一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法
【专利摘要】本发明涉及一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因的方法，具体的步骤如下：1)选取具有某一性状的植株，假定该性状受两个非等位基因A和B控制，A和B突变后该性状变为突变性状；2)将野生型和突变体杂交获得F1，F1的基因型为AaBb，表现同野生型，为正常性状；3)F1自交后获得F2分离群体，共有9种基因型；4)将F1用突变体回交，产生的BC1F1分离群体共有4种基因型；5)取若干正常性状的BC1F1单株自交，获得各自的BC1F2分离群体；本发明的有益效果是：本方法结合了两种传统定位方法的优点，可以既精确又快速地在BC1F2代对控制同一性状的两个非等位基因进行定位，特别适用于杂交不易操作的自交植物。
【专利说明】一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法。
【背景技术】
[0002]控制同一性状的2个非等位基因多由基因组加倍或基因复制产生，在异源四倍体植物中最为常见，如普通烟草、甘蓝型油菜、硬粒小麦等，偶见于二倍体植物，如水稻、拟南芥等。由于它们的生物学功能极为相似，之间存在功能互补，故单个基因突变后不能导致相应的隐性表型。分子标记是当前基因定位的最主要和最可靠的手段，在单个基因的定位和图位克隆中发挥着非常重要的作用。不过，在定位植物控制同一性状的2个非等位基因方面，目前流行的方法要么定位结果过于粗糙，要么花费时间太长。
[0003]在定位植物控制同一性状的2个非等位基因方面，根据所使用的分离群体，主要有2种方法:一种是利用F2或BClFl分离群体，把上述2个基因当做数量性状位点(Quantitative trait loci, QTLs)进行定位，该方法由于获得分离群体较快(野生型与突变体杂交后再自交一次或者用突变体回交一次即可)，故可快速获得定位结果，但定位精度较低，且不能对单个基因进行精细定位。利用这种方法定位的基因有2个水稻育性恢复基因Rf3、Rf(U)和2个硬粒小麦黄绿叶基因ygldl、ygld2等；另一种是利用高代回交(Advanced Backcross)的方 法,先将2个非等位基因分离到不同的回交单株之中，再分别对其定位。该方法精度较高，可用于基因的图位克隆，但由于通常在回交3代(BC3)以后才能开始定位，故花费时间较长。利用这种方法定位的基因有I个甘蓝型油菜雄性不育基因ms2和I个印度芥菜的三室长角果基因mcl等。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法。
[0005]本发明采用如下技术方案:
[0006]一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因的方法，具体的步骤如下:
[0007]I)选取具有某一性状的植株，假定该性状受2个非等位基因A和B控制，A和B突变后该性状变为突变性状，那么野生型的基因型为AABB，表现为正常性状，而突变体的基因型为aabb，表现为突变性状；
[0008]2)将野生型和突变体杂交获得Fl，Fl的基因型为AaBb，表现同野生型，为正常性状；
[0009]3)Fl自交后获得F2分离群体，共有9种基因型AABB、AABb, AAbb, AaBB, AaBb,Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群体的正常性状和突变性状的分离比表现为15:1 ；
[0010]4)将Fl用突变体回交，产生的BClFl分离群体共有4种基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BClFl群体的正常性状和突变性状分离比表现为3:1;
[0011]5)取若干正常性状的BClFl单株自交，获得各自的BC1F2分离群体；
[0012]由于1/3的BClFl正常性状的单株基因型为AaBb，那么其自交产生的BC1F2分离群体与Fl相同，有9种基因型，正常性状和突变性状的分离比表现为15:1 ;
[0013]另有1/3的BClFl单株基因型为Aabb，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3:1;由于正常性状和突变性状的分离只与A的基因型的分离相关，含有A为正常性状，不含A则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于A基因分离的群体，用分子标记对A基因进行定位；
[0014]剩余1/3的BClFl单株基因型为aaBb，，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3:1 ；由于正常性状和突变性状的分离只与B的基因型的分离相关，含有B为正常性状，不含B则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于B基因分离的群体，可以用分子标记对B基因进行定位；
[0015]一种利用上述的方法定位控制普通烟草茎杆颜色的两个非等位基因，具体的步骤如下:
[0016]I)正常中烟100的茎杆基部呈绿色，突变体的茎杆基部呈白色，用突变体和一个茎杆为绿色的烟草品种红花大金元杂交，获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体，Fl同时用红花大金元回交获得BClFl分离群体。对F2和BClFl群体中茎杆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现绿白分离比分别符合15:1和3:1，这表明白色茎杆性状受2个隐性基因控制，我们分别将其命名为c和d，那么它们对应的显性基因分别为C和D ;
[0017]2)从步骤I中的BClFl分离群体中选取了 9株茎杆绿色的单株自交，获得各自的BC1F2分离群体，分别编号为1-9号；对这些群体中茎杆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现1-4号的4个群体的绿白分离比符合15:1，而另外5-9号的5个群体的绿白分离比符合3:1，这表明第5个群体对应的上一代BClFl单株的基因型为Ccdd或ccDd，可以用来对c基因或d基因进行定位；
[0018]3)采用烟草SSR分子标记进行基因定位
[0019]根据普通烟草SSR标记连锁图M，选取1376对SSR引物对突变体和红花大金元的基因组DNA进行PCR，关于普通烟草SSR标记连锁图M和1376对SSR引物参考文献:Bindler，G.，Plieskej J.，Bakaherj N.，Gunduzj 1.，Ivanov, N.，Van der Hoevenj R.，Ganalj M.and Doninij P.(2011) A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L)obtained from large scale microsatellite marker development.Theoretical andApplied Genetics, 123，219-230.[0020]PCR产物经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，共获得183对在突变体和红花大金元之间有多态性的引物，用这些引物对第5号BC1F2群体的10个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA进行扩增和电泳检测，发现第5连锁群上的引物PT61414在10个白色茎杆单株，即隐性单株中只有2个单株发生交换，而在10个绿色茎杆单株中没有观察到交换，我们进一步用该引物检测了第5号群体中剩余的41个隐性单株，最终从51个隐性单株中共发现6个交换单株，这表明该引物与第5号群体中的控制基因连锁，我们假定该基因为c ；[0021]4)采用与步骤3相同的方法，提取第6-9号BC1F2群体中各10个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA，用PT61414进行检测，发现该引物与第6、7号群体中的控制基因连锁，但不与第8、9号群体中的控制基因连锁，这样第5-7号群体对应的上一代BClFl单株的基因型为Ccdd，而第8、9号群体对应的上一代BClFl单株的基因型应为ccDd ；
[0022]用183对多态性SSR引物对第8号群体的11个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA进行扩增和电泳检测，发现第24连锁群上的引物PT53716在10个白色茎杆单株，只有3个单株发生交换，而在11个绿色茎杆单株中没有观察到交换，我们进一步用该引物检测了该群体中剩余的38个隐性单株，最终从48个隐性单株中共发现4个交换单株，这表明该引物与d基因连锁；这样，我们分别定位了控制普通烟草白色茎杆性状的2个非等位基因，它们分别位于普通烟草第5和24SSR标记连锁群上。
[0023]如上所述的定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法，该方法用于定位异源四倍体植物中控制同一性状的两个非等位基因。
[0024]上述的异源四倍体植物为普通烟草、甘蓝型油菜、硬粒小麦。
[0025]本发明的有益效果是:[0026]本方法结合了 2种传统定位方法的优点，可以既精确又快速地在BC1F2代对控制同一性状的2个非等位基因进行定位，特别适用于杂交不易操作的自交植物。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]本发明有如下附图:
[0028]图1为实施例2中第5号BC1F2群体的10个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA经烟草SSR引物PT61414扩增后的凝胶电泳图；左侧第一个条带为红花大金元，第二个条带为突变体，第3-12为10个绿色茎杆单株，第13-22为10个白色茎杆单株；
星号表示交换单株；
[0029]图2为实施例2中烟草SSR引物PT53716对第8号群体的11个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA进行扩增后的凝胶电泳图；左侧第一个条带为红花大金元，第二个条带为突变体，第3-13为11个绿色茎杆单株，第14-23为10个白色茎杆单株；
星号表示交换单株。
【具体实施方式】
[0030]以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0031]实施例1
[0032]一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因的方法，具体的步骤如下:
[0033]I)选取具有某一性状的植株，假定该性状受2个非等位基因A和B控制，A和B突变后该性状变为突变性状，那么野生型的基因型为AABB，表现为正常性状，而突变体的基因型为aabb，表现为突变性状；
[0034]2)将野生型和突变体杂交获得Fl，Fl的基因型为AaBb，表现同野生型，为正常性状；
[0035]3)Fl自交后获得F2分离群体，共有9种基因型AABB、AABb, AAbb, AaBB, AaBb,Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群体的正常性状和突变性状的分离比表现为15:1 ；
[0036]4)将Fl用突变体回交，产生的BClFl分离群体共有4种基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BClFl群体的正常性状和突变性状分离比表现为3:1;
[0037]5)取若干正常性状的BClFl单株自交，获得各自的BC1F2分离群体；
[0038]由于1/3的BClFl正常性状的单株基因型为AaBb，那么其自交产生的BC1F2分离群体与Fl相同，有9种基因型，正常性状和突变性状的分离比表现为15:1 ;
[0039]另有1/3的BClFl单株基因型为Aabb，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3:1;由于正常性状和突变性状的分离只与A的基因型的分离相关，含有A为正常性状，不含A则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于A基因分离的群体，用分子标记对A基因进行定位；
[0040]剩余1/3的BClFl单株基因型为aaBb，，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3:1;由于正常性状和突变性状的分离只与B的基因型的分离相关，含有B为正常性状，不含B则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于B基因分离的群体，可以用分子标记对B基因进行定位；
[0041]实施例2
[0042]一种利用上述的方法定位控制普通烟草茎杆颜色的两个非等位基因，具体的步骤如下:
[0043]I)正常中烟100的茎杆基部呈绿色，突变体的茎杆基部呈白色，用突变体和一个茎杆为绿色的烟草品种红花大金元杂交，获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体，Fl同时用红花大金元回交获得BClFl分离群体。对F2和BClFl群体中茎杆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现绿白分离比分别符合15:1和3:1，这表明白色茎杆性状受2个隐性基因控制，我们分别将其命名为c和d，那么它们对应的显性基因分别为C和D ;
[0044]表1步骤I中F2及BClFl分离群体的表型统计
[0045]
【权利要求】
1.一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因的方法，其特征在于具体的步骤如下: 1)选取具有某一性状的植株，假定该性状受2个非等位基因A和B控制，A和B突变后该性状变为突变性状，那么野生型的基因型为AABB，表现为正常性状，而突变体的基因型为aabb，表现为突变性状； 2)将野生型和突变体杂交获得Fl，Fl的基因型为AaBb，表现同野生型，为正常性状； 3)Fl自交后获得F2分离群体，共有9种基因型AABB、AABb, AAbb, AaBB, AaBb, Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群体的正常性状和突变性状的分离比表现为15:1 ； 4)将Fl用突变体回交，产生的BClFl分离群体共有4种基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BC lFl群体的正常性状和突变性状分离比表现为3:1; 5)取若干正常性状的BClFl单株自交，获得各自的BC1F2分离群体； 由于1/3的BClFl正常性状的单株基因型为AaBb，那么其自交产生的BC1F2分离群体与Fl相同，有9种基因型，正常性状和突变性状的分离比表现为15:1 ; 另有1/3的BClFl绿色单株基因型为Aabb，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3:I ;由于正常性状和突变性状的分离只与A的基因型的分离相关，含有A为正常性状，不含A则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于A基因分离的群体，用分子标记对A基因进行定位； 剩余1/3的BClFl绿色单株基因型为aaBb，，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3:1 ；由于正常性状和突变性状的分离只与B的基因型的分离相关，含有B为正常性状，不含B则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于B基因分离的群体，可以用分子标记对B基因进行定位。
2.一种利用权利要求1所述的方法定位控制普通烟草茎杆颜色的两个非等位基因，其特征在于具体的步骤如下: 1)正常中烟100的茎杆基部呈绿色，突变体的茎杆基部呈白色，用突变体和一个茎杆为绿色的烟草品种红花大金元杂交，获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体，Fl同时用红花大金元回交获得BClFl分离群体。对F2和BClFl群体中茎杆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现绿白分离比分别符合15:1和3:1，这表明白色茎杆性状受2个隐性基因控制，我们分别将其命名为c和d，那么它们对应的显性基因分别为C和D ; 2)从步骤I中的BClFl分离群体中选取了9株茎杆绿色的单株自交，获得各自的BC1F2分离群体，分别编号为1-9号；对这些群体中茎杆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现1-4号的4个群体的绿白分离比符合15:1，而另外5-9号的5个群体的绿白分离比符合3:1，这表明第5个群体对应的上一代BClFl单株的基因型为Ccdd或ccDd，可以用来对c基因或d基因进行定位； 3)采用烟草SSR分子标记进行基因定位 根据普通烟草SSR标记连锁图M，选取1376对SSR引物对突变体和红花大金元的基因组DNA进行PCR，PCR产物经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，共获得183对在突变体和红花大金元之间有多态性的引物，用这些引物对第5号BC1F2群体的10个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA进行扩增和电泳检测，发现第5连锁群上的引物PT61414在10个白色茎杆单株，即隐性单株中只有2个单株发生交换，而在10个绿色茎杆单株中没有观察到交换，我们进一步用该引物检测了第5号群体中剩余的41个隐性单株，最终从51个隐性单株中共发现6个交换单株，这表明该引物与第5号群体中的控制基因连锁，我们假定该基因为c ； 4)采用与步骤3相同的方法，提取第6-9号BC1F2群体中各10个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA，用PT61414进行检测，发现该引物与第6、7号群体中的控制基因连锁，但不与第8、9号群体中的控制基因连锁，这样第5-7号群体对应的上一代BClFl单株的基因型为Ccdd，而第8、9号群体对应的上一代BClFl单株的基因型应为ccDd ； 用183对多态性SSR引物对第8号群体的11个绿色茎杆单株和10个白色茎杆单株的基因组DNA进行扩增和电泳检测，发现第24连锁群上的引物PT53716在10个白色茎杆单株，只有3个单株发生交换，而在11个绿色茎杆单株中没有观察到交换，我们进一步用该引物检测了该群体中剩余的38个隐性单株，最终从48个隐性单株中共发现4个交换单株，这表明该引物与d基因连锁；这样，我们分别定位了控制普通烟草白色茎杆性状的2个非等位基因，它们分别位于普通烟草第5和24SSR标记连锁群上。
3.根据权利要求1所述的定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法，其特征在于该方法用于定位植物中控制同一性状的两个非等位基因。
4.根据权利要求3所述的定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法，其特征在于所述植物为异源四倍体植物。
5.根据权利要求4所述的定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法，其特征在于所述的异源四倍体植物为普通烟草、甘蓝型油菜、硬粒小麦。
【文档编号】C12Q1/68GK103947538SQ201410173939
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】刘贯山, 吴清章, 吴新儒, 蒋彩虹, 张雪峰, 孙玉合, 王元英 申请人:中国农业科学院烟草研究所