精细定位的分子标记，可用与所述突变体植株具有相同表型和基因型的植物品种代替所述突变体植株。在本发明的具体实施例中，用白肋烟品种tn90代替白茎突变体植株ws1。上述方法中，所述(2)中，所述初定位的方法为现有技术中的常规方法，可采用现有技术中公开的分子标记，具体可参见文献“mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(nicotianatabacuml.)”中的方法。上述方法中，所述(2)和(3)中，所述分子标记可为snp标记或ssr标记。在实际应用中，鉴于ssr标记具有使用成本低和检测效率高的特点，优先使用该类标记进行基因定位，如果在精细定位的区间内无法开发ssr标记，则考虑使用snp标记，snp标记由于在基因组内分布更广泛，较易开发，但使用成本高，不适合对超大群体进行筛选(精细定位)。在本发明的具体实施例中，所述分子标记具体为ssr标记。上述方法中，所述(3)中，所述精细定位的方法包括如下步骤：(3-1)根据所述基因位点的初步位置搜索可以设计ssr引物的简单重复序列，根据所述简单重复序列及其上下游序列设计ssr引物；(3-2)用所述ssr引物检测所述突变体植株和所述野生型植株，选取具有多态性的ssr引物；(3-3)用所述具有多态性的ssr引物检测突变型单株小群体，将所述基因位点定位在区间a内；所述突变型单株小群体为突变型单株群体中的一小部分；所述突变型单株群体为所述bc1f1分离群体中与所述突变体植株具有相同表型的植株组成的群体；(3-4)在所述区间a内搜索可以设计ssr引物的简单重复序列，并根据所述简单重复序列及其上下游序列设计ssr引物，用所述ssr引物检测剩余突变型单株群体，将所述基因位点定位在区间b内，即为所述精细定位区间；所述剩余突变型单株群体为所述突变型单株群体中除了突变型单株小群体以外的剩余植株组成的群体。上述方法中，所述(3-1)和所述(3-4)中，利用ssrhunter软件搜索可以设计ssr引物的简单重复序列。上述方法中，所述(3-1)和所述(3-4)中，根据所述简单重复序列及其上下游150bp序列设计ssr引物。上述方法中，所述(3-2)中，选取具有多态性的ssr引物的方法为选取在所述突变体植株和所述野生型植株中扩增带型不同的ssr引物。上述方法中，所述(3-3)中，用所述具有多态性的ssr引物检测突变型单株小群体，将所述基因位点定位在区间a内的方法为现有技术中的常规方法，具体可参见文献“mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(nicotianatabacuml.)”中的方法。上述方法中，所述植物可为烟草。上述方法中，所述突变体植株为白茎突变体植株ws1或白肋烟品种tn90；所述野生型植株为红花大金元。上述方法中，所述候选基因a为ws1b基因；所述候选基因b为ws1a基因。所述ws1b基因的核苷酸序列为序列表中序列1；所述ws1a基因为序列表中序列2。本发明提供了一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的新方法，本发明的方法可以从普通常规材料出发，快速构建目标性状分离的定位群体，和edwardsetal.中的方法相比，主要优点为不需要使用非常规材料(如dh系)，在bc1f1代即可对基因进行精细定位与图位克隆，具有简单、快速、高效的优点，可广泛用于对控制同一性状的双隐性基因进行精细定位与图位克隆。附图说明图1为ws1a和ws1b的初定位与精细定位比较。图2为红花大金元(hd)和tn90(tn)苗期和成株期的表型。图3为标记s5和s7在部分bc1f1隐性单株(白茎)中的扩增情况(*示重组单株)。图4为ws1a和ws1b的精细定位与图位克隆。图5为ws1a和ws1b遗传互补植株与对照的表型比较图。图6为红花大金元(hd)和tn90(tn)叶绿体透射电镜观察。图7为ws1a、ws1a、ws1b和ws1b特异引物在22个白肋烟品种和24个绿茎烟草品种中的扩增情况。图8为ws1a、ws1a、ws1b和ws1b特异引物在部分bc1f1单株中的扩增情况及绿茎单株的基因型鉴定。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、基因ws1a和ws1b的定位和图位克隆一、基因ws1a和ws1b的初定位1、从ems诱变的普通烟草品种中烟100(zy)中筛选得到一个叶绿素缺乏的白茎突变体whitestem1(ws1)。采用等位测验的方法(具体方法参见如下文献：mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(nicotianatabacuml.))进行遗传分析，具体步骤如下：将白茎突变体ws1与白肋烟品种杂交，得到f1代，f1代表现与父母本相同；然后将f1代自交，得到自交后代，自交后代性状不发生分离。遗传分析表明，白茎性状由2个隐性细胞核基因ws1a和ws1b控制，且与普通烟草中一个重要的栽培类型——白肋烟的白茎基因等位。2、利用烟草ssr标记对两个基因ws1a和ws1b进行初定位(具体方法参见如下文献：mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(nicotianatabacuml.)，具体步骤如下：将白茎突变体(ws1)与绿茎烟草品种红花大金元(hd)杂交，得到杂种f1代。然后将杂种f1代与tn90回交，得到bc1f1分离群体。再将bc1f1分离群体中的绿茎单株自交，得到bc1f2分离群体。通过表型鉴定获得绿:白分离比为3:1的群体(在某一具体群体中仅ws1a或ws1b基因单独分离，图1)，选取其中一个群体用于筛选与白茎突变表型连锁的ssr标记，与标记连锁的基因被命名为ws1a；之后用该连锁标记筛选其余群体，凡其白茎突变表型不与该标记连锁的群体则被用于筛选与ws1b基因连锁的ssr标记(图1)，最终将ws1a定位于第5连锁群由ssr标记pt54006和pt51778界定的一个12cm的区间内，ws1b定位于第24连锁群由ssr标记pt53716和tm11187界定的一个17.12cm的区间内；并基于遗传学和分子标记图谱等若干证据推测出ws1a和ws1b为同源基因。二、基因ws1a和ws1b的精细定位和图位克隆1、由于步骤一中用于遗传分析和基因定位的实验材料均属于同一类型的普通烟草，而ssr标记的多态性在同一类型的普通烟草中较低，在不同类型的普通烟草中较高，为了提高ssr标记的多态性，以利于接下来的基因精细定位与图位克隆，本发明选取一个普通烟草白肋烟品种tn90(tn)代替白茎突变体进行如下试验：首先将白肋烟品种tn90(tn)与绿茎烟草品种红花大金元(hd)杂交，得到杂种f1。然后将杂种f1代与tn90回交，得到bc1f1分离群体(图1和图2)。该bc1f1群体总共有8500株，其中2151株鉴定为白茎(隐性)，分离比符合3:1(χ20.05为0.424，小于临界值3.841)。2、由于ws1a定位于第5连锁群由ssr标记pt54006和pt51778界定的一个12cm的区间内，ws1b定位于第24连锁群由ssr标记pt53716和tm11187界定的一个17.12cm的区间内。通过将文献“ahighdensitygeneticmapoftobacco(nicotianatabacuml.)obtainedfromlargescalemicrosatellitemarkerdevelopment”中提供的ssr引物序列与红花大金元(hd)基因组序列比对，表明ws1b位于红花大金元第19号染色体64.73mb和70.45mb之间，而ws1a的两个ssr标记由于分别位于不同的scaffold上，暂无法确认ws1a具体的染色体位置。3、对ws1b进行精细定位。具体步骤如下：(1)利用ssrhunter软件(记载于如下文献中：developmentofalocalsearchingsoftwareforssrsites)在红花大金元第19号染色体64.73mb和70.45mb之间搜索可以设计ssr引物的简单重复序列；(2)获取的ssr简单重复序列及其上下游150bp序列用于设计ssr引物，并在tn90和红花大金元之间检测其多态性；(3)有多态性的标记用于检测bc1f1群体中的白茎单株(隐性)。精细定位中使用的所有实验技术，包括基因组dna的制备、pcr扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显色均按照文献“mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(nicotianatabacuml.)”描述的进行。本发明设计的ssr标记共有88个，其中10个(s1-s10)在tn90和红花大金元之间具有多态性，且扩增产物电泳条带清晰。首先用这10个多态性标记对一个282个单株的小群体(此处小群体是指步骤1中bc1f1群体中的2151株白色茎秆单株的一小部分，共有282株白色茎秆单株)进行了检测，发现这些标记都表现为与白茎突变表型紧密连锁(图3)。根据ssr标记与ws1b之间的遗传重组，初步将ws1b定位在一个910kb的区间内；随后在该区间内又开发了6个多态性ssr标记(s11-s16)，用剩余的群体(此处剩余的群体是指步骤1中2151株白色茎秆单株中除上述由282个白色茎秆单株组成的小群体以外的其余白色茎秆单株)进一步将其定位在一个220kb的区间内(图4)。该区间内总共有5个预测基因，通过在tn90和红花大金元之间进行序列差异比对，初步将一个编码金属蛋白酶(zincmetalloprotease)的基因确定为ws1b的候选基因。ws1b基因具有10个外显子和9个内含子，位于第9外显子上的一个单碱基t插入导致了基因的移码突变(图4)。ws1b基因的核苷酸序列如序列1所示。4、由于推测ws1a和ws1b为同源基因，随后将ws1b序列作为query序列在红花大金元基因组序列中进行搜索，发现另外一个与ws1b候选基因高度同源、编码相同金属蛋白酶的基因在tn90和红花大金元之间存在序列差异。该基因位于红花大金元第18号染色体，也具有10个外显子和9个内含子，位于第2外显子上的一个8碱基的缺失导致了基因的移码突变(图4)，该基因即为ws1a的候选基因，其核苷酸序列如序列2。5、将步骤4中所述的8碱基缺失设计成一个共显性标记m-a，并检测了470个白色茎秆单株(隐性)(此处470个白色茎秆单株(隐性)为上述bc1f1分离群体中的2151株白色茎秆单株的一部分)，结果表明：该标记与白茎突变表型完全连锁，表明ws1a确实位于其候选基因所在区域(图4)。精细定位中用到的所有标记信息见表1。表1、用于ws1a和ws1b精细定位和图位克隆的分子标记标记染色体物理位置(mb)正向引物序列反向引物序列s1chr.1966.34tatgattctccttttattcctatgcggtccactccactgas2chr.1966.91gtggcaactaaatgaaaaaagattagatattcaacatcctcctts3chr.1967.49gttctatattttcaaacagtgtgtgacaacctcaataagccacs4chr.1967.92tcttattctcttacaacactctggtagacaagcgtaatgaggas5chr.1968.10gatgtgtttcttttgctctttatagtctgagattatactgggttgs6chr.1968.48agttgaatatgaacctatacaaatgatagtgaagaaaaatgtgaaaats7chr.1969.01ggtacagcggggaaagataaaacctgcaattacaagtcaaas8chr.1969.38tttttccctaccgattctctactgttgcttcttcacacacattas9chr.1969.80ccactgtttaagcaactttagataacaccatataaaatgattgtgaags10chr.1969.92aaacaaaaccgaaccaaaccgaacggacgctaattctcaas11chr.1968.20gtaaaagattgattaagatttagacgagaattgaaattatgagattatcs12chr.1968.62aaagggcactcccgaatatatgcttgtaaatcaaatgatgatgs13chr.1968.66tcgtgtaggtttaataaaggagacaaaaggaaagagggaaacs14chr.1968.79cggacattgataagttgtagattccatacgactgaataataggts15chr.1968.83aaacgaaataaataaaggaaagaagggcataaaagtcgatcaatats16chr.1968.88tcttaccaccattgtgtaggacaagtgagcgtcagtattttcm-achr.1813.25acctgttcatggtggaagagctgcgtggttgacgagttc实施例2、金属蛋白酶ws1a或ws1b在调控植物叶绿体代谢中的应用一、转ws1a烟草和转ws1b烟草的获得1、重组载体的构建(1)基因ws1a、ws1b的克隆(1-1)提取红花大金元叶片的rna，反转录而成cdna。rna提取和反转录分别使用takara公司的minibestplantrnaextractionkit(codeno.9769)和takara公司的primerscriptii1ststrandcdnasynthesiskit(codeno.6210)完成。以cdna为模板，采用引物cw-1f/cw-1r进行扩增，得到pcr产物。(1-2)pcr产物经ta克隆(mightyta-cloningkit(takara公司，codeno.6028))和测序后分别鉴定出ws1a和ws1b。ws1a基因序列如序列3所示，ws1b基因序列如序列4所示。(2)表达载体的构建(2-1)用限制性内切酶psti和ecori对pcambia1300-35s(pcambia1300-35s记载于文献“looseplantarchitecture1,anindeterminatedomainproteininvolvedinshootgravitropism,regulatesplantarchitectureinrice”中)进行双酶切，得到包含nos转录终止子的310bp的片段，并将其连入pcambia1300载体中，形成中间载体pcambia1300-nos；(2-2)以含有测序正确的ws1a质粒为模板，采用引物st-3f/st-1r扩增ws1a基因，用takara公司的in-fusionhdcloningkit将其插入到中间载体pcambia1300-nos中，得到pcambia1300-ws1a-nos；以含有测序正确的ws1b质粒为模板，采用引物st-3f/st-1r扩增ws1b基因，用takara公司的in-fusionhdcloningkit将其插入到中间载体pcambia1300-nos中，得到pcambia1300-ws1b-nos；(2-3)以红花大金元基因组dna为模板，分别使用两对引物sp-2f/sp-2r和tp-2f/tp-2r进行扩增，分别得到ws1a和ws1b的启动子；(2-4)用takara公司的in-fusionhdcloningkit将ws1a的启动子插入到pcambia1300-ws1a-nos中，得到表达载体pws1a:ws1a；用takara公司的in-fusionhdcloningkit将ws1b的启动子插入到pcambia1300-ws1b-nos中，得到表达载体pws1b:ws1b；(2-5)以含有测序正确的ws1a质粒为模板，采用引物st-1f/st-1r扩增ws1a基因；用takara公司的in-fusionhdcloningkit(codeno.639648)将ws1a基因插入到pcambia1300-35s表达载体中，得到表达载体p35s:ws1a；以含有测序正确的ws1b质粒为模板，采用引物st-1f/st-1r扩增ws1b基因；用takara公司的in-fusionhdcloningkit(codeno.639648)将ws1b基因插入到pcambia1300-35s表达载体中，得到表达载体p35s:ws1b。上述表达载体pws1a:ws1a和表达载体pws1b:ws1b均为自身启动子驱动ws1a和ws1b的表达载体；上述表达载体p35s:ws1a和表达载体p35s:ws1b均为camv35s强启动子驱动ws1a和ws1b的表达载体。上述表达载体pws1a:ws1a和表达载体p35s:ws1a均表达序列5所示的ws1a蛋白；上述表达载体pws1b:ws1b和表达载体p35s:ws1b均表达序列6所示的ws1b蛋白。上述构建载体所用到的所有引物信息见表2。表2、用于ws1a和ws1b遗传互补载体构建和cdna扩增的引物2、转基因烟株的获得(1)将上述四个载体p35s:ws1a、p35s:ws1b、pws1a:ws1a和pws1b:ws1b通过电击转入农杆菌菌株lba4404(青岛百奥百斯特化学试剂有限公司，货号bc301-01)，按照文献“high-throughputgenerationofanactivation-taggedmutantlibraryforfunctionalgenomicanalysesintobacco”中的方法转化白肋烟品种tn90，分别得到转p35s:ws1a烟株、转p35s:ws1b烟株、转pws1a:ws1a烟株和转pws1b:ws1b烟株。(2)pcr鉴定采用表3中的引物分别对转p35s:ws1a烟株、转p35s:ws1b烟株、转pws1a:ws1a烟株和转pws1b:ws1b烟株进行pcr鉴定。表3、用于ws1a和ws1b遗传互补转基因植株鉴定的引物对注：a：p35s:ws1a；b：p35s:ws1b；c：pws1a:ws1a；d：pws1b:ws1b经过pcr检测与测序分析，每个载体都获得了20株以上的转基因烟株。二、转ws1a烟草和转ws1b烟草的表型观察转p35s:ws1a烟株、转p35s:ws1b烟株、转pws1a:ws1a烟株和转pws1b:ws1b烟株与白肋烟品种tn90表型。结果表明：与tn90的白色茎秆比较，转p35s:ws1a烟株、转p35s:ws1b烟株、转pws1a:ws1a烟株和转pws1b:ws1b烟株均恢复到与野生型红花大金元相同的绿色茎秆。上述结果表明ws1a和ws1b确实控制了tn90的白色茎秆性状，并且二者中任意一个均可使其恢复到野生型的绿色茎秆(图5)。三、ws1a和ws1b的亚细胞定位1、利用predotarserver(https://urgi.versailles.inra.fr/predotar/)在线分析了ws1a和ws1b的亚细胞定位。结果表明：ws1a和ws1b均定位于质体(叶绿体)中。2、为进一步分析ws1a和ws1b在叶绿体中的作用，参照文献“alteredchloroplastdevelopmentanddelayedfruitripeningcausedbymutationsinazincmetalloproteaseatthelutescent2locusoftomato”中的方法制备了tn90和红花大金元的初花期中部叶片样品，采用hitachih-7650型透射电镜观察了叶绿体的超微结构。结果表明：tn90叶绿体的类囊体膜受到严重的破坏，几乎没有基粒片层，仅有少量的基质片层，与红花大金元完整的类囊体膜形成鲜明的对比(图6)。上述结果表明ws1a和ws1b通过控制叶绿体类囊体膜的形成来影响叶绿体的发育，从而调控叶绿素的代谢。实施例3、与白肋烟控制基因共分离的分子标记一、用于ws1a、ws1a、ws1b和ws1b基因型鉴定的引物设计1、从红花大金元基因组数据库下载ws1a和ws1b全基因序列，用在线分析工具muscle(https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/muscle/)进行序列比对，获得ws1a和ws1b之间的序列差异，截取ws1a和ws1b突变位点上下游200-400bp的基因组序列备用；2、由于ws1a和ws1b序列高度同源，利用二者之间的序列差异，分别设计包含基因突变位点的特异pcr引物：(1)对于ws1a和ws1a，基于二者之间的8碱基长度差异设计一对特异引物1325-2f/1325-1r(即m-a)，pcr产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凡片段大小与红花大金元相近者则被认为含有ws1a，与tn90相近者被认为含有ws1a，二者兼有者被认为是ws1a/ws1a杂合体，在实际应用中，可根据如下方法确定待测烟草含有ws1a基因还是ws1a基因还是含有ws1a基因和ws1a基因：若1325-2f/1325-1r引物的扩增产物大小为209bp，则待测烟草含有ws1a基因；若1325-2f/1325-1r引物的扩增产物大小为201bp，则待测烟草含有ws1a基因；若1325-2f/1325-1r引物的扩增产物大小为209bp和201bp，则待测烟草含有ws1a基因和ws1a基因。为了验证鉴定出的ws1a和ws1a是否正确，采用另一对特异引物1325-1f/1325-1r进行pcr测序以进一步确认。(2)对于ws1b和ws1b，二者之间的单基因长度差异无法用聚丙烯酰胺凝胶电泳清晰显示，参照文献“asimpleandefficientmethodforcrispr/cas9-inducedmutantscreening”中的act-pcr法设计一条反向引物bw-n4r与正向特异引物b-n1f配对，用于特异扩增ws1b，设计一条反向引物bm-n3r与正向特异引物b-n1f配对，用于特异扩增ws1b。上述ws1b和ws1b特异引物的最佳扩增条件均采用温度梯度pcr法在红花大金元和tn90进行摸索，以特异扩增的基因条带清晰，而其对应的等位基因无条带或条带很弱为准。在实际应用中，可根据如下方法确定待测烟草含有ws1b基因还是ws1b基因还是含有ws1b基因和ws1b基因：若bw-n4r/b-n1f引物没有扩增条带或扩增条带弱，bm-n3r/b-n1f引物的扩增产物大小为251bp，则待测烟草含有ws1b基因；若bw-n4r/b-n1f引物的扩增产物大小为250bp，bm-n3r/b-n1f引物没有扩增条带或扩增条带弱，则待测烟草含有ws1b基因；若bw-n4r/b-n1f引物的扩增产物大小为250bp，bm-n3r/b-n1f引物的扩增产物大小为251bp，则待测烟草含有ws1b基因和ws1b基因；为了验证鉴定出的ws1b和ws1b是否正确，采用另一对特异引物6877-1f/6877-2r进行pcr测序以进一步确认。上述相关引物序列及pcr扩增条件见表4。表4、用于ws1a、ws1a、ws1b和ws1b基因型鉴定的引物二、用于ws1a、ws1a、ws1b和ws1b基因型鉴定的引物的应用1、利用步骤一中的特异引物对由国家烟草种质资源库(http://www.ycsjk.com.cn/)提供的22个白肋烟品种和24个绿茎烟草品种(表5和表6)进行基因型鉴定。结果表明：所有白肋烟品种均含有纯合的ws1a基因和ws1b基因，而所有的绿茎烟草品种均含有纯合的ws1a基因和ws1b基因(图7)。表5、用于ws1a、ws1a、ws1b和ws1b基因型鉴定的22份白肋烟种质资源表6、用于ws1a、ws1a、ws1b和ws1b基因型鉴定的24份普通烟草种质资源品种茎秆颜色adcock绿色cekpka绿色connecticat-s98绿色greecebasma绿色havana1号绿色k326绿色karabaglarizmir绿色katerinia绿色kutsaga110绿色maden绿色samsun绿色saribaglar绿色wisconsin38绿色xanthinn绿色安88-2绿色贝拉烟绿色海南10绿色黑河柳叶尖绿色建恒一号绿色垦农二号绿色邵黄一号绿色铁青3绿色中烟100绿色筑波2号绿色2、为了进一步验证这些特异引物的有效性，对由tn90与红花大金元杂交、回交产生的bc1f1群体中的376个单株的基因型进行鉴定。结果表明，114个白茎单株均含有纯合的ws1a基因和ws1b基因，而262个绿茎单株总共有三种基因型，分别为ws1aws1aws1bws1b、ws1aws1aws1bws1b和ws1aws1aws1bws1b，其单株数分别为76、88、98(图8)，分离比符合1:1:1(χ20.05为2.779，小于临界值5.991)。上述结果表明步骤一设计的与白肋烟控制基因共分离的分子标记，可以在分子育种中快速、准确地对烟草基因型和茎秆性状进行鉴定。序列表<110>中国农业科学院烟草研究所<120>一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>1645<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgggaacgctaacgagctgcagtttcagctcaatgaatataaggttccgtttgaatcct60ccagttaattacactttcagtcgaagaatccaattgaagagaatgtccaaacggaatttc120ggtcgattgattattaggtgtagtagcggtagtagtggcaatggcagtagcaatgacagt180ggtagcagtagcgatgggaaattggaaaaggattcttcaaatttggctacagttactgaa240gaaaccactgaagaaaggaacggcggcggtggcgccagcggtgtggaaaatgattcggat300gattctccggtgtcaatttcttccagaccaacaatatccactgttggatcaacttataat360aatttccaagtagattcttttaagttgatggaacttcttggaccagaaaaggttgatccc420agtgatgtgaagttcattaaggaaaagttatttggctactctactttttgggtgactaaa480gaagaaccatttggagatcttggagagggcattcttttccttgggaatcttagaggaaag540agggaggatgtttttgccaaacttcagagtcagttatcagaaattatgggtgataagtac600aacctgttcatggtggaggaacctaattcagaggggccagacccgcgtggtgggcccaga660gtcagctttggtatgctgcggaaagaagtttctgaaccaggtccaacaactctctggcaa720tatgtaattgcttttctgttgttccttctcactattggttcctctgtggagctaggaatt780gcatctcagataactcgccttcctcctgaggtagttaagtactttactgatccaaatgca840attgaaccaccagatatgcagcttttattaccgtttgtggattctgctttaccgttggca900tatggtgtgctgggtgtgcagttatttcatgaaattgggcattttctggctgcatttcca960aggaatgtgaaattaagcattcctttctttattccaaacatcactcttggaagctttgga1020gcaatcactcagttcaaatctattcttcccgatcgcaaagcaaaggtagacatttctctt1080gcgggtccttttgctggtgctgcattgtcttcttccatgtttgcggttggcctgttactc1140tcatccaatcctgctgctgctggagagttggttcaggttcctagcacacttttccagggc1200tctttgcttctcgggcttattagcagagccactcttggttatggagcaatgcatggtgca1260atggtttcaatccatcctcttgtgatagctggctggtgtggcttgactacatcggctttt1320aatatgctgccagttggatgtcttgatggtgggagagctgtgcagggagcctttgggaaa1380ggatcacttattggttttggtttggcgacatacacacttctgggcttgggcgtgcttggt1440ggacctcttgtcacttccttggggattgtatgtgcttatatgtcagaggacaccggagaa1500accatgcttgaatgatgtaacagaggtcggaaattggagaaaagcagctcttggtgtggc1560tatattccttgttgtattgactcttcttcctgtatgggatgaacttgcagaagaactagg1620tataggtcttgtaaccagcttttga1645<210>2<211>1627<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgggaacgctaacgagctgcagtttcagcacaatgaatataaggttccgtttgaatcct60ccagttaatcacagtttcagtcgaagaatccaattgaagagaatgtccaaacggaatttc120ggtagattgattattaggtgtagtagtggaaatggcagtagcaataacaatggcagcagt180agcgatgggaaattggaaaaggattcttcaaatttagctacagttactgaagaaaccact240gaagaaaggaacggcggcggtggcgccagcggtgtggaaaatgattccgaggattctccg300gtgtcaatttcttccagaccaacaatatccacggttggatcaacttataataatttccaa360gtagattcttttaagttgatggaacttcttggaccagaaaaggttgatcccagtgatgtg420aagataattaaggaaaagttatttggctactctactttttgggtgactaaagaagaacca480tttggagatcttggagagggcattcttttccttgggaatcttagaggaaagagggaggat540gtttttgccaaacttcagagtcagttatcagaaattatgggtgataagtacaacctgttc600atggtggaagagcctaactctggacccacgtggtgggcccagagttagctttggtatgct660gcggaaagaagtttctgaaccaggtccaacaactctctggcaatatgtaattgcttttct720gttgttccttctcacaattggttcctctgtggagctaggaattgcatctcagataactcg780ccttcctcctgaggtagttaagtactttacggatccaaatgcaattgaaccaccagatat840gcagcttttactaccgtttgtggattctgctataccactggcatatggtgtgttgggcgt900gcagttatttcatgaaattgggcattttctggctgcgtttccaaggaatgtgaaattaag960cattcctttctttattccaaacatcactcttggaagctttggagcaatcactcagttcaa1020atctattcttcctgatcgaaaagcaaaggtagatatttcgcttgtgggtccttttgctgg1080tgctgcattgtcttcttcaatgtttgcggttggcctgttactctcatccaatcctgctgc1140ttctggagagttggttcaggttcctagcacacttttccagggatctttgcttcttgggct1200tattagcagagccactcttggttatggagcaatgcatggagcaatggtttcaatccatcc1260tcttgtgattgctggctggtgtggtttgactacgtcggcttttaatatgctacc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