本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻叶色调控相关基因oswsl6及其编码蛋白质和应用。
背景技术：
水稻是是世界上重要的粮食作物之一，全球有超过一半的人口以水稻为主食。在我国，有超过60％的人以水稻为主食，是重要的粮食作物。因此，水稻的高产稳产对我国粮食安全具有重要意义。叶片是植物进行光合作用的主要器官,水稻产量的95％来自于叶片的光合作用,而光合作用的高效依赖于叶绿素的合成和叶绿体的正常发育。叶色是叶绿体中各种色素的综合表现,正常水稻叶片中叶绿素占优势,通常表现为绿色。叶色突变体的特点是叶片颜色发生了变化，而这些叶色变化大多都发生在苗期，根据苗期的叶色不同叶色突变体分为：转绿型(virescent)、条纹(stripe)、白化(albino)、黄化(chlorina)、斑马纹(zebra)和黄色斑点(yellowvariegated)等6种类型。叶色变异是水稻中突变频率较高且容易鉴定的突变性状，突变基因往往是直接或者间接影响到叶绿素的合成以及降解,改变叶绿素含量,所以叶色突变体也称为叶绿素突变，因此也有人把叶色突变体分为4种类型：缺叶绿素型，缺叶绿素a型，缺叶绿素b型和叶绿素增加型。已报道的叶色突变体有很多和温度相关，依据对温度的响应不同，把叶色突变体分为：高温诱导型，低温诱导型和温钝型。叶色突变体表型易于发现，突变基因大多直接或间接影响到叶绿素的合成或降解。叶色突变体大多都表现为叶绿素含量下降，光合效率变低，作物产量降低。随着近年来功能基因组学以及基因设计育种的发展，叶色突变体的利用价值越来越受到关注，现已经广泛应用于基础研究和生产实践。技术实现要素：本发明的目的在于公开一种水稻叶色调控相关基因oswsl6及其编码蛋白质和应用。本发明提供基因oswsl6，为如下1)或2)或3)或4)所述的dna分子：1)seqidno.1所示的dna分子；2)seqidno.2所示的dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的dna序列杂交且编码所述蛋白的dna分子；4)与1)或2)或3)限定的dna序列具有90％以上同源性，且编码植物叶色调控相关蛋白的dna分子。序列表中的seqidno.1，由2994个核苷酸组成。本发明还提供了一种上述基因oswsl6编码的蛋白质。具体的，本发明提供的蛋白质，选自如(a)或(b)所示的任一种：(a)由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将seqidno.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与叶色调控相关的由seqidno.3衍生的蛋白质。序列表中的seqidno.3，由423个氨基酸组成。本发明还提供了含有所述基因oswsl6的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组过表达载体可为在限制性内切酶xbai和bamhi双酶切载体pcambia1305.1-gfp的重组位点插入所述基因(oswsl6)得到的重组质粒。将含有oswsl6的pcambia1305.1-gfp命名为pcambia1305.1-gfp-oswsl6。含有以上任一所述基因(oswsl6)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因(oswsl6)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选primer1/primer2、primer3/primer4。在精细定位此基因过程中涉及到的定位引物(见表1)，indel引物为本实验需要而自行设计的引物，这些自行设计的引物也属于本发明的保护范围。本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育水稻叶色正常的转基因植物中的应用。本发明还提供了一种培育叶色正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入叶色异常植物中，得到叶色正常的转基因植物。具体的，可以将所述基因通过所述重组表达载体导入叶色异常的植物中。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。有益效果：本发明通过图位克隆技术从水稻叶色突变体中克隆到控制水稻叶色的基因oswsl6功能互补实验证明oswsl6是控制水稻叶色的基因。叶片透射电镜观察证明本发明克隆的基因可以影响叶绿体发育，进而调控叶片的颜色。因此可利用该基因调控水稻叶绿体发育，提高光合作用效率，增加水稻产量。除此之外该基因突变体遗传稳定，可以作为标记用于生产实践中。附图说明：图1为野生型nip与突变体wsl6的叶色表型。图2为野生型nip与突变体wsl6的叶绿素含量测定。图3为野生型nip与突变体wsl6叶绿体透射电镜观察。图4为oswsl6在水稻第5染色体上的精细定位。图5为突变体中wsl6基因的大片段插入位点。图6为转pcambia1305.1-gfp-oswsl6的t0代植株的表型。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、水稻淀粉合成相关位点及其编码基因的发现一、水稻叶色突变体wsl6的表型及遗传分析在组织培养产生的叶色突变体中，筛选出一个叶色白化突变体，命名为wsl6。与nipponbare(nip)比较，wsl6的主要特征是：幼苗呈现出白化叶色的表型(见图1)，同时叶片中叶绿素含量下降(见图2)。nip的幼苗呈现绿色，wsl6幼苗呈现白色。这说明基因突变影响了幼苗中叶绿素的含量，导致出现了叶片白化的表型。对野生型和突变体wsl6幼苗进行了透射电镜观察(见图3)，可以看出，野生型的叶绿体形态正常，结构完整，类囊体膜堆叠形成致密的基粒，而表现为白化的幼苗叶绿体中观察不到类囊体片层结构的存在，同时出现了大量的空泡结构。二、突变基因位点的图位克隆1、突变基因的定位首先，配制了突变体wsl6和另一野生型n22的杂交组合f1，自交一代后获得了f2种子。将f2种子种下，以苗期白化叶片为标准筛选10株极端个体进行连锁将目的基因确定在水稻第5染色体上，利用实验室的公用引物，增加极端个体数量至46株，缩小定位区段至10cm，完成初定位。f2中共获得580株隐性极端个体的叶片，利用公用引物与自己设计的引物，最终将目的基因确定在标记5y-34和5y-37之间，区段大小52kb(图4)。上述ssr标记分析的方法如下所述：(1)提取上述选取单株的总dna作为模板，具体方法如下：①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0mleppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型geno/grinder仪器上粉碎样品1min。②加入660μl提取液(含100mmtris-hcl(ph8.0)，20mmedta(ph8.0)，1.4mnacl,0.2g/mlctab的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。③加入40μl20％sds，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。④加入100μl5mnacl，温和混匀。⑤加入100μl10×ctab，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。⑦转移上清液至1.5mleppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。⑨加入100μl1×te(121gtris溶于1l水中，用盐酸调ph值至8.0得到的溶液)溶解dna。⑩取2μl电泳检测dna质量，并用du800分光光度仪测定浓度(beckmaninstrumentinc.u.s.a)。(2)将上述提取的dna稀释成约20ng/μl，作为模板进行pcr扩增；pcr反应体系(10μl)：dna(20ng/μl)1μl，上游引物(2pmol/μl)1μl，下游引物(2pmol/μl)1μl，10×buffer(mgcl2free)1μl，dntp(10mm)0.2μl，mgcl2(25mm)0.6μl，rtaq(5u/μl)0.1μl，ddh2o5.1μl，共10μl。pcr反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。pcr反应在abiveriti96孔pcr仪中进行。(3)ssr标记的pcr产物检测扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的dnaladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。上述引物开发过程如下：(1)ssr标记开发将公共图谱的ssr标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的bac/pac克隆序列。用ssrhunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或ssrit在线软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索克隆中潜在的ssr序列(重复次数≥6)；将这些ssr及其邻近400～500bp的序列在ncbi通过blast程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的ssr重复次数有差异，初步推断该ssr引物的pcr产物在籼、粳间存在多态性；再利用primerpremier5.0软件设计ssr引物，并由上海英骏生物技术有限公司合成。将自行设计的ssr成对引物等比例混合，检测其在n22和nipponbare之间的多态性，表现多态者用作精细定位的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。表1用于精细定位的分子标记引物名称上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’)new5-34cgcctgcaaaaaaggtagaggatcaaaggaacccccgtagindel5-13tgagtttccggtgttccataaaggcaaagtcgttcagctt5y-26aaaacctgcgaccgaataaggccaagggcttagttg5y-29cgatgggctggaatagggcacggcggcttacaagag5y-34tcctcctccacaatccatccggtttcggctgcttccact5y-37attattgcacatggatgcatggaccttaagtgtacagagb-10accttccacatacgagtttggttcaccatacttttcttcgb-11gtaggacgaggagtgtgatcctggctaacacaagaacatc2、叶色基因的获得经过对52kb区间内的测序，发现了oswsl6基因第三个外显子中存在一个3655bp片段的插入(图5)。根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：primer1：5'atggagctaggcctcgcgct3'(seqidno.4)；primer2：5'tcatagtgcttgaatctccc3'(seqidno.5)。以primer1和primer2为引物，以nip的幼苗提取的cdna为模板，进行pcr扩增获得目的基因。扩增反应在abiveriti96孔pcr仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将pcr产物回收纯化后连接到peasy-blunt(北京全式金生物技术公司)上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(北京tiangen公司cb101)，挑选阳性克隆后，进行测序。序列测定结果表明，pcr反应获得的片段具有seqidno.2所示的核苷酸序列，编码423个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的seqidno.3)。将seqidno.3所示的蛋白命名为oswsl6，将seqidno.3所示的蛋白的编码基因命名oswsl6。实施例2、转基因植物的获得和鉴定一、重组表达载体构建以nip的cdna为模板，进行pcr扩增获得oswsl6基因，pcr引物序列如下：primer3：5'cggagctagctctagaatggagctaggcctcgcgct3'(seqidno.6)；primer4：5'tgctcaccatggatcctagtgcttgaatctcccctc3'(seqidno.7)。上述引物位于seqidno.2所示基因的5'和3'端，将pcr产物回收纯化。采用infusion重组试剂盒(日本takara公司)将pcr产物克隆到载体pcambia1305.1-gfp中。infusion重组反应体系(10μl)：pcr产物1.0μl，pcambia1305.1-gfp6.0μl，5×infusionbuffer2.0μl，infusionenzymemix1μl。短暂离心后将混合体系37℃水浴15分钟，而后50℃水浴15分钟，取2.5μl反应体系用热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(北京tiangen公司；cb101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/l卡那霉素的lb固体培养基上。37℃培养16h后，挑取阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有seqidno.1所示基因的重组表达载体，将含有oswsl6的pcambia1305.1-gfp命名为pcambia1305.1-gfp-oswsl6，oswsl6基因片段利用infusion重组试剂盒(日本takara公司)插入到该载体的xbai和bamhi酶切位点之间。二、重组农杆菌的获得用冻融法将pcambia1305.1-gfp-oswsl6转化农杆菌eha105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行pcr及酶切鉴定。将pcr及酶切鉴定正确的重组菌株命名为eh-pcambia1305.1-gfp-oswsl6。用pcambia1305.1-gfp作为对照载体转化农杆菌eha105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。三、转基因植物的获得分别将eh-pcambia1305.1-gfp-oswsl6和转空载体对照菌株转化水稻叶色突变体wsl6，具体方法为：(1)28℃培养eh-pcambia1305.1-gfp-oswsl6(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到n6液体培养基(sigma公司，c1416)中至浓度为od600≈0.5，获得菌液；(2)将培养至一个月的wsl6水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(n6固体共培养培养基，sigma公司)中，24℃共培养3天；(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/l潮霉素的n6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/l潮霉素的n6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/l潮霉素的n6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的t0代阳性植株。四、转基因植株的鉴定1、pcr分子鉴定本研究中利用潮霉素标记鉴定转基因植株。标记分析的pcr反应体系：dna(20ng/μl)2μl，primer3(10pmol/μl)2μl，primer4(10pmol/μl)2μl，10xbuffer(mgcl2free)2μl，dntp(10mm)0.4μl，mgcl2(25mm)1.2μl，rtaq(5u/μl)0.4μl，ddh2o10μl，总体积20μl。扩增反应在abiveriti96孔pcr仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。pcr产物纯化回收，按试剂盒(北京tiangen公司)步骤进行。用8％的非变性page胶分离，银染。确定转基因阳性植株。2、表型鉴定t0代转基因植株中，转pcambia1305.1-gfp-oswsl6阳性植株表现出正常植株的绿色叶片表型、转空pcambia1305.1-gfp载体的对照植株仍表现为白化的叶片表型(图6)。因此证明wsl6中的突变表型是由oswsl6的突变造成的。pcambia1305.1-gfp-oswsl6可以使wsl6株系的叶色恢复至正常水平。序列表<110>南京农业大学<120>一种水稻叶色调控相关基因oswsl6及其编码蛋白质和应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2994<212>dna<213>稻属水稻(oryzasativavar.nipponbare)<400>1tttattgggccggcccaagagaagaaaaacgagtggcaaataggcggtatcatctcgcat60ttcactatttgccactcgtgtgtctatgacatgtgggcccgggacccacatgtcataatc120cctcttatccccttctgctgcggcgagccacactcccaagccgaggagctctcgcttgcg180acagccatggagctaggcctcgcgctgcggctcgtcgcgccgccgcctcgtctcccctgt240agagctctccagccgccgccgatgccttgtttctctccgtgtgcggcccgaagaagccgc300atccgctcctcgaggttggagcgcagggttggggttgttgtatccggtgggagtatggct360tccttggcaatggaggaggaggaagaggaagagtgggaagaagcggaggaagaagcggaa420ggatggcaagaggaggaggctgcagtggtgacgacgaggccgcgtctggagctcatcgag480aagccggaccggagcctgtgtctgctcgacgagtacgagtcggaggagctaggcacctct540cattgtgccaaccaccgcagcggtgaggcttctagcttctgtgaaattcacctcttcatt600tcgattctgaaataacagcctttttagtttatgatctccaaatgaaactattctgcagat660gaatattttttcatgttgttgtaatattgatataccatgtgtttgcacaggttatgttgc720tgtattaggaaagccaaatgttggaaagagcaccctaattaaccaaattgttggtcagaa780actttcaattgtgacagacaaaccgcaaaccacacggcatcgcattcttggtatatgttc840tgaaccagaataccaggtatcaccttttagtttctaaagctttaggattatagactatga900aagggggaaatgttaatttctcactgctaatctgagttatcatttagtttgcagataata960ctttatgacacgccaggtgtcatcaaaaaggaaatgcataagctagacacaatgatgatg1020aagaatgttaggagtgccgttggcagtgcagattgtgtgcttgttgttgttgatgcttgc1080aaaatgcctgaaaaggtattgcaacataggaaagagatgactgaattatgaaaaaaaaat1140tattatgccaatatacaatctaaaattctgacatttgtaccttttagattgatgaaatac1200tggaagaaggtgtggggaacaaagatactgagcttccagtactgttggtattaaacaaga1260aagatctcataaagccaggagaaattgcaaagaaacttgaggtaaaatatcgttacaaaa1320atttggagatggttttgtttttccctctacttcgatgtaattgatttactggctacgatt1380ttcacagtggtatcaaaaattcactaatgctgatgacgtcatacctataagtgctaaatt1440tgggcatggagtggatgatatcaaggagtggatattatcaaagctccctctggggcctgc1500ttactatccaaaggtattggtgtattagatgaatttttttttcttattctatttctgcaa1560gtgtttcttcatctttggcacaaatttttctgtactcatgtaaaaccagatagccatagt1620gtgactataatatgtcttttccatagcatcatgtttgttctttagatagtgctactcacg1680atatccagtgcttgctttgatgtttaactgcagccaataaatactgatactacaagatat1740caaatatatttgttcatgtgattctcgttccaggacatagctagtgagcaccctgagaga1800ttttttgtgggggaaatagtgagagaaaagatttttcttcagtatcgtcaagaaattcca1860tatgcttgtcaggtatatcttctggtgcttgcacctatcaattttgtgcggcatttttct1920gccagcatgtgtcagatgtgcgactttgtttatgacaggttaatgtcataagttacaaga1980gcagacctacagccaaggattttattcaagttgagatactcgttgagaaggaatcacaaa2040gaagcattatacttgggaaggtaaaaaaaatagtaaaacagtacctttgtgcgcctgaat2100atttcaggattttatggttacgaaatcagttaagtttaatctttttcaagttaacattga2160gtatagctaaggaaaataccataacttggggtgcatatttgggtagaatgaagcagtttc2220atgaaatcatcttatttgcattgctttagtgggatatatttttgtaacatgtttggcaac2280tgcaggatggaa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